劉冬虹　王德蓮　郭燕華　聶炎炎　吳　環(huán)　曾國權(quán)

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院　廣東廣州　511447）

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展

劉冬虹王德蓮*郭燕華聶炎炎吳環(huán)曾國權(quán)

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院廣東廣州511447）

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)是一種可使微量核酸在體外高效快速擴(kuò)增的新技術(shù)。與傳統(tǒng)PCR及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比較，其最顯著的優(yōu)勢是在25℃-43℃條件下，5-20 min內(nèi)觀察到檢測結(jié)果，且操作簡單，設(shè)備成本低廉，被認(rèn)為是一種可以代替PCR的新技術(shù)。本文綜述了重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的原理和特點(diǎn)、檢測方法及近十年來在國內(nèi)外不同領(lǐng)域的應(yīng)用情況，并展望了該技術(shù)在檢測領(lǐng)域中的未來方向。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)；檢測方法；應(yīng)用領(lǐng)域

1　前言

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，簡稱RPA）是由國劍橋Babraham研究院成立的TwistDx生物技術(shù)公司發(fā)明的一種體外核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測新技術(shù)，既可以檢測DNA[1，2]，也可以檢測RNA[3，4]。由于與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)相比較，具有成本低、耗時(shí)短、操作簡單、不受檢測場地限制等優(yōu)點(diǎn)，因此RPA技術(shù)被認(rèn)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)而受到廣泛關(guān)注，成為分子檢測技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。自2006年問世以來，該技術(shù)已取得長足的發(fā)展，并被應(yīng)用在多個(gè)檢測領(lǐng)域。

2　RPA技術(shù)的原理和特點(diǎn)

2.1技術(shù)原理

RPA技術(shù)以T4噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制為原理[2]，利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白在常溫下協(xié)同實(shí)現(xiàn)引物和模板的特異結(jié)合。反應(yīng)體系主要有T4噬菌體編碼的重組酶蛋白u(yù)vsX和uvsY[5]、單鏈結(jié)合蛋白gp32及BsuDNA聚合酶、引物、模板、緩沖液等[2]。

在恒溫下，重組酶蛋白在ATP的參與下與單鏈核酸（引物）結(jié)合形成蛋白-核苷酸復(fù)合物，該復(fù)合物可以在雙鏈DNA（模板）上進(jìn)行雙向掃描，尋找與引物同源的靶序列，一旦找到，重組酶可打開雙鏈DNA，同時(shí)引物與同源序列發(fā)生鏈交換反應(yīng)，在DNA聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA合成反應(yīng)。單鏈結(jié)合蛋白與被引物替換掉的母鏈結(jié)合，防止被進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由一對相對的引物同時(shí)啟動(dòng)和完成一個(gè)合成過程，合成的子代DNA繼續(xù)重復(fù)整個(gè)合成過程，目標(biāo)序列形成指數(shù)式增長，整個(gè)過程進(jìn)行非?？欤话憧稍?0 min內(nèi)獲得可檢出的擴(kuò)增產(chǎn)物[6-9]。

圖1　RPA核酸擴(kuò)增原理簡圖

2.2技術(shù)特點(diǎn)

RPA技術(shù)與其他DNA檢測技術(shù)相比較主要有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

（1）在恒溫條件下進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。與PCR技術(shù)相比較，RPA技術(shù)最大的一個(gè)特點(diǎn)是不需要在較高的溫度循環(huán)下對模板DNA進(jìn)行變性和擴(kuò)增，而只需要在25℃-43℃條件下利用特殊的酶打開模板鏈，完成對核酸的擴(kuò)增。與其他的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10-14]，如鏈替代擴(kuò)增（SDA）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA）、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（HAD）、依賴核酸序列的擴(kuò)增（NASBA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等相比較，SDA、RCA、HAD以及LAMP等均需要在65℃下進(jìn)行退火，且LAMP技術(shù)對擴(kuò)增靶序列的長度最好控制在300 bp以下，對引物的要求高，由在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出的引物有上千條，要篩選出合適的引物需要耗費(fèi)大量工作；NASBA只能用于檢測RNA。除此以外，它們都需要較長的反應(yīng)時(shí)間和特殊的儀器設(shè)備等。

