寧井銘，張正竹，宛曉春

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036)

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基于氣相色譜技術(shù)的普洱熟茶7572揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜建立及應(yīng)用

寧井銘，張正竹，宛曉春*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036)

普洱熟茶是由毛茶經(jīng)發(fā)酵加工而成，花色品種多，加工企業(yè)對于不同花色品種普洱茶的質(zhì)量控制主要依賴感官審評，缺乏量化的標準。采用氣相色譜技術(shù)，從圖譜的整體性出發(fā)，應(yīng)用系統(tǒng)聚類和主成分分析等方法對色譜圖進行綜合分析，建立了普洱熟茶7572揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)字化指紋圖譜和特征指紋圖譜。結(jié)果表明，利用夾角余弦和重疊率比較不同品種普洱茶氣相色譜相關(guān)系數(shù)，可以實現(xiàn)對7572與7692和7452普洱熟茶鑒別。這為茶產(chǎn)品質(zhì)量控制和鑒別提供一種量化的方法。

氣相色譜；普洱茶；指紋圖譜；鑒別

普洱熟茶是以云南大葉種(Camelliasinensis(Linn) var. assamica (Masters) Kitamura)曬青毛茶為原料經(jīng)特殊發(fā)酵后加工而成的[1]。在發(fā)酵的過程中，曬青毛茶在濕熱、微生物和酶等共同作用下，內(nèi)含成分發(fā)生了酶促氧化、裂解等一系列化學(xué)變化，毛茶中原有的一些揮發(fā)性物質(zhì)組成也發(fā)生了變化，1,2,3-三甲氧基苯(1,2,3-trimethoxy，benzene)和1,2,4-三甲氧基苯(1,2,4-trimethoxy，benzene)等具有陳香味的成分出現(xiàn)，使發(fā)酵后的普洱熟茶具有典型的陳香味。目前，對于普洱熟茶不同花色品種質(zhì)量控制主要采取人工感官審評的方式，感官審評由于受到多種人為因素的影響，具有一定的不確定性，從而導(dǎo)致不同花色品種普洱茶趨向于同質(zhì)化，如何對不同花色品種普洱熟茶產(chǎn)品實現(xiàn)量化的評價，開發(fā)出更多的新產(chǎn)品，是加工企業(yè)面臨的重要問題。

指紋圖譜是指物質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后，在一定的試驗條件下，得到的能夠代表其化學(xué)特征的譜圖[2]，具有整體性特點，目前已在環(huán)境保護、食品評價、中藥質(zhì)量控制和種子等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[3-7]，將指紋圖譜與計算機結(jié)合可用于對藥品的質(zhì)量控制[8-9]。色譜作為一種分離技術(shù)與方法已有百年歷史。近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼開展了利用液相色譜構(gòu)建烏龍茶[10]、綠茶[11-12]指紋圖譜研究。但是利用氣相色譜(gas chromatography,GC)技術(shù)構(gòu)建普洱茶揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜未見相關(guān)報道。

本研究利用氣相色譜檢測茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)，采用氣相色譜技術(shù)從指紋圖譜的整體性出發(fā)，采用多種方法計算指紋圖譜的相似度，通過系統(tǒng)聚類和主成分分析等識別方法和模式，對普洱茶熟茶的揮發(fā)性物質(zhì)色譜進行分析，建立普洱熟茶標志性產(chǎn)品7572揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)字化指紋圖譜。以揮發(fā)性物質(zhì)相似、容易混淆的7692和7452這兩個熟茶產(chǎn)品為比較對象，實現(xiàn)對不同品種普洱熟茶鑒別，為茶葉的量化評價提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用的普洱熟茶由云南省勐海茶業(yè)有限責(zé)任公司提供，共14批，由于普洱熟茶產(chǎn)品規(guī)格較多，本研究選用普洱熟茶的標志性產(chǎn)品7572為研究對象。產(chǎn)品年份及批次詳見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試樣品溶液的制備

揮發(fā)性物質(zhì)的提取采用同時蒸餾萃取(simultaneous distillation and solventextration,SDE)法提取普洱茶中揮發(fā)性成分，取茶樣30.0 g置于1 L圓底燒瓶中，加入400 mL水，同時加入1 mL癸酸乙酯(50 mg/L)作為內(nèi)標；在萃取瓶中加入30 mL乙醚(先重蒸)置于45℃水浴中。裝置連接后，緩慢加熱至燒瓶微沸(一直保持微沸)，回流2 h?；厥找颐讶芤褐屑尤? g無水硫酸鈉，4 ℃冰箱靜置過夜，脫水12 h，用N2將回收乙醚濃縮至1 mL，4 ℃保存?zhèn)溆?，所得香精油用于組分分析。

