1 株古細菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢桿菌中的誘導表達

王珊瑛，李由然，顧正華，張 梁，丁重陽，石貴陽

（1.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

1 株古細菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢桿菌中的誘導表達

王珊瑛，李由然，顧正華，張 梁，丁重陽，石貴陽*

（1.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

來源于古細菌嗜酸硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）的麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosylterhalose synthase，MTSase）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase）聯(lián)合作用，可以利用淀粉為底物生成海藻糖。本研究構建了6 種枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體，將密碼子優(yōu)化后的MTSase和MTHase編碼基因在木糖異構酶基因的啟動子及其阻遏蛋白介導下實現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的功能表達，木糖啟動子分別來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。在以5 g/L甘油為碳源，24 g/L蛋白胨為氮源時，菌體培養(yǎng)8 h后加入終質(zhì)量濃度為6 g/L的木糖，37 ℃誘導16 h后重組MTSase、MTHase產(chǎn)生聯(lián)合作用，海藻糖轉(zhuǎn)化率達到33.57%。實現(xiàn)了MTSase、MTHase在枯草芽孢桿菌中的功能表達。

穿梭質(zhì)粒；嗜酸硫化葉菌；枯草芽孢桿菌；誘導表達

海藻糖是一種廣泛存在于低等植物、細菌、真菌等中的非還原性二糖。它是麥芽糖的同分異構體，由兩分子葡萄糖通過α-1,1-糖苷鍵相連而成。海藻糖化學性質(zhì)穩(wěn)定，不具還原性，不易被酸水解，具有穩(wěn)定生物膜和蛋白質(zhì)結構的突出功能，因而廣泛應用于生物制劑、醫(yī)藥、食品、化妝品等領域[1]。被在食品領域主要作為甜味劑、保鮮劑、抗變性劑、脫水劑被廣泛使用[2]。海藻糖早期主要從干酵母中提取，提取工藝復雜、產(chǎn)率低。工業(yè)生產(chǎn)海藻糖主要有合成法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法[1]。其中酶轉(zhuǎn)化法具有轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)移性強、作用溫和、無污染等優(yōu)點，被認為是最有發(fā)展?jié)摿Φ暮Ｔ逄枪I(yè)生產(chǎn)方法[3]。酶轉(zhuǎn)化法根據(jù)底物（葡萄糖、麥芽糖和淀粉）不同可以分為3 大類[4]。以葡萄糖為底物時，利用葡萄糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶可將兩分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。此過程消耗鳥嘌呤核苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）等高能物質(zhì)，且不穩(wěn)定，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[4]。目前工業(yè)上生產(chǎn)海藻糖主要以麥芽糖和淀粉為底物。以麥芽糖為底物時，利用海藻糖合成酶將α-1,4-鍵轉(zhuǎn)變?yōu)棣?1,1-鍵，使得麥芽糖在分子內(nèi)轉(zhuǎn)化為海藻糖[5-6]，轉(zhuǎn)化率高達70%～80%，但該方法反應時間過長，反應溫度低（一般為20～30 ℃）[2]。以淀粉為底物，依靠麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosylterhalose synthase，MTSase）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase）可將直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為海藻糖。MTSase作用于直鏈淀粉還原性末端，將α-1,4糖苷鍵轉(zhuǎn)化為α-1,1糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖；MTHase內(nèi)切該中間產(chǎn)物中與海藻糖相連的α-1,4糖苷鍵[7]，使之分解成海藻糖和減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖，如此反復交替就可以將直鏈淀粉或麥芽寡糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖[8]。在支鏈淀粉酶的作用下，海藻糖產(chǎn)率可達80%以上，反應溫度在50 ℃以上[8]。與海藻糖合成酶催化麥芽糖生成海藻糖相比，該方法催化速率快、副產(chǎn)物少（主要是葡萄糖和麥芽糖）、不易染菌、生產(chǎn)過程穩(wěn)定性高。這種直接以淀粉為底物高效制取海藻糖的技術，為工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖開辟了新途徑。

