王強(qiáng) 王慶勝 魯鵬程 成映霞 李蘭珍 段云燕 段永強(qiáng) 杜娟 劉雪松

摘要：目的 觀察香砂六君子湯對(duì)脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎（CAG）大鼠胃竇黏膜組織白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10及熱休克蛋白70（HSP70）基因及蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法 受試大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和造模組，采用綜合法復(fù)制脾胃虛弱型CAG動(dòng)物模型，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和香砂六君子湯高、中、低劑量組?？瞻捉M和模型組大鼠予10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，香砂六君子湯高、中、低劑量組分別予24、12、6 g/（kg·d）香砂六君子湯藥劑灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組予0.30 g/（kg·d）維霉素藥劑灌胃，連續(xù)120 d。檢測(cè)各組大鼠胃竇黏膜組織IL-6、IL-10含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃竇黏膜組織IL-6、IL-10和HSP70 mRNA表達(dá)，蛋白免疫印跡法檢測(cè)HSP70蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠一般生存狀況較差，大鼠胃竇黏膜組織IL-6 mRNA表達(dá)、IL-6含量顯著升高（P<0.05，P<0.01），IL-10 mRNA表達(dá)、IL-10含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），HSP70基因和蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，香砂六君子湯高劑量組大鼠一般生存狀況明顯改善，大鼠胃竇黏膜組織IL-6 mRNA表達(dá)、IL-6含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），IL-10 mRNA表達(dá)、IL-10含量顯著升高（P<0.05），香砂六君子湯高、中劑量組HSP70基因和蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 香砂六君子湯對(duì)脾胃虛弱型CAG大鼠胃竇黏模具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：香砂六君子湯；萎縮性胃炎；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-10；熱休克蛋白70；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.015

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0062-05

Abstract： Objective To observe the effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on levels and mRNA of IL-6， IL-10 and protein expression of HSP70 of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） rats with spleen-stomach deficiency； To discuss its mechanism. Methods Rats were divided into 2 groups through random number table： normal group and model group. The model of CAG rat with spleen-stomach deficiency type was induced by synthetic methods. After successful modeling， rats were divided into model group， positive control group， XSLJZ high-， medium-， low-dose group. Rats in normal and model group received distilled water 10 mL/（kg·d） for gavage； XSLJZ high-， medium-， low-dose group received XSLJZ 24， 12， 6 g/（kg·d）， respectively； positive control group received mycin 0.30 g/（kg·d） for gavage for 120 consecutive days. Generally living conditions， levels and mRNA of IL-6， IL-10 and protein expression of HSP70 in gastric mucosa tissue were detected by protein immunoblotting. Results Compared with the normal group， generally living conditions of rats in the model group were poor； mRNA and the content of IL-6 increased significantly， and mRNA and the content of IL-10 decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； mRNA and protein expression of HSP70 in gastric tissues was much lower than that of normal group （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， generally living conditions of rats in the XSLJZ high-dose groups were improved significantly； mRNA and the content of IL-6 decreased significantly， and mRNA and the content of IL-10 increased significantly （P<0.05）； XSLJZ high-， medium-dose groups mRNA and protein expression of HSP70 in gastric tissues increased significantly （P<0.05）. Conclusion XSLJZ has protective effects on gastric mucosa of CAG rats with spleen-stomach deficiency.

Key words： Xiangsha Liujunzi Decoction； atrophic gastritis； IL-6； IL-10； HSP70； rats

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是消化系統(tǒng)多發(fā)疾病，病理表現(xiàn)為胃黏膜固有腺體萎縮、腺體細(xì)胞數(shù)量減少且伴有功能喪失，嚴(yán)重者伴有慢性持續(xù)性炎性反應(yīng)以及腸上皮化生和不典型增生。中醫(yī)認(rèn)為，CAG多以脾胃虛弱，氣機(jī)（或氣血）失調(diào)為主要病機(jī)，故治療多以健脾益氣、理氣和胃為大法。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，是防治脾胃虛弱型CAG的有效復(fù)方。臨床研究表明，運(yùn)用香砂六君子湯及其加減方治療CAG療效顯著[1-2]。本實(shí)驗(yàn)觀察香砂六君子湯對(duì)脾胃虛弱型CAG大鼠一般生存狀況，胃竇黏膜組織白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10分泌水平，熱休克蛋白70（HSP70）基因及蛋白表達(dá)的影響，探討該復(fù)方防治CAG的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康Wistar大鼠54只，SPF級(jí)，2月齡，體質(zhì)量（160±10）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（甘）2011-0001-0001010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫（23±2）℃、濕度45%～55%，自由飲水進(jìn)食。