（2）耗時(shí)短。RPA技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)之一就是檢測時(shí)間短，整個(gè)反應(yīng)在5-20 min就可完成檢測，遠(yuǎn)快于其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)或PCR技術(shù)。

（3）操作簡單。RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系（TwistAmp? Basic）含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，僅需加入引物和模板即可反應(yīng)。在這個(gè)基礎(chǔ)體系中加入不同的酶和探針，就可以實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA檢測，如實(shí)時(shí)熒光定量RPA、橫向流動(dòng)試紙條檢測。除此以外，TwistAmp?Basic RT添加了逆轉(zhuǎn)錄酶，可以對RNA模板進(jìn)行一步法擴(kuò)增。

（4）成本低。與傳統(tǒng)的PCR相比較，由于RPA技術(shù)不需要專門的PCR儀等設(shè)備，只需一般的恒溫設(shè)備便可進(jìn)行檢測，大大降低了檢測成本。

（5）不受檢測場地的限制。RPA技術(shù)對檢測設(shè)備要求低，甚至可以利用人體腋窩的溫度對樣品進(jìn)行檢測[15]，且靈敏度高，不需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，特別適合無法進(jìn)行核酸抽提的實(shí)地檢測。而其他的檢測方法均需要核酸抽提。

（6）高靈敏性和特異性。RPA靈敏度高，能夠?qū)⒑哿康暮怂崮０澹?-10拷貝）擴(kuò)增到可以檢出的水平[2，16]；其特異性與實(shí)時(shí)熒光PCR無差異[17]。

3　RPA產(chǎn)物的檢測方法

3.1凝膠電泳檢測

RPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系除了需要添加重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白外，其余體系與PCR相同。RPA擴(kuò)增可以在任何恒溫設(shè)備中進(jìn)行，根據(jù)不同的擴(kuò)增目標(biāo)，選擇合適的溫度，一般在37℃條件下20 min便可得到目的片段。為避免擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳檢測時(shí)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，需要對擴(kuò)增產(chǎn)物采用酚-氯仿抽提后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，在紫外光照射下對目的條帶進(jìn)行檢測。該檢測方法操作簡單，對比需要6-8條引物才能完成擴(kuò)增的LAMP方法，RPA技術(shù)僅需一對引物即可完成擴(kuò)增，且靈敏度不低于LAMP等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[18-20]，因而更加適用于核酸的檢測。目前，該方法已在轉(zhuǎn)基因水稻的檢測中得到應(yīng)用[21]。

3.2實(shí)時(shí)熒光定量RPA

在RPA擴(kuò)增體系中加入一個(gè)熒光標(biāo)記的探針便可實(shí)現(xiàn)模板擴(kuò)增的實(shí)時(shí)檢測，該探針在胸腺嘧啶上分別攜帶一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，中間由一個(gè)四氫呋喃（THF）隔開。當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合時(shí)，核酸外切酶III識別THF堿基位點(diǎn)，將熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，從而使熒光信號與擴(kuò)增產(chǎn)物的累積相同步。使用便攜式熒光檢測儀便可在10-20 min內(nèi)檢測到熒光曲線，其靈敏度可達(dá)到1-10個(gè)拷貝[2，16]。該方法已在疾病防控[3]、食品安全[1]等檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用。