MTSase和MTHase存在于節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）[9]、根瘤菌（Rhizobium sp.）[10]、古細菌嗜熱硫化葉菌[8]（Sulfolobus solfataricus）以及古細菌嗜酸硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）[11]中，其中硫化葉菌來源的MTSase、MTHase最適反應溫度為60～80 ℃，而節(jié)桿菌屬等來源的MTSase和MTHase最適反應溫度為40～50 ℃[8-9,11]。較高的轉(zhuǎn)化溫度可以降低染菌概率，便于控制，所以本實驗選擇硫化葉菌來源的基因進行研究。然而，這些菌株發(fā)酵困難，產(chǎn)酶量低，難以實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，阻礙了以淀粉為原料生產(chǎn)海藻糖的廣泛應用。芽孢桿菌一向是工業(yè)生產(chǎn)優(yōu)勢菌株，是當前大規(guī)模生產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶以及多種生物殺蟲劑常用宿主菌[12]。其中枯草芽孢桿菌是當今工業(yè)酶生產(chǎn)中應用最廣泛的菌種之一。其優(yōu)點為蛋白合成量高、安全性好且發(fā)酵條件簡單[13]，是目前生產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等工業(yè)用酶的理想生產(chǎn)菌株。枯草芽孢桿菌常用的誘導表達系統(tǒng)有3 種。第1類是受異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導的啟動子，IPTG與阻遏蛋白結合，從而誘導下游基因的表達；第2類是以木糖為誘導物的啟動子，該表達系統(tǒng)由xylR編碼的阻遏蛋白嚴格控制，添加0.1%～2%的木糖就能誘導啟動子進行表達；第3類是以蔗糖為誘導物的啟動子，該啟動子具有連續(xù)性，不受蔗糖的控制，但缺少蔗糖表達強度會降低100 倍[12,14]。這3 類誘導系統(tǒng)當中，IPTG價格昂貴，毒性較強；而蔗糖的啟動強度相對較弱，因而都不適宜外源蛋白大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。

本研究擬將嗜酸硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）編碼MTSase、MTHase的Y1（23806395）、Z1（3473480）基因在不同來源木糖誘導型啟動子的介導下表達，并對重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進行優(yōu)化，以期實現(xiàn)這兩種基因在枯草芽孢桿菌中功能的高效表達，為該酶制劑在食品工業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

表1 實驗菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

Bacillus subtilis WB600、Bacillus megaterium CICIM B1514、Bacillus licheniformis 14580、表達宿主菌Bacillus subtilis WB600、大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHY300-PLK為江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室保藏，實驗涉及的菌株和質(zhì)粒見表1。芽孢桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基按照文獻[13]配制，重組菌生長培養(yǎng)基LB和篩選培養(yǎng)基LBA（含氨芐青霉素）以及LBT（含四環(huán)素）按照文獻[8]配制。重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基TB按文獻[8]配制。重組大腸桿菌培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，重組芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為20 μg/mL的四環(huán)素。

1.2 試劑

基因克隆實驗中所使用的T4 DNA連接酶、DNA聚合酶大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶 立陶宛Fermentas公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒以及核苷酸片段純化試劑盒 蘇州科晴生物基因技術有限公司；氨芐青霉素和四環(huán)素 美國Sigma公司；其他試劑上海國藥集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組表達質(zhì)粒的構建

首先提取B. subtilis WB600、B. megaterium CICIM B1514、B. licheniformis14580基因組DNA，使用pfu DNA聚合酶及引物（表2）擴增獲得不同來源的木糖啟動子序列。反應條件：94 ℃預變性5 min后進入下一循環(huán)：94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴增產(chǎn)物純化后經(jīng)BglⅡ和BamHⅠ雙酶切，連接至同樣酶切的載體pHY300-PLK上，獲得重組質(zhì)粒pHY-bs、pHY-bm、pHY-bl。將密碼子優(yōu)化后的Y1、Z1片段經(jīng)BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后膠回收，克隆至載體上獲得重組質(zhì)粒pHY-bs-Y1、pHY-bs-Z1、pHY-bm-Y1、pHY-bm-Z1、pHY-bl-Y1、pHY-bl-Z1。

表2 引物列表Table 2 PCR primers

1.3.2 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化與篩選

枯草芽孢桿菌感受態(tài)按照文獻[13]制備。

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：取制備好的感受態(tài)懸液，加入1～5 μg的質(zhì)粒，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)2.5 h，涂布于抗性再生培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，提取抗性平板上轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒并進行酶切驗證，篩選出陽性克隆。