表1 樣品的規(guī)格及加工時間

注：601表示該產(chǎn)品2006年第一批，加工時間約為2006.1，其他類同。

以順氧化芳樟醇(linalool oxide cis)、反氧化芳樟醇(linalool oxide trans)、芳樟醇(linalool-L)、1,2,3-三甲氧基苯(1,2,3-trimethoxy，benzene)和1,2,4-三甲氧基苯(1,2,4-trimethoxy，benzene)5種標準品進行定性，僅統(tǒng)計匹配度和純度大于800(最大值1 000)的鑒定結(jié)果。采用峰面積歸一化法進行定量，確定不同茶樣中各組分的相對含量。

1.2.2 色譜條件的建立

GC/MS分析在Shimaszu QP 2010氣-質(zhì)聯(lián)用儀上進行，分離柱為30 m × 0.25 mm × 0.25 μm DB-5石英毛細管柱。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，不分流。條件：60 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升溫至200 ℃， 保持4 min，以1 ℃/min 升溫至210 ℃，保持4 min，再在17 min內(nèi)升溫至升溫至270 ℃，保持7 min，進樣口溫度270 ℃，連接口溫度270 ℃。

在200 ℃溫度下運行，電子轟擊源電壓70 eV，色譜掃描范圍從質(zhì)/荷比40至600，每次掃描0.3 s，間隔0.2 s；光電倍增管(PMT)電壓230 V，GC/MS界面溫度280 ℃。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度試驗

取樣品，按1.2.2方法制備供試樣，取樣品溶液連續(xù)5次進樣，研究色譜方法的精密度，所得指紋圖譜的主要色譜峰相對峰面積的相對標準偏差RSD(relative standard deviation)均小1.1%，相對保留時間的RSD均小于1.8%，符合要求。

1.2.3.2 重復(fù)性試驗

取樣品5份，分別按1.2.2方法制備供試樣，取樣品進樣，研究色譜方法的重現(xiàn)性，所得指紋圖譜的主要色譜峰相對峰面積的RSD均小1.0%，相對保留時間的RSD均小于1.6%，符合要求。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取樣品，按1.2.2方法制備供試樣，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，研究色譜方法的穩(wěn)定性。所得指紋圖譜的主要色譜峰相對峰面積的RSD均小1.4%，相對保留時間的RSD均小于1.6%，符合要求。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有測量數(shù)據(jù)進行至少進行3次以上。利用Data Processing System軟件(V9.50 DPS技術(shù)公司，中國)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用Origin 7.5(OriginLab公司)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多元化指紋圖譜建立

普洱熟茶7572在1.2試驗條件下，其色譜峰較容易辨認，以順氧化芳樟醇、反氧化芳樟醇、芳樟醇、1,2,3三甲氧基苯和1,2,4三甲氧基苯5種標準品對其他揮發(fā)性物質(zhì)位置進行確定。對于相同樣品中信息量差異較大的樣品，利用標準品對樣品進行確認。相同保留時間內(nèi)色譜峰的漂移，根據(jù)標準品位置漂移進行定性。本研究中70 min以后的色譜峰較小，無法辨認，選擇70 min以前的色譜峰建立指紋圖譜，普洱熟茶氣相色譜圖如圖1所示。

圖1 普洱熟茶7572,7452和7692揮發(fā)性物質(zhì)色譜圖Fig.1 Volatile substances chromatograms of 7572, 7452 and 7692 Puer ripe teas

在色譜圖上選擇一色譜峰，該峰為所有樣品所共有，且位于色譜圖較中心位置和具有較高的強度，將其指定為參考峰，在此基礎(chǔ)上求出所有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。標準圖譜的確定采用共有模式中的平均矢量法，求出待測峰i的相對面積。將樣品中各組分的相對保留時間值a按大小排列，并在每個a值下標出該組分的相對面積Sr，再將不同樣品中具有相同a值的Sr做比較分析，以各樣品的相對保留時間值(a)和相對峰面積(Sr)構(gòu)建普洱熟茶GC/MS色譜指紋圖譜，如表2所示，順氧化芳樟醇、反氧化芳樟醇、芳樟醇、1,2,3三甲氧基苯和1,2,4三甲氧基苯，這5種標準品在數(shù)字化圖譜中色譜峰號分別為11、12、13、19和21號。表中無對應(yīng)的相對面積Sr時表示該樣品不具有該a值的色譜峰。以標準指紋圖譜為參考，分別求出各樣品與標準圖譜的重疊率、相關(guān)系數(shù)、夾角余弦和共有峰數(shù)目。