3.3橫向流動(dòng)試紙條（RPA-LFD）檢測

RPA試紙檢測方法結(jié)合了免疫技術(shù)、分子雜交技術(shù)、膠體金技術(shù)及側(cè)向流層析技術(shù)，其原理為生物素標(biāo)記的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可以和FAM標(biāo)記的特異探針雜交。該探針長約50個(gè)堿基，在其5′端標(biāo)記FAM，探針的中間同樣設(shè)計(jì)一個(gè)脫堿基位點(diǎn)，大腸桿菌核酸外切酶nfo可以識別該位點(diǎn)并切開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生自由的羥基端，DNA聚合酶便可在此進(jìn)行延伸；3′端的引物可以用生物素標(biāo)記。最終擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端為FAM標(biāo)記，3′端為生物素標(biāo)記。FAM標(biāo)記的特異探針與抗FAM抗體的金標(biāo)物結(jié)合后，將該免疫復(fù)合物滴加到試紙條上，免疫復(fù)合物通過層析膜擴(kuò)散，擴(kuò)散到檢測線時(shí)，生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的檢測線。不被捕獲的免疫復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散到質(zhì)控線被特異性抗體所捕獲，形成具有顏色的質(zhì)控線。由于該方法特異性好，檢測時(shí)間短，一般5-15 min便可通過肉眼判讀結(jié)果，已在細(xì)菌、病毒、寄生蟲、轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[22-26]。需要注意的是，在用該方法進(jìn)行檢測時(shí)，需要稀釋RPA反應(yīng)的產(chǎn)物。否則，RPA反應(yīng)中的一些物質(zhì)可能會(huì)干擾試紙上的抗體，出現(xiàn)非特異性和假陽性結(jié)果。

4　應(yīng)用領(lǐng)域

作為一種新的核酸檢測技術(shù)，RPA技術(shù)已逐漸用于生命科學(xué)領(lǐng)域。Abd El Wahed等[4]應(yīng)用RTRPA技術(shù)建立了中東呼吸綜合征冠狀病毒的快速檢測方法，該方法操作簡單，高效靈敏，可在3-7 min之內(nèi)檢測到107-101個(gè)拷貝的RNA分子，而傳統(tǒng)的RT-PCR方法則需要2 h。且該方法所使用的便攜式檢測裝置僅重約1 kg。Nahed Yehia等[27]利用RT-RPA方法檢測流感病毒H5N1 HA基因，可在7 min內(nèi)檢測到1個(gè)拷貝的RNA分子，且與實(shí)時(shí)熒光PCR具有同等的高靈敏度和高特異性。RT-RPA方法還被應(yīng)用在植物病毒的檢測中，Tefera[28]等建立了櫻桃小實(shí)病毒的RT-RPA檢測方法，同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)證明了RT-RPA方法與RT-PCR方法具有同樣的高靈敏度。此外，RT-RPA方法還被用于手足口病、登革熱、新生牛腹瀉日冕形病毒、蝦病毒的檢測等。越來越多的研究證明，RT-RPA技術(shù)在病毒的檢測方面顯示了巨大優(yōu)勢，具有巨大潛力。

RPA作為一種常溫的快速DNA擴(kuò)增法，為資源匱乏的地區(qū)提供了檢測結(jié)核?。═B）的簡便工具。研究人員在RPA的基礎(chǔ)上，快速檢測了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTC的DNA（IS6110和IS1081）。在39°C環(huán)境下，RPA檢測能在20 min內(nèi)得出高靈敏度的結(jié)果。進(jìn)一步研究表明，在檢測TB感染者的肺部樣本時(shí)，RPA檢測比熒光顯微鏡檢測還要準(zhǔn)確[29]。

RPA技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域也顯示出了巨大潛力。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所的團(tuán)隊(duì)通過RPA技術(shù)實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測，通過設(shè)計(jì)Camv35S和NOS的RPA引物，對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行篩選和檢測，在15-25 min內(nèi)檢出了含有100拷貝目標(biāo)分子的樣本。此外，他們還建立了實(shí)時(shí)RPA分析體系，成功檢測了4種主要的轉(zhuǎn)基因作物（玉米、水稻、棉花和大豆）[26]。同時(shí)，將RPA技術(shù)與酶聯(lián)免疫相結(jié)合形成的RPA-ELISA方法還用于食品中過敏原性成分、轉(zhuǎn)基因成分、致病菌、真菌的檢測等。

RPA技術(shù)還廣泛的應(yīng)用于惡性瘧原蟲[30]、立克次體、支原體等病原體檢測[31]以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)的檢測[32]等。