1.3.3 重組MTSase和MTHase的誘導表達

將重組菌B. subtilis（pHY-bs-Y1）、B. subtilis（pHY-bs-Z1）、B. subtilis（pHY-bm-Y1）、B. subtilis（pHY-bm-Z1）、B. subtilis（pHY-bl-Y1）、B. subtilis（pHY-bl-Z1）分別接種于裝有15 mL SOB培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h作為種子。各取1 mL B. subtilis（pHY-bs-Y1）、B. subtilis（pHY-bs-Z1）種子液，接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進行混菌發(fā)酵。具體條件為：37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，加入終質(zhì)量濃度為10 g/L的木糖繼續(xù)培養(yǎng)14 h。收集發(fā)酵液，于4 ℃、12 000 r/min條件下離心，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.4）重懸菌體后超聲波破碎細胞（功率為400 W，工作時間為5 min，每破碎1 s，停3 s）。細胞破碎液經(jīng)高速離心（12 000 r/min、15 min）后棄沉淀，上清液即為酶液。以同樣條件得到B. subtilis（pHY-bm-Y1）、B. subtilis（pHY-bm-Z1）以及B. subtili（pHY-bl-Y1）、B. subtilis（pHY-bl-Z1）混菌發(fā)酵表達的重組酶。

1.3.4 雙酶法海藻糖生成酶活力的檢測

用0.2 mol/L pH 5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制5 g/100 mL麥芽糊精溶液，向該溶液中加入1 mL酶液，于60 ℃反應12 h后加入10 μL糖化酶，在60 ℃條件下繼續(xù)反應12 h，反應結束后煮沸20 min，反應液經(jīng)微孔濾膜過濾后用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定海藻糖含量[15]，經(jīng)糖化酶作用后反應液只有葡萄糖與海藻糖。檢測條件為：層析柱：XBridge Amide氨基柱；流動相：乙腈-水（4∶1，V/V）；流速1.0 mL/min；示差檢測器。酶活力定義：在60 ℃、pH 5.4條件下反應，每小時生成1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.3.5 重組枯草芽孢桿菌生長曲線的測定

從平板上挑取重組枯草芽孢桿菌單菌落接種于裝有15 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接150 μL于裝有30 mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，定點取樣測OD600nm值。以時間為橫坐標繪制重組菌的生長曲線。

1.3.6 不同碳源對酶活力的影響

分別考察葡萄糖、甘油、麥芽糊精、可溶性淀粉作為重組菌生長碳源時的產(chǎn)酶情況，碳源質(zhì)量濃度為5～20 g/L，培養(yǎng)條件及誘導方法同1.3.3節(jié)。發(fā)酵結束后菌體稀釋20 倍，OD600nm至0.5時進行超聲破碎并測定酶活力。

1.3.7 不同氮源對酶活力的影響

分別考察蛋白胨、棉籽粉、(NH4)2SO4和NH4Cl作為重組菌生長氮源時的產(chǎn)酶情況，氮源質(zhì)量濃度為12～48 g/L，培養(yǎng)條件及誘導方法同1.3.3節(jié)。發(fā)酵結束后菌體稀釋20 倍，OD600nm至0.5時進行超聲破碎并測定酶活力。

1.3.8 誘導劑不同添加時間對酶活力的影響

依照1.3.3節(jié)中的培養(yǎng)條件，分別在生長0、2、4、6、8、10、12 h后添加誘導劑，繼續(xù)發(fā)酵，總發(fā)酵周期為24 h。發(fā)酵結束后菌體稀釋20 倍，OD600nm至0.5時進行超聲破碎并測定酶活力。

1.3.9 誘導劑不同添加量對酶活力的影響

依照1.3.3節(jié)的發(fā)酵條件，分別添加0、2、4、6、8、10、15、20 g/L木糖誘導重組酶的表達。發(fā)酵結束后菌體稀釋20 倍，OD600nm至0.5時進行超聲破碎并測定酶活力。

2 結果與分析

表 3Y1/Z1基因與B. subtilis 基因密碼子使用頻率比較Table 3 Comparison of codon usage between Y1/Z1genes and B. subtilis

