陳妍竹，胡文忠，劉程惠，孫錄，付喜慶，孫佩茗

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600)

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掃描電鏡在果蔬保藏中的應(yīng)用

陳妍竹，胡文忠*，劉程惠，孫錄，付喜慶，孫佩茗

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600)

隨著掃描電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，它已經(jīng)被成功地應(yīng)用于醫(yī)療、環(huán)境、生物、食品研究等各個領(lǐng)域，成為不可缺少的高科技輔助研究技術(shù)之一。近年來，越來越多的研究者們將它應(yīng)用于果蔬保藏方面，以觀察果蔬貯藏期內(nèi)的組織表面形態(tài)變化以及微生物侵染果蔬表面過程。文章主要介紹掃描電鏡在果蔬采后病害防治及鮮切果蔬保鮮兩方面的應(yīng)用現(xiàn)狀，供未來研究者們研究果蔬保鮮及加工做參考。

掃描電子顯微鏡；果蔬；保藏；應(yīng)用

掃描電子顯微鏡主要是利用電子束在樣品表面進行逐點掃描，利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態(tài)[1]。因掃描電鏡操作簡單，圖像分辨率高，所呈現(xiàn)的圖像富有立體感，且視野廣泛，景深長等特點，使其迅速成為各研究方向中必不可少的工具之一。掃描電鏡在諸多領(lǐng)域中都有應(yīng)用，例如在環(huán)境領(lǐng)域中可用于研究葉子表面顆粒物分布，研究不同植物的吸附能力[2]。在生物方面可用來觀察昆蟲表皮翅膀與甲殼[3]表面形態(tài)，橄欖果皮、角質(zhì)層蠟及細菌粘附情況[4]，以及Gagaita果實提取物在不同烘干條件下粉末形態(tài)[5]。在無機化工材料中可觀察納米二氧化硅微粒以及納米磷酸鋅涂層[6]。在地質(zhì)方面通過觀察黑色頁巖形態(tài)進一步分析其微觀孔隙類型及演化過程等[7]。此外，它還在醫(yī)學(xué)、礦物、冶金、電子材料等均有應(yīng)用[8-11]。目前掃描電鏡也已經(jīng)作為輔助觀察技術(shù)應(yīng)用于果蔬加工及保鮮的研究中，本文將著重介紹掃描電鏡在果蔬采后病害防治及鮮切果蔬保鮮方面的應(yīng)用。

1 掃描電鏡的發(fā)展及分類

1935年，掃描電子顯微鏡雛形初現(xiàn)，但在當(dāng)時并不具有實用價值，2年后其理論獲得完善，在1942年，Zworykinetal制成了第一臺掃描電鏡，分辨率為1 μm，10年后SEM分辨率已經(jīng)可以達到50 nm，此后掃描電鏡所具備的潛能受到重視。隨著技術(shù)的發(fā)展與完善，1965年掃描電鏡進入市場，進入一個全新發(fā)展的時期，此后其相關(guān)技術(shù)迅猛發(fā)展，1975年掃描電鏡二次電子圖像分辨率已達到6 nm，標(biāo)志著掃描電鏡進入了數(shù)字化時代，直至今日，掃描電鏡已經(jīng)成為一種全電子計算機控制、全自動圖像分析的數(shù)字型掃描電鏡[12]。

目前掃描電子顯微鏡主要分為五類，具體優(yōu)缺點詳見表1。其中生物樣品研究中常使用常規(guī)掃描電子顯微鏡 (scanning electron microscope, SEM) 和環(huán)境掃描電子顯微鏡 (environmental scanning electron microscope, ESEM)，與環(huán)境掃描電鏡相比，常規(guī)掃描電鏡應(yīng)用更為廣泛。

2 掃描電鏡在果蔬采后病害防治中的應(yīng)用

由于果蔬本身屬于鮮活農(nóng)產(chǎn)品，水分含量較高且營養(yǎng)豐富，在采摘、包裝、運輸、貯藏中容易發(fā)生機械損傷而受到病原菌侵染，發(fā)生腐爛變質(zhì)。因而人們使用化學(xué)殺菌劑、物理冷殺菌、生物防治及采用植物提取物對果蔬采后病害進行防治。其中生物防治及植物提取物控制采后病害由于其具有安全、有效等特點也成為近年研究熱點之一。通過掃描電鏡相輔助，可以深入研究采后病害防治機理，例如拮抗菌附著情況，拮抗菌與病原菌相互作用及它們的表面形態(tài)以及植物提取對病原菌絲影響等。