5　小結(jié)與展望

RPA 技術(shù)作為一種新的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、操作簡單等獨(dú)特的優(yōu)越性，引起了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。與該技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光定量RPA、RPA-LFD、RPA-ELISA等檢測方法已廣泛應(yīng)用于診斷、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品安全等領(lǐng)域。作為一種新技術(shù)，盡管還存在一些缺點(diǎn)和不足，如引物和探針的長度較PCR技術(shù)的要長，且引物和探針的設(shè)計(jì)和篩選還沒有相關(guān)的軟件可以輔助等。但是它仍然被看做是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)，隨著研究的深入，該技術(shù)也會(huì)不斷成熟，在更多的領(lǐng)域體現(xiàn)它的價(jià)值。

[1]S Santiago-Felipe L A.Recombinase polymerase and enzymelinked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis[J].Anal Chim Acta，2014，811：81-87.

[2]Piepenburg O，Williams C H，Stemple D L，et al.DNA Detction using recombination proteins[J].Plos Bios，2006，4（7）：e204

[3]Abd El Wahed A，El-Deeb A，El-Tholoth M，et al.A portable revers transcription recombinase polymerse amplication assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus[J].Plos one，2013，8（8）：e72624.

[4]Abd El Wahed A，Patel P，Heidenreich D，et al.Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification Assay for the Detection of Middle East Respiratory syndrome coronavirous[J]. Plos Currents outbreaks，2013，12（12）：e8364.

[5]Yonesaki T，Ryo Y，Minagawa T，et al.Purification and some of the functions of the products of bacteriophage T4 recombination genes，uvsX and uvsY[J].Eur J biochem，1985，148（1）：127-134.

[6]Deng H，Gao Z.Bioanalytical applications of isothermal nucleicacid amplification techniques[J].Anal Chim Acta，2015，853：30-45.

[7]Zaghloul H，El-Shahat M.Recombinase polymerase amplification as a promising tool in hepatitis C virus diagnosis[J].World J Hepatol，2014，6（12）：916-922.

[8]Euler M，Wang Y，Heidenreich D，et al.Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents[J].J Clin Microbiol，2013，51（4）：1110-1117.

[9]Harris L D，Griffith J D.Formation of D loops by the UvsX protein of T4 bacteriophage：a comparion of the reaction catalyzed in the presence or absence of gene 32 protein[J].Biochemistry，1988，27（18）：6954-6959.

[10]Wu W，Mao Y P，Zhao S M，et al.Strand displacement amplification for ultrsensitive detection of human pluripotent stem cells[J].Anal Chim Acta，2015，881：124-130.

[11]A Hatch，T Sano，J Misasi，et al.Rolling circle amplification of DNA immobilized on solid surfaces and its application to multiplex mutation detection[J].genetic analysis：biomolecular engineering，1999，15：35-40.

[12]魏曉棠，林超，朱研研，等.解旋恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)在螨蟲鑒定中的應(yīng)用前景[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2014，5（12）：3929-3932.

[13]鐘響，劉寧，尹偉力，等.食品中沙門氏菌的NASBA快速檢測技術(shù)[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（23）：45-47.

[14]趙麗娟，周潔，高誠.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2014，34（2）：162-166.

[15]Li T，Huang S，Dong M，et al.Prognostic impact of SUMO-specific protease 1（SENP1）in prostate cancer patients undergoing radical prostatectomy[J].Urol Oncol，2013，31（8）：1539-1545.

[16]Xia X，Yu Y，Weidmann M，et al.Rapid detection of shrimp white spot syndrome virus by real time，isothermal recombinase polymeraseamplificationassay[J].PlosOne，2014，9（8）：e104667.

[17]H M Amer，A Abd El Wahed.A new apporach for diagnosis of bovine coronavirous using a reverse trancription recombinase polynerse amplication assay[J].Journal of Virological Methods，2013，193（4）：337-340.

[18]David Lee，Maurizio La Mura，Theo R Allnutt，et al.Detection of genetically modified organisms（GMOs）using isothermal amplification of target DNA sequences[J].BMC Biotechnology，2009，9：7.