2.1 基于密碼子水平的表達優(yōu)化

通過對Y1、Z1基因序列分析發(fā)現(xiàn)，同一來源的這兩種基因密碼子使用頻率相同，偏好性與枯草芽孢桿菌有著明顯的差異（表3）。B. subtilis稀有密碼子有CUA、CCC、AUA、UAG、UGA、AGG及CAC，這些密碼子在外源蛋白的枯草芽孢桿菌表達中起著抑制作用。研究表明，稀有密碼子的改變可以有效改善蛋白的異源表達[16]。根據(jù)表3中密碼子的使用頻率，對該基因進行了密碼子優(yōu)化：Y1基因改變了22 個堿基，優(yōu)化后GC含量由48.5%變?yōu)?8%，密碼子適應指數(shù)CAI為0.89（CAI為1表示最完美的表達系統(tǒng)），氨基酸未發(fā)生變化，分子質(zhì)量仍為2 160 bp；Z1基因改變了27 個堿基，優(yōu)化后GC含量由50%變?yōu)?1%，CAI為0.89，氨基酸未發(fā)生變化，分子質(zhì)量仍為1 668 bp。

2.2 重組表達質(zhì)粒的構建

圖1 MTSase和MTHase重組表達質(zhì)粒酶切電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of MTSase and MTHase expression plasmids subjected to double enzyme digestion

以B. subtilis WB600、B. megaterium CICIM B1514、B. licheniformis 14580基因組DNA為模板，使用引物對A、B、C（表2）擴增得到的產(chǎn)物大小均為1.4 kb，經(jīng)測序與NCBI上登記的B. subtilis、B. megaterium和B. licheniformis來源的木糖異構酶啟動子連同其調(diào)控原件的序列完全一致。首先將它們分別連接至穿梭克隆載體[17-18]pHY300-PLK，得到重組質(zhì)粒pHY-bs、pHY-bm、pHY-bl。接下來，將膠回收獲得的Y1、Z1酶切片段與以上重組質(zhì)粒連接，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切結果如圖1所示。pHY-bs-Y1經(jīng)雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)6.2 kb和2.1 kb兩條條帶，pHY-bs-Z1經(jīng)雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)6.2 kb和1.6 kb兩條條帶；pHY-bm-Y1經(jīng)雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)6.2 kb和2.1 kb兩條條帶，pHY-bm-Z1經(jīng)雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)6.2 kb和1.6kb兩條條帶；pHY-bl-Y1經(jīng)雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)6.2 kb和2.1 kb兩條條帶，pHY-bl-Z1經(jīng)雙酶切后進行電泳，出現(xiàn)6.2 kb和1.6 kb兩條條帶。雙酶切片段大小與目的基因大小一致，表明重組質(zhì)粒構建成功。

2.3 重組表達質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌WB600中的表達

使用化學轉(zhuǎn)化的方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，加入終質(zhì)量濃度為10 g/L的木糖繼續(xù)培養(yǎng)14 h。

MTHase和MTSase以淀粉質(zhì)原料為底物單獨作用均無法生成海藻糖。目前文獻報道的MTSase酶活力檢測方法是以麥芽寡糖（五糖或六糖）為底物，酶反應結束后利用糖化酶進行消化，HPLC測定糖化液中海藻糖的含量[8]；MTHase酶活力檢測方法是以麥芽寡糖為底物，加入一定酶活力單位的MTSase反應一定時間后，煮沸終止反應，再加入MTHase，反應液用HPLC測定海藻糖的含量[8]。本研究所構建的重組菌，MTHase和MTSase兩個酶編碼基因都經(jīng)過密碼子優(yōu)化，且表達載體和宿主均相同，最大化減少了蛋白表達環(huán)節(jié)產(chǎn)生的差異。基于以上因素，本研究開發(fā)出混菌發(fā)酵制備酶液的方式，即以麥芽糊精為底物反應，通過HPLC法測定反應生成的海藻糖以表征兩種酶的活力，該方法簡單直接。具體操作方式為將攜帶同一來源啟動子的兩株重組菌分別活化后，按相同接種量接種至一瓶培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；發(fā)酵結束時稀釋20 倍的菌體量（OD600nm）為0.5左右，收集菌體后使用超聲波破碎制備酶液。所獲得的重組酶液經(jīng)酶活力檢測有海藻糖生成。進一步使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析，與野生菌株對比，重組菌在70～100 kD和55～70 kD位置出現(xiàn)了特異蛋白條帶（圖2），且其分子質(zhì)量大小分別與預測的79 kD和61 kD一致。以上結果表明Y1、Z1基因在枯草芽孢桿菌WB600中均獲得表達。