1.2 藥物及制備

香砂六君子湯以人參、白術(shù)、茯苓、陳皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制，飲片均購(gòu)自蘭州復(fù)興厚中藥材有限責(zé)任公司，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥生藥學(xué)教研室楊扶德教授鑒定合格，加10倍量蒸餾水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液加熱濃縮至每1 mL藥液含原藥材2 g，冷卻后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)稀釋至所需濃度；維酶素片，新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，0.2 g/片，批號(hào)20140108。

1.3 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；吲哚美辛腸溶片，上海信誼黃河制藥有限公司；氨水，白銀良友化學(xué)試劑有限公司；乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；IL-6、IL-10，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；β-actin、HSP70引物，寶生物工程（大連）有限公司；Trizol試劑，Promega Corporation；反轉(zhuǎn)錄及Real Time qPCR試劑盒，Promega Corporation；辣根酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG（H+L），北京中杉金橋生物科技有限公司；一抗HSP70，美國(guó)abcam公司。XYJ80-2離心機(jī)，廣東塘廈駿越機(jī)電設(shè)備廠；DF110型電子分析天平，江蘇常熟衡器工業(yè)公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；S1000TM反轉(zhuǎn)錄儀、Benchmark Plus酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、CFX96TM Optics Module PCR儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測(cè)定儀、Chemi DOC XRS凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司；BX51/BX52型顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模和分組

除空白組8只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余46只大鼠參照文獻(xiàn)[3]方法造模。待綜合法造模30周后，每隔1周隨機(jī)抽檢大鼠，取胃黏膜組織做病理檢查并判定胃黏膜萎縮病理變化，評(píng)價(jià)CAG模型大鼠胃黏膜萎縮病理形成后開(kāi)始治療。將CAG大鼠按體質(zhì)量編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和香砂六君子湯高、中、低劑量組（中藥高、中、低劑量組），每組8只。

2.2 給藥

中藥高、中、低劑量組分別予24、12、6 g/kg香砂六君子湯藥劑灌胃（等效劑量相當(dāng)于60 kg成人劑量的12、6、3倍），陽(yáng)性對(duì)照組予0.30 g/kg維酶素灌胃（相當(dāng)于60 kg成人劑量的6倍），等效劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算[4]?？瞻捉M和模型組予等量蒸餾水灌胃。每日給藥體積均為10 mL/mg，連續(xù)120 d。

2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)

各組大鼠于末次給藥后禁食不禁水24 h，烏拉坦（1 g/kg）麻醉后全部殺檢。胃竇黏膜組織勻漿制備：受試大鼠麻醉處死后低溫條件下快速剖取胃竇黏膜組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液，置于4 ℃冰箱保存，胃黏膜組織IL-6、IL-10含量測(cè)定按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃竇黏膜組織白細(xì)胞介素-6、10基因表達(dá)