表2 普洱熟茶7572揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)字化指紋圖譜

注：Ma：總峰數(shù)；Nb:共有峰數(shù),S:相對峰面積總和(%)；W:特征峰相對面積總和；Y：重疊率。下同。

2.2 指紋圖譜的分析

從表2可以看出，普洱熟茶7572色譜指紋圖譜中面積較大的色譜峰有41個，其中有38個色譜峰為普洱熟茶所共有，這說明7 572這個產(chǎn)品與其它熟茶之間在揮發(fā)性物質(zhì)組成和含量上存在著差異。在相同的保留時間內(nèi)7 692和7 452均出現(xiàn)38個色譜峰。7572平均相對峰面積為13.73，標準偏差僅為0.89，7 692和7 452相對峰面積總和分別為12.02和12.75，小于7572。

在普洱熟茶數(shù)字化指紋圖譜中，利用聚類分析的方法找出29個色譜峰，它們的相對總面積占總面積的92%以上，與全圖譜的相似度也在90%以上，因此29個色譜峰可以作為判別普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)的群體特征峰，這些色譜指紋圖譜為普洱熟茶樣品100%共有峰，是熟茶揮發(fā)性物質(zhì)的主要組成成分，是普洱熟茶的揮發(fā)性物質(zhì)特征指紋圖譜(圖2，表3)。

圖2 普洱熟茶7 572揮發(fā)性物質(zhì)特征指紋圖譜Fig.2 Characterization fingerprint of volatile substances of 7 572 Puer ripe tea

由表3可知，在29個普洱熟茶特征圖譜出峰的保留時間內(nèi)，7 692和7 452均出現(xiàn)色譜峰28個，相對峰面積總和小于7 572。1,2,3三甲氧基苯和1,2,4三甲氧基苯，這兩種物質(zhì)具有典型的陳香味，且這兩種揮發(fā)性物質(zhì)占到特征峰總面積的10%以上，芳樟醇占特征峰總面積的2.67%(圖3)。

表3 普洱熟茶7 572揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)字化特征指紋圖譜

圖3 7 572與7 692、7 452熟茶主要揮發(fā)性物質(zhì)比較Fig.3 Comparison main volatile substances of 7 572, 7 692 and 7 452 Puer ripe teas

2.3 普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)色譜指紋圖譜的應(yīng)用

2.3.1 相似度分析

以各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為因子，建立普洱熟茶GC/MS數(shù)字化指紋圖譜。按照上述方法，12批7572樣品及7692和7452的相關(guān)系數(shù)、夾角余弦和重疊率如表4所示。

從表4可知，熟茶7572樣品色譜指紋圖譜與標準圖譜相比較，重疊率均為99%以上，相關(guān)系數(shù)達0.93以上，夾角余弦的相似度達到了0.97以上，而7692和7452這2個熟茶與標準指紋圖譜比較重疊率為97%，相關(guān)系數(shù)分別為0.80和0.77，夾角余弦均小于或等于0.92，均遠小于7572，從指紋圖譜的相似度分析來看，7572熟茶與7692和7452在揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量上差異性較大。

表4 不同種類熟茶相似度比較

2.3.2 系統(tǒng)聚類分析

在已建立的普洱熟茶數(shù)字化指紋圖譜的基礎(chǔ)上，對14個普洱熟茶數(shù)字化指紋圖譜進行系統(tǒng)聚類。選用歐氏距離作為樣品間相似性的測度，采用最短距離法聚類分析，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)歐式距離取值為0.88及以上時，14個樣品明顯分為2大類，第一類為普洱熟茶7572，另一類為7692和7452。在系統(tǒng)聚類圖上，我們可以看到，7572熟茶901、902和903三個批次與7692距離較近，這說明它們在揮發(fā)性物質(zhì)的組成上差異性不大，2008年生產(chǎn)的7572熟茶產(chǎn)品大多批次聚在一起，這說明各批次間品質(zhì)接近，質(zhì)量穩(wěn)定。

圖4 普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis on aroma of Puer ripe teas

2.3.2 主成分分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對14個熟茶樣品的數(shù)字化指紋圖譜主成分分析結(jié)果見表5、表6。通過對主成分貢獻的分析可知，普洱熟茶的主成分達到了11個。PC1～PC6的貢獻率分別為29.44%、16.91%、15.06%、11.29%、9.21%和7.11%，其他成分的貢獻率相對較小，從累計貢獻率來看，取前6個主成分時，累計貢獻率為89.01%，根據(jù)主成分分析原理，前6個主成分可以代表指紋圖譜的全部信息(表5)。