不同來源的MTHase和MTSase的氨基酸序列不盡一致，蛋白結構的不同造成了功能的差異。Sulfolobus solfataricus和Sulfolobus acidocaldarius兩者MTSase氨基酸序列同源性為51.3%。Kobayashi等[19]研究表明MTSase轉(zhuǎn)糖苷作用分成兩步：先切斷麥芽寡糖還原端α-1,4-糖苷鍵，再將切斷的葡萄糖單體旋轉(zhuǎn)180°后重新連接產(chǎn)生α-1,1-糖苷鍵，一旦α-1,1-糖苷鍵無法形成，則會產(chǎn)生葡萄糖[9,19]；MTSase這一輕微的水解作用會導致副產(chǎn)物葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的生成[8]。與之相比，MTHase水解反應的專一性較強，只能作用于麥芽寡糖基海藻糖中與α-1,1-糖苷鍵相連的α-1,4-糖苷鍵。不同來源的MTSase、MTHase副產(chǎn)物比例不同，Arthrobacter sp.副產(chǎn)物中葡萄糖比例最高[9]，S. solfataricus[8]、S. acidocaldarius[11]副產(chǎn)物中麥芽糖比例最高，均可達10%以上。副產(chǎn)物的比例與底物的選擇有關，DE值越高，副產(chǎn)物比例越高。本研究中重組酶來源S. acidocaldarius，產(chǎn)物中麥芽糖比例最高，為10.13%。MTSase和MTHase來源菌株發(fā)酵困難，產(chǎn)酶量低，目前大多運用基因工程手段構建重組菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，已見的報道中宿主菌均為大腸桿菌。大腸桿菌易產(chǎn)生內(nèi)毒素，不適宜用于食品工業(yè)，而我國食品安全標準規(guī)定的淀粉水解酶類的安全生產(chǎn)菌株為芽孢桿菌。本研究將Y1、Z1基因?qū)肟莶菅挎邨U菌WB600，實現(xiàn)了這兩種酶在芽孢桿菌中異源表達。大腸桿菌重組菌產(chǎn)生的重組MTSase、MTHase最適反應溫度為60～80 ℃，最適反應pH值為4.0～6.0，本研究重組酶的最適反應溫度為60 ℃，最適反應pH值為5.4，與大腸桿菌表達重組酶差別不大。

圖2 重組蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of recombinant proteins

表4 不同來源木糖啟動子表達載體海藻糖生成酶活力的比較Table 4 Comparison of trehalose activity produced by xylose-inducible expression vectors from different sources

不同來源的誘導啟動子啟動MTSase和MTHase編碼基因轉(zhuǎn)錄表達的效率不同。由表4可知，在枯草芽孢桿菌宿主中B. subtilis來源的啟動子誘導效率最高，B. m e g a t e r i u m來源的啟動子誘導效率次之，B. licheniformis來源的啟動子誘導效率最低。

2.4 重組菌菌體生長曲線

微生物發(fā)酵通常采用生命力極其旺盛的對數(shù)生長期種子液，種子培養(yǎng)時間太短，菌體生長緩慢，致使發(fā)酵時間過長；種子培養(yǎng)時間太長，穩(wěn)定期菌種趨于老化，易發(fā)生菌體自溶，且不利于產(chǎn)物的積累。如圖3所示，重組菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后經(jīng)過6 h進入對數(shù)生長期，直至18 h進入穩(wěn)定期，21 h后菌體數(shù)量維持穩(wěn)定，芽孢開始生成。據(jù)此，選擇對數(shù)生長期的中期12 h作為種齡。

圖3 重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 3 Growth curve of recombinant strain in fermentation medium

2.5 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對重組菌產(chǎn)酶的影響

根據(jù)表4實驗結果，本研究選擇B. subtilis（pHY-bl-Y1）和B. subtilis（pHY-bl-Z1）進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。以TB培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，考察不同碳源和氮源對重組枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)海藻糖的影響。

2.5.1 碳源及其質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)酶的影響

分別使用葡萄糖、甘油、麥芽糊精、可溶性淀粉作為重組菌生長的唯一碳源進行發(fā)酵，考察不同碳源對菌體生長和重組MTSase、MTHase酶活力的影響，重組菌產(chǎn)酶情況如圖4所示。結果顯示5 g/L的甘油作為碳源能夠獲得最高的產(chǎn)酶（3.36 U/mL）。葡萄糖、麥芽糊精和可溶性淀粉作為唯一碳源，重組菌產(chǎn)酶與質(zhì)量濃度呈負相關趨勢。