2.1 掃描電鏡在拮抗菌控制果蔬采后病害中的應(yīng)用

自然界存在大量微生物對采后病原菌生長有抑制作用，到目前為止，人們已經(jīng)從果蔬土壤等分離到多種拮抗菌，這些拮抗菌包括酵母菌、細菌、小型絲狀真菌[25]，其中以拮抗酵母菌應(yīng)用最為廣泛。USALL等人[26]通過普通掃描電鏡觀察蘋果傷口處及表面酵母菌生長狀況，圖片直觀表明傷口處內(nèi)表面酵母菌生長迅速。而CHAN等人[27]通過普通掃描電鏡對拮抗酵母菌與病原菌之間的相互作用進行具體分析，同時還證明2種不同拮抗酵母菌(Pichiamembranefaciens和Cryptococcusalbidus)對病原菌菌絲附著能力不同。研究者們結(jié)合掃描電鏡研究草莓采前施噴拮抗酵母菌對采后貯藏性能及質(zhì)量的影響[28-30]，通過掃描電鏡圖片都可看出未經(jīng)酵母菌處理的對照組都有病原菌菌絲，而其他處理組沒有，說明拮抗酵母菌可抑制病原菌菌絲體生長，其中毛淑波和WEI等人還通過掃描電鏡證明酵母菌數(shù)量多少與采前施噴次數(shù)有關(guān)，采摘前0、3、6天施噴酵母菌更有利于其在果實表面定殖增長，該處理方法下酵母菌增殖數(shù)量最多。

表1 掃描電鏡種類及其優(yōu)缺點

除了使用掃描電鏡觀察單個拮抗菌的防治效果，掃描電鏡也被應(yīng)用于拮抗菌與物理方法復(fù)合控制果蔬采后病害。其中趙妍[31]通過掃描電鏡觀察不同處理組番茄果實傷口處病原菌生長情況，發(fā)現(xiàn)熱空氣38 ℃處理 24 h后病原菌菌絲數(shù)量顯著減少，菌絲干癟皺縮。酵母菌拮抗組與酵母菌復(fù)合熱空氣處理組均能觀察到菌絲。說明，雖然復(fù)合熱空氣處理可以增強防治效果，但是仍不能殺滅病原菌。而ZHAO等人[32]在趙妍基礎(chǔ)之上還研究熱空氣處理與酵母菌接種順序問題，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，接種酵母菌后再經(jīng)空氣熱處理，雖然可以使病原菌菌絲體受損嚴重，但同時也使酵母菌表面凹陷，因此還是熱空氣處理后再接種酵母菌較適宜。拮抗菌控制果蔬采后病害目前研究多、應(yīng)用廣。菌本就屬于微觀世界，雖然普通顯微鏡也可對其進行觀察，但是分辨率、成像質(zhì)量、放大倍數(shù)都遠不及掃描電鏡，通過掃描電鏡不僅可以觀察酵母拮抗病原菌、還可觀察病原菌侵入植物組織的過程[33]或者單種菌的生長繁殖過程，使采后病害的研究更加直觀形象。

2.2 掃描電鏡在植物提取物控制果蔬采后病害中的應(yīng)用

利用植物提取物作為植源性殺菌劑，目前已成為國內(nèi)外研究熱點之一，并取得較大進展。研究者將掃描電鏡應(yīng)用于植物提取物控制采后病害的研究中。哈斯格根通過掃描電鏡觀察中草藥北豆根提取物對灰葡萄孢菌與鏈格孢菌菌絲體的影響[34]，觀察發(fā)現(xiàn)菌絲的形態(tài)與未處理組相比發(fā)生明顯改變，并且隨著中草藥濃度的加大，菌絲形態(tài)皺縮，干癟，扭曲，斷裂，出現(xiàn)空腔，在最小抑菌濃度下，這2種病原真菌菌絲數(shù)量均有減少，在最小殺菌濃度處理下，菌絲數(shù)量進一步減少且大部分菌絲斷裂，部分出現(xiàn)消融。馮武研究肉桂精油對鏈格孢菌絲生長的影響[35]，將掃描電鏡與PDB培養(yǎng)基上肉眼觀察菌絲生長形態(tài)相結(jié)合，微觀與宏觀相結(jié)合，使實驗更具有可信度。在300 μL/L肉桂精油PDB培養(yǎng)基中，肉眼可見鏈格孢長勢較差，菌絲顏色較淺，使用掃描電鏡觀察，該精油濃度下菌絲粗細不一，但菌絲表面光滑。在500 μL/L濃度下，鏈格孢生長量最少，菌絲球顏色變白，掃描電鏡觀察下菌絲少且干癟，細胞內(nèi)容物較少。通過掃描電鏡，可以看出植物提取殺菌劑作用于病原菌菌絲體，使其結(jié)構(gòu)遭到破壞，失去增殖侵染能力進而控制病害蔓延。