胃竇組織總RNA制備：稱取大鼠胃竇黏膜組織50 mg并置于研缽中，加1 mL Trizol研磨均勻后冰上靜置5 min，4 ℃、12 000×g離心5 min；移入離心管，冰上孵育5 min，加0.2 mL氯仿震蕩，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液，移至離心管并加0.5 mL異丙醇震蕩，冰上孵育10 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，棄上清液保留RNA沉淀物，向沉淀物中加75%乙醇1 mL，震蕩后4 ℃、8000×g離心10 min，再棄上清液后室溫靜置干燥，加50 μL DEPC處理水溶解RNA。其OD260/OD280均在1.8～2.0之間，經(jīng)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)符合純度要求。反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA：于0.5 mL去酶管中加入總RNA 5 μg、Random Primer 1 μL、15×Oligo dT 1 μL，再加Nuclease-Free Water至10 μL；于70 ℃變性5 min后冰上靜置5 min，再按步驟加入反轉(zhuǎn)錄各試劑，反應(yīng)混合物總體積為20 μL，短暫離心后25 ℃溫浴5 min，42 ℃反應(yīng)60 min，再于70 ℃、15 min滅活處理，所得單鏈cDNA放置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)：從NCBI基因庫(kù)中查尋目標(biāo)基因ID及序列，由TAKARA公司寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)和合成目標(biāo)基因引物。IL-6引物序列上游5'-ATTTATGAACAGCGATGATGCAC-3'，下游5'-CC AGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp；IL-10引物序列上游5'-CAAAGCCACAAA GCAG-3'，下游5'-AGGAGTCGGTTAGCAGTA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為248 bp；HSP70引物序列上游5'-CAG TTGGAGCAGCAGCAAAGA-3'，下游5'-TGAGAA TGCACGCCCATGA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100 bp；β-actin引物序列上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGC TCCTA-3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC TG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以β-actin為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設(shè)3個(gè)復(fù)孔、6次平行實(shí)驗(yàn)，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值。反應(yīng)體系據(jù)GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循環(huán)40次，終末延伸65 ℃、5 s。連續(xù)檢測(cè)熒光并記錄擴(kuò)增曲線，采用樣點(diǎn)擬合法分析得到各目的基因和β-actin的Ct值。測(cè)Ct值并分析融解曲線，以β-actin為內(nèi)參，采用比較Ct值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：ΔΔCt=（測(cè)試組目的基因Ct值-測(cè)試組內(nèi)參基因Ct值）-（對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值），以2-ΔΔCt表示相對(duì)表達(dá)量。

2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)胃竇黏膜組織熱休克蛋白70蛋白表達(dá)

按蛋白提取試劑盒提取組織蛋白后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，以20 μg/道上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白封閉后分別加入一抗。GAPDH一抗溶液配制（1∶700）：牛奶封閉液7 mL，GAPDH一抗10 μL；HSP70一抗溶液配制（1∶1000）：封閉液1 mL，HSP70一抗1 μL。4 ℃搖床過(guò)夜，洗滌后加入HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗。辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠（1∶7000）；二抗溶液配制：山羊抗小鼠二抗2 μL，牛奶封閉液14 mL。室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，暗室曝光顯影后用Bio-RAD Quantity one 圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間樣本均數(shù)差異比較采用F檢驗(yàn)，在F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再行q檢驗(yàn)兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大鼠一般生存狀況

空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏，活動(dòng)及攝食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。CAG模型1/2數(shù)量大鼠第6周即開(kāi)始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯，攝食量減少；第8周后出現(xiàn)少食怠動(dòng)、消瘦，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍的病理表現(xiàn)，尤其隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠生存能力明顯下降，表現(xiàn)為怠動(dòng)少食、消瘦弓背，毛發(fā)枯槁疏散，3/4數(shù)量大鼠攝食量明顯減少，容易出現(xiàn)瞇眼蜷縮，反應(yīng)遲鈍，平均每日體質(zhì)量增加量和攝食量明顯下降。經(jīng)藥物干預(yù)后，中藥各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠治療第10周開(kāi)始上述癥狀逐漸減輕或消失，表現(xiàn)為反應(yīng)較為靈敏，被毛疏散但有光澤，活動(dòng)及飲食量正常，平均每日體質(zhì)量增加量和攝食量恢復(fù)接近正常，尤其以中藥高劑量組大鼠一般生存狀況恢復(fù)明顯。

4.2 香砂六君子湯對(duì)模型大鼠胃竇黏膜組織白細(xì)胞介素-6、10基因表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇黏膜組織IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高、IL-10 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃竇黏膜組織IL-6 mRNA表達(dá)顯著降低、IL-10 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.3 香砂六君子湯對(duì)模型大鼠胃竇黏膜組織白細(xì)胞介素-6、10含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇黏膜組織IL-6含量顯著升高、IL-10含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃竇黏膜組織IL-6含量顯著降低、IL-10含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