圖4 不同碳源對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig. 4 Effects of different carbon sources on the production of recombinant enzyme

葡萄糖雖然能夠使菌體快速通過延滯期，促進菌體快速生長，卻并不能獲得更多的重組酶；質(zhì)量濃度高于15 g/L的葡萄糖更是體現(xiàn)出對產(chǎn)酶的強烈抑制作用。在已報道的有關碳源對芽孢桿菌淀粉水解酶類產(chǎn)酶影響的研究中，均顯示過高的碳源盡管能夠促進菌體生長，但不利于產(chǎn)酶，這一現(xiàn)象對于葡萄糖這類速效碳源尤為顯著[20]。遲效碳源對于菌體生長的促進效果差，但有利于產(chǎn)酶水平的提高，所以麥芽糊精、可溶性淀粉以及甘油能使酶活力維持在較高水平。

2.5.2 氮源及其質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)酶的影響

分別使用蛋白胨、(NH4)2SO4、棉籽粉、NH4Cl作為重組菌發(fā)酵的氮源，考察它們對重組菌產(chǎn)酶的影響，結果如圖5所示。(NH4)2SO4、NH4Cl不利于菌體生長，酶活力較低；重組菌利用蛋白胨產(chǎn)酶量最高。當?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為24 g/L時菌體生長良好，產(chǎn)酶最高達3.42 U/mL。微生物代謝氮源主要用于合成多種細胞物質(zhì)，包括氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等，因而會對產(chǎn)酶有重要影響。無機氮源進入細胞后需要與代謝中間產(chǎn)物形成氨基化合物才能被利用，而有機氮源營養(yǎng)豐富，除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽以及游離氨基酸之外，還含有少量的糖類、脂肪和生長因子等[21]。因此蛋白胨和棉籽粉比(NH4)2SO4、NH4Cl更有利于重組菌的生長和產(chǎn)酶。

圖5 不同氮源對重組菌產(chǎn)酶的影響Fig. 5 Effects of different nitrogen sources on the production of recombinant enzyme

2.6 誘導劑不同添加時間對重組菌產(chǎn)酶的影響

在確認產(chǎn)酶最佳碳源、氮源種類及其質(zhì)量濃度和種齡的基礎上，考察誘導劑不同添加時間對重組菌產(chǎn)酶的影響。誘導表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠有效地將菌體生長與產(chǎn)酶階段人為地分開，有針對性地為菌體生長和產(chǎn)酶提供最佳環(huán)境[22]。誘導劑添加之前外源基因的表達處于休止狀態(tài)，不會因其表達給菌體的生長帶來負擔，有助于菌體生物量的迅速積累；而在產(chǎn)酶階段可根據(jù)重組酶的特性調(diào)節(jié)溫度、pH值等環(huán)境因素，使蛋白合成的效率最大化。在枯草芽孢桿菌中，木糖被吸收進入細胞后可參與細胞物質(zhì)的合成和能量代謝，但其利用受到木糖操縱子和分解代謝產(chǎn)物阻遏的雙重調(diào)控[22]。因此，在重組菌特定的生長狀態(tài)下添加木糖啟動外源基因的表達，會給菌體的生長和產(chǎn)酶帶來一定的影響。由表5可知，8 h之前添加誘導劑，酶活力和底物轉(zhuǎn)化率逐漸升高，8 h之后添加誘導劑酶活力和底物轉(zhuǎn)化率逐漸降低。

表5 不同誘導劑添加時間對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Table 5 Effects of different inducer addition times on the growth and enzyme production of recombinant Bacillus subtilis

2.7 誘導劑不同質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)酶的影響

在確定誘導劑最佳添加時間后，考察不同質(zhì)量濃度木糖對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響。結果如表6所示，在不添加誘導劑的條件下重組酶完全不表達，這體現(xiàn)出該表達系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌宿主中具有極高的嚴謹性[22-23]。

表6 不同誘導劑質(zhì)量濃度對重組菌產(chǎn)酶的影響Table 6 Effects of different inducer concentrations on the growth and enzyme production of recombinant Bacillus subtilis