3 掃描電鏡在鮮切果蔬中的應(yīng)用

隨著生活節(jié)奏的加快，鮮切果蔬因其方便、快捷、新鮮、營養(yǎng)等特點，深受人們的喜愛。但鮮切果蔬因輕度加工后，與正常完整的果蔬相比，更容易受到病原菌的侵染，也因在其加工中去皮、切分等使果蔬組織損傷，色澤發(fā)生改變[36]。掃描電鏡很適合應(yīng)用于鮮切果蔬方面，鮮切果蔬與普通完整果蔬的區(qū)別在于鮮切的組織是裸露在外，可通過掃描電鏡觀察其組織表面形態(tài)、切面光滑程度、細胞形態(tài)以及不同手段處理保鮮后表面情況。目前，國內(nèi)對鮮切果蔬的研究大多停留在測定生理生化指標(biāo)，國外則已經(jīng)將掃描電鏡應(yīng)用于果蔬保鮮及加工改進的研究。

3.1 掃描電鏡觀察鮮切果蔬在貯藏時質(zhì)量變化

在FUNDO研究鮮切甜瓜在貯藏期內(nèi)的質(zhì)量變化中[37]，掃描電鏡作為組織表面分析的一種手段，觀察鮮切甜瓜在0～6 d貯藏期內(nèi)其表面變化，第0天，細胞排列緊密，細胞壁界限明顯，但在貯藏期4天后，大部分細胞壁已經(jīng)分解，其余細胞壁也已經(jīng)扭曲變形，細胞排列雜亂無章。MISHRA在研究鮮切茄子褐變程度中通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)[38]， 使用鋒利刀片切割茄子會減少其物理性損傷，切割表面比較平滑，與肉眼觀察鮮切茄子的褐變程度相結(jié)合可看出普通刀切割的茄子褐變程度明顯高于鋒利刀片切割的。說明目前掃描電鏡既可以用于觀察鮮切果蔬貯藏期表面變化，還可用于觀察不同處理方式，例如加工方式、切割方式等對鮮切果蔬貯藏時期質(zhì)量的影響。

3.2 掃描電鏡在涂膜保鮮中的應(yīng)用

掃描電鏡還可以用于觀察鮮切果蔬涂膜后表面形態(tài)。例如MARIA等人觀察蛇果組織表面形態(tài)以及植物黏液、生育酚、納米乳劑等不同膜處理后的表面形態(tài)[39]，其中組織表面的涂膜形態(tài)取決于分散成膜的粒度大小。VARGAS等人則觀察3種不同膜(可食用殼聚糖，可食用殼聚糖+甲基纖維素，可食用殼聚糖+植物油酸)在正常大氣壓及真空浸漬下的鮮切胡蘿卜表面區(qū)別[40]，在常壓下進行涂膜，未被膜覆蓋面積明顯多于真空浸漬處理的，使用真空浸漬有較高的成膜質(zhì)量，能均勻附著在鮮切胡蘿卜表面，同時還觀察了涂膜后鮮切胡蘿卜薄片在常壓及真空下的截面圖，在真空處理下涂膜部分浸入組織中。AZARAKHSH等人通過掃描電鏡觀察可食用海藻鹽結(jié)合3 g/L檸檬草精油處理鮮切菠蘿[41]，在貯藏8 d后涂膜處理的鮮切菠蘿表面形態(tài)與新鮮菠蘿相差無幾，但未處理的鮮切菠蘿細胞壁瓦解，微生物顯著生長，說明檸檬草精油結(jié)合涂膜處理可顯著減少微生物生長，延長鮮切菠蘿貯藏期。說明掃描電鏡還可以成為鑒別涂膜保鮮效果好壞的一種手段，使對膜好壞的鑒定不在局限于宏觀觀察褐變程度、是否有菌生長，而是上升到微觀世界，從成膜質(zhì)量、抑菌效果、粒度大小等多方面分析。