4.4 香砂六君子湯對(duì)模型大鼠胃竇黏膜組織熱休克蛋白70基因和蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇黏膜組織HSP70基因和蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，中藥高、中劑量組大鼠胃竇黏膜組織HSP70基因和蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

5 討論

根據(jù)CAG臨床表現(xiàn)如納呆少食、運(yùn)化遲滯、胃脘脹痛、形體逐漸消瘦等，其歸屬于中醫(yī)學(xué)“痞滿”“胃痞”范疇。香砂六君子湯是治療因脾胃虛弱，濕濁內(nèi)生，氣機(jī)阻滯而變生“痞滿”的效方，亦是體現(xiàn)“健脾理氣和胃”治法的經(jīng)典方劑。方中人參補(bǔ)中益氣、健脾養(yǎng)胃；白術(shù)健脾燥濕，茯苓健脾滲濕，白術(shù)、茯苓合用，能增強(qiáng)健脾除濕功能，促進(jìn)脾胃運(yùn)化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理氣消痞而止痛；陳皮、半夏燥濕化痰，理氣降逆；甘草調(diào)胃和中，具有補(bǔ)脾和胃、緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用。

在諸多細(xì)胞因子中，IL-6是一種具有多種功能的生物活性多肽物質(zhì)，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、分化，抑制T細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并且參與白細(xì)胞趨化，加速血栓形成，在慢性炎性反應(yīng)的持續(xù)發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，如IL-6誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在局部聚集，引起粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，生成活性氧，造成組織炎癥，而活化的中性粒細(xì)胞又可分泌IL-1、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子，構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，共同參與胃黏膜炎癥損傷；而且有研究顯示，IL-6在多種腫瘤組織中大量存在，構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分[5-6]，并在腫瘤中具有雙重作用，既可通過(guò)免疫途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)，也可通過(guò)抑制抗腫瘤因子及甲基化等方式促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[7-9]。IL-10又名細(xì)胞因子合成抑制因子，是一種抗炎性與免疫抑制性細(xì)胞因子，主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，IL-10可抑制炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如阻斷IL-1β、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子-α、粒細(xì)胞-集落刺激因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)[10]，并可抑制炎性介質(zhì)如一氧化氮的合成以及氧自由基的產(chǎn)生，在穩(wěn)定胃腸道黏膜內(nèi)環(huán)境中起到重要作用[11]。

近年來(lái)，在CAG黏膜損傷機(jī)制中針對(duì)具有細(xì)胞保護(hù)作用的熱休克蛋白研究較多。HSP70是具有細(xì)胞保護(hù)作用的一類蛋白，廣泛存在于真核和原核生物細(xì)胞中，具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)功能。而且HSP70分子具有與ATP較活躍的親和性，HSP70與變性蛋白多肽結(jié)合后，依賴ATP水解釋放出能量來(lái)解開(kāi)多肽鏈的錯(cuò)誤折疊，使其再次成熟為細(xì)胞內(nèi)的正常蛋白，進(jìn)而使細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)[12]，對(duì)維持胃腸黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和減輕炎性反應(yīng)具有重要作用；同時(shí)HSP70又可以作為一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)對(duì)臟器損傷產(chǎn)生自身保護(hù)作用，通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡和抑制炎癥，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體胃黏膜的適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠一般生存狀況較差，胃竇黏膜組織IL-6 mRNA表達(dá)、IL-6含量顯著升高，而IL-10 mRNA表達(dá)和IL-10含量顯著降低，HSP70基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明脾胃虛弱型CAG大鼠胃竇黏膜促炎和抗炎因子平衡失調(diào)，胃黏膜對(duì)炎癥的免疫性和防御功能降低；與模型組比較，中藥各劑量組大鼠一般生存狀況明顯改善，胃竇黏膜組織IL-6 mRNA表達(dá)、IL-6含量顯著降低，IL-10 mRNA表達(dá)和IL-10含量顯著升高，HSP70基因和蛋白表達(dá)顯著升高，說(shuō)明香砂六君子湯可改善脾胃虛弱型CAG大鼠一般生存狀況，并通過(guò)下調(diào)胃竇黏膜IL-6水平、上調(diào)IL-10水平和HSP70的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。

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