由于作為誘導劑的木糖也能被重組菌緩慢利用[22]，因此在一定范圍內(nèi)隨著誘導劑質(zhì)量濃度的提高，重組酶的產(chǎn)量提高，木糖終質(zhì)量濃度為6 g/L時重組酶酶活力達到最大值4.09 U/mL，進一步提升誘導劑質(zhì)量濃度重組酶酶活力開始下降。

3 結 論

目前工業(yè)上主要采用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)海藻糖，其中應用最廣泛的是以麥芽糖為底物的單酶法以及以淀粉為底物的雙酶法。雙酶法以淀粉為原料，在支鏈淀粉酶的協(xié)同作用下以極高得率生產(chǎn)海藻糖，產(chǎn)率可達80%以上。海藻糖合成酶系野生菌株發(fā)酵困難，產(chǎn)率極低，因而基因工程手段中重組工程菌生產(chǎn)海藻糖得到越來越廣泛的應用。本研究構建了3 組不同來源木糖啟動子介導的海藻糖合成酶系重組質(zhì)粒，并對其中酶活力最高的一組進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，5 g/L的甘油和24 g/L的蛋白胨為產(chǎn)酶最適碳源和氮源；誘導劑最佳添加時間為8 h，最佳添加質(zhì)量濃度為6 g/L，優(yōu)化后酶活力最高可達4.09 U/mL。利用重組枯草芽孢桿菌表達的MTSase和MTHase，以麥芽糊精為底物，在不添加支鏈淀粉酶的情況下，60 ℃反應12 h，海藻糖的轉(zhuǎn)化率可達33.57%。很多文獻均報道支鏈淀粉酶的添加能有效提高海藻糖的轉(zhuǎn)化率，陳曉斌等[8]利用普魯蘭酶，將海藻糖的轉(zhuǎn)化率從35.2%提高至78.7%；Mukai等[11]從野生S. acidocaldarius中純化得到MTSase和MTHase，在異淀粉酶的協(xié)同作用下海藻糖轉(zhuǎn)化率達到82.7%，因此后續(xù)工作將從添加支鏈淀粉酶等方面優(yōu)化海藻糖生產(chǎn)工藝。

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Heterologous Expression of Enzymes for Trehalose Synthesis from Sulfolobus acidocaldarius in Bacillus subtilis

WANG Shanying, LI Youran, GU Zhenghua, ZHANG Liang, DING Zhongyang, SHI Guiyang*
(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Trehalose has great potential applications in both the medical and food industries due to its unique properties. Enzymatic transformation is superior to extraction from yeast cells for the industrial production of trehalose. Starch can be transformed into trehalose via maltooligosylterhalose synthase (MTSase) and maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTHase) from Sulfolobus acidocaldarius. In this experiment, we constructed six recombinant expression plasmids harboring the codon-optimized MTSase and MTHase encoding genes from Sulfolobus acidocaldarius, which could be expressed under the control of the xylose operons from Bacillus subtilis, Bacillus megaterium and Bacillus licheniformis. The recombinant plasmids were transformed into Bacillus subtilis, respectively. The effects of different culture conditions on the production of trehalose was investigated and the optimal culture conditions were determined as follows: glycerol concentration as the best carbon source, 5 g/L; peptone concentration as the best nitrogen source, 24 g/L; xylose concentration, 6 g/L; incubation duration, 8 h; and induction temperature, 37 ℃; induction time, 16 h. Experiments carried out under these conditions gave a conversion rate of trehalose of 33.57%. This study has successfully achieved the functional expression of MTSase and MTHase in Bacillus subtilis.

shuttle vector; Sulfolobus acidocaldarius; Bacillus subtilis; inducible expression

10.7506/spkx1002-6630-201621022

Q814

A

1002-6630（2016）21-0124-07

王珊瑛, 李由然, 顧正華, 等. 1株古細菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢桿菌中的誘導表達[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 124-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621022. http://www.spkx.net.cn

WANG Shanying, LI Youran, GU Zhenghua, et al. Heterologous expression of enzymes for trehalose synthesis from Sulfolobus acidocaldarius in Bacillus subtilis[J]. Food Science, 2016, 37(21): 124-130. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621022. http://www.spkx.net.cn

2016-01-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401674）；江南大學自主重點項目（JUSRP51503）

王珊瑛（1990—），女，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵。E-mail：1227283739@qq.com

*通信作者：石貴陽（1963—），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：gyshi@jiangnan.edu.cn