3.3 掃描電鏡在冷殺菌技術(shù)保鮮中的應(yīng)用

掃描電鏡在冷殺菌保鮮中也有一定的應(yīng)用，既可以用于觀察鮮切果蔬殺菌處理后表面形態(tài)，觀察菌落減少情況，還可以觀察殺菌處理后菌的表面形態(tài)，推測該種殺菌技術(shù)能否對此有效果。有研究者使用酸性或者堿性電解水處理鮮切香菜后，通過掃描電鏡觀察幸存的微生物種群[42]，其中經(jīng)過酸性與堿性電解水組合處理的香菜表面微生物最少，且酸性與堿性電解水組合殺菌效果好于單獨的酸性處理或弱酸性電解水處理。ALWI研究臭氧處理鮮切風(fēng)鈴椒可減少沙門氏菌、單增李斯特菌、傷寒沙門氏菌的數(shù)量中應(yīng)用了環(huán)境掃描電鏡[43]，通過臭氧處理該3種細菌的培養(yǎng)基，觀察細胞處理前后形態(tài)，未處理細胞表面光滑完整，處理后的細菌細胞表面不規(guī)則，細胞壁破裂。說明臭氧處理可破壞細菌滲透壓平衡使其鈍化至滅活。MARTNEZ-SNCHEZ等人研究在光照條件下貯藏鮮切生菜對其質(zhì)量影響[44]，在光照條件下貯藏10 d后，生菜表面氣孔大都會張開，氣孔張開則有利于葉片導(dǎo)水度及植物組織之間氣體交換，在此方面研究，大多出版物只是說光照會促使氣孔打開，促進氣體交換，但是都沒人使用掃描電鏡對此驗證，僅是測定空氣組成與失重，猜測光照會影響氣孔開度以及呼吸作用，但該作者則通過掃描電鏡圖片直接說明光照會促使生菜氣孔張開，說明掃描電鏡在鮮切果蔬各方面的研究是十分必要的，并且所呈現(xiàn)的圖像清晰明確，讓人一目了然。

4 展望

果蔬采后病害防治、保鮮及貯藏一直是一個研究熱點，果蔬鮮切更是代表著一種新的生活理念，若在研究中結(jié)合掃描電鏡，會使實驗結(jié)果更加形象清晰。目前，在國外，掃描電鏡已經(jīng)作為一種普遍的技術(shù)手段，除了應(yīng)用在物理化學(xué)材料，生物醫(yī)學(xué)，電子材料方面，在果蔬采后病害防治、鮮切果蔬加工與貯藏[48-49]等多個方面都有應(yīng)用，而在國內(nèi)掃描電鏡更多的還是應(yīng)用于物理及化學(xué)材料觀察方面，對果蔬采后病害防治方面以及植物生長中拮抗菌篩選方面也有涉及[45-47]，但在鮮切果蔬加工和保鮮方面應(yīng)用較少。相信隨著掃描電鏡技術(shù)的發(fā)展及儀器的普及，掃描電鏡不僅能在果蔬采后與鮮切果蔬的研究中得到廣泛應(yīng)用，還將更多地應(yīng)用于食材新鮮度的鑒定、新型食品的開發(fā)[50]、產(chǎn)品質(zhì)量鑒別、食品益生菌新物種鑒別等方面。根據(jù)各類掃描電鏡優(yōu)缺點，將不同種掃描電鏡應(yīng)用于其最適宜的方向，同時還可以將其與拉曼光譜儀，紅外光譜儀相結(jié)合，為未來研究者們的深入研究提供更好的技術(shù)手段支持。

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Application of SEM in storage of fruits and vegetables

CHEN Yan-zhu,HU Wen-zhong*,LIU Cheng-hui,SUN Lu,FU Xi-qing,SUN Pei-ming

(College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)

With the development of scanning electron microscope technology, it has been successfully applied in the field of medical, environmental, biological research and so on. It has become one of the high-tech assistant research techniques. In recent years, more and more application are used in fruits and vegetables in order to observe the morphological change in tissue surface and process of microorganisms infecting fruits and vegetables. In this paper we discussed the application of SEM in control of postharvest disease and the storage of fresh-cut fruits and vegetables to provide

about fruits and vegetable fresh-keeping and processing.

scanning electron microscope (SEM);fruit and vegetable; preservation; application

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610047

碩士研究生(胡文忠教授為通訊作者,E-mail：hwz@dlnu.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金項目(31471923)；中央高校自主科研基金青年項目(DC201502020402)

2016-03-01，改回日期：2016-03-28