[19]Niloofar Rostamkhani，Ali Haghnazari，Masoud Tohidfar，et al. Rapid identification of transgenic cotton（Gossypium hirsutum L.）plants by loop-mediated isothermal amplification[J].Genet Plant Breed，2011，47（4）：140-148.

[20]Guy Kiddle，Patrick Hardinge，Neil Buttigieg，et al.GMO detection using a bioluminescent real time reporer（BART）of loop mediated isothermal amplification（LAMP）suitable for field use [J].BMC Biotechnology，2012，12：15.

[21]鄧婷婷，黃文勝，程奇，等.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的Cry1Ab/c基因[J].中國食品學(xué)報(bào)，2015，15（3）：187-193.

[22]Kersting S，Rausch V，Bier F F，et al.Multiplex isothermal solid-phase recombination polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens [J].Mikrochim Acta，2014，181（13-14）：1715-1723.

[23]Boyle D S，McNerney R，Teng L H，et al.Rapid detection of Mycobacerium tuberculosis by recombinase polymerase amplification[J].Plos One，2014，9（8）：e103091.

[24]Teoh B T，Sam S S，Tan K K，et al.Early detection of dengue virus by use of reverse transcription-recombinase polymerase amplification[J].J Clin Microbiol，2015，53（3）：830-837.

[25]Crannell Z A，Cabada M M，Castellanos-Conzalez A，et al.Recombinase polymerase amplification-based assay to diagnose giardia in stool sample[J].Am J Trop Med Hyg，2015，92（3）：583-587.

[26]Xu C，Li L，Jin W，et al.Recombinase polymerase amplification（RPA）of CaMV-35S promoter and nos terminator for rapid detection of genetically modified crops[J].Int J Mol Sci，2014，15（10）：18197-18205.

[27]Nahed Yehid，Abdel-Satar A，Abd El Wahed A，et al.Development of reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for avian influenza H5N1 HA gene detection[J].J Virol Methods，2015，223：45-49.

[28]Terafa A，Mekuria，Shulu Zhang，et al.Rapid and Sensitive detection of little cherry virus 2 using isothermal reverse transcription-recombinase polymerse amplification[J].J Virol Methods，2014，205：24-30.

[29]Boyle D S，Mcnerney R，Teng Low H，et al.Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis by recombinase polymerase amplification[J].PLos One，2014，9（8）：e103091.

[30]Kersting S，Rausch V，Bier F F，et al.Rapid detection of Plasmodiumfalciparumwithisothermalrecombinasepolymerase amplification and lateral flow analysis[J].malar J，2014，13：99.

[31]Chao C-C，Belinskaya T，Zhang Z，et al.Development of Recombinase Polymerase Amplification Assays for Detection Orientia tsutsugamushi or Rickttsia typhi[J].PLos One，2015，9（7）：e0003884.

[32]Jaroenram W，Owens L.Separation of endogenous viral elements from infectious Penaeus styliostris denovirus using recomninase polymerase amplification[J].Mol Cell Probes，2014，28（5-6）：284-287.

Adavances in Recombinase Polymerase Amplification

LIU Donghong，WANG Delian*，GUO Yanhua，NIE Yanyan，WU Huan，ZENG Guoquan
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou，Guangdong，511447）

Recombinase Polymerase Amplification（RPA）is a new kind of technique which can make micro-nucleic acid to be efficiently and rapidly amplified in vitro.Compared with the traditional techniques e.g.，polymerase chain reaction（PCR）and isothermal DNA amplification，RPA can easily observe the test results under the condition of 25℃-43℃in 5 to 20 minutes.Due to its convenient operation and low cost，RPA has been considered as a new technique which can replace PCR.In this review，the principle，characteristic，detection method of RPA，and its application in different fields at home and abroad in the last decade are summarized.The application of RPA in inspection field is also prospected.

Recombinase Polymerase Amplification Techenique；Detection Method；Application Area

Q789

E-mail：1204051393@qq.com；*通訊作者E-mail：dlwang2003@126.com

廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目（2016CZ11）

2016-03-25