表5 普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)的貢獻率和累計貢獻率

注：PC1～PC11——綜合41個原始指標的前11個主成分。

由表6可知，第一主成分主要反映了色譜圖中第6、11、21等號色譜峰信息，其中，11號色譜峰是順-氧化芳樟醇，21號色譜峰是1,2,4三甲氧基苯，芳樟醇主要在第四主成分反映出來。第19號色譜峰1,2,3三甲氧基苯的信息主要在第二和第五主成分反映出來。普洱茶產(chǎn)品的最終用料是通過不同季節(jié)、不同等級、不同產(chǎn)地和不同發(fā)酵程度的原料拼配得到的，這需要保持長期的穩(wěn)定性。不同產(chǎn)品的主成分分析結(jié)果應(yīng)該是不同的。

表6 標準化特征向量

注：PC1～PC41—綜合41個特征圖譜原始指標的獨立指標；X1～X41—樣品模式中的41個面積較大的色譜峰。

2.3.4 二維排序和三維透視分析

在主成分分析的基礎(chǔ)上，以14個普洱熟茶的第一主成分作縱坐標，以第二主成分為橫坐標，作二維散布圖，圖5可以直觀地顯示出7572較為分散，但有一定的聚合度，不同年份及批次7572普洱熟茶在揮發(fā)性物質(zhì)的組成上還存在一定的差異。7692和7452與7572在二維圖上相距較遠。普洱熟茶經(jīng)過發(fā)酵后，其揮發(fā)性物質(zhì)組成發(fā)生了很大的變化，生茶和曬青毛茶中主要揮發(fā)性物質(zhì)芳樟醇被氧化成氧化芳樟醇，同時生成了新的具有陳香味物質(zhì)，在揮發(fā)性物質(zhì)的組分上遠大于生茶，但沒有一個占有主導(dǎo)地位。因而，普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)組分較多，但含量較低，在二維圖上表現(xiàn)出較為分散。在二維圖上可以看出，有一個批次的7572與其他的熟茶相距較遠，結(jié)合圖4可知，該熟茶是901、902和903的重合點。

圖5 14個普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)第1、2主成分二維排序圖Fig.5 Two-dimension scatter plot based on first and second primary components of volatile substances of 14 Puer ripe teas

以14個樣品的第一主成分作X軸，以第二主成分作Y軸，以第三主成分作Z軸，作三維透視圖。從圖6可以直觀地看出7692和7452在三維空間圖上相距較遠，7572熟茶各批次基本上聚合在一起。有1批次產(chǎn)品在三維圖上與其他批次有一定的距離，結(jié)合圖4聚類分析結(jié)果可知，這可能是901、902和903重合點。

圖6 14個熟茶揮發(fā)性物質(zhì)主成分三維圖Fig.6 Three-dimension chart based on primary components of aroma of 14 Puer ripe teas

3 結(jié)論和討論

利用GC/MS方法，建立了普洱熟茶7572揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)字化指紋圖譜和特征指紋圖譜，利用指紋圖譜的相似度可以將7572與7692、7452這2個熟茶進行有效鑒別。系統(tǒng)聚類和主成分分析2種模式識別方法均可以對7572與7692、7452普洱熟茶產(chǎn)品進行量化識別。由于普洱產(chǎn)品花色較多，要實現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜在產(chǎn)品鑒定和質(zhì)量保證上的應(yīng)用，需要對不同的產(chǎn)品分別建立指紋圖譜。

普洱熟茶揮發(fā)性物質(zhì)組成較多，含量較低，不同批次7572產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)組成上存在一定的差異性，其聚合度相對較低。茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)組成影響因素較多，用于建立指紋圖譜樣品的選擇需要具有代表性，而且需要保持穩(wěn)定性。

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Establishing fingerprints of volatile substances of 7572 Puér ripe tea based on gas chromatography technology

NING Jing-ming, ZHANG Zheng-zhu,WAN Xiao-chun*

(State key Laboratory Tea Plant Biology and Utilization,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Puér ripe tea is prepared by fermentation of raw green tea. Puér ripe tea can be divided into many varieties depending on fermentation degrees. Sensory evaluation is the only way to distinguish the varieties. Quantitative evaluation is needed. This study used gas chromatography to analyze volatile substances of Puér ripe tea (7572). Puér ripe tea (7572) digital fingerprint and the characteristic fingerprint are established to perform quantitative analysis of different varieties teas. System clustering and principal component analysis method are used for a comprehensive analysis of chromatogram. By compare the correlation coefficient, 7572,7692 and 7452 can be distinguished. The cosine of the angle and the overlap rate are used in characterization of tea fingerprint. It provides a quantitative method to distinguish different varieties teas and control the quality of tea.

gas chromatography; Puér ripe tea; fingerprint; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610029

博士，副教授(宛曉春教授為通訊作者,E-mail：xcwan@ahau.edu.cn)。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(茶葉)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項(CARS-23)；安徽省自然科學(xué)基金(1408085MC61)

2015-12-17，改回日期：2016-03-16