遵義市城區(qū)兒童地中海貧血發(fā)病情況及基因分布分析

陳雪梅,田潤梅,黃美穎,張?jiān)泼?李志,馬一翔，陳艷

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義563000)

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遵義市城區(qū)兒童地中海貧血發(fā)病情況及基因分布分析

陳雪梅,田潤梅,黃美穎,張?jiān)泼?李志,馬一翔，陳艷

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義563000)

目的 調(diào)查遵義市城區(qū)兒童地中海貧血發(fā)病情況,并分析其基因分布。方法 選擇遵義市城區(qū)學(xué)生為研究對(duì)象,共納入2 579名兒童。對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行地中海貧血初篩,根據(jù)篩查結(jié)果,對(duì)可疑地中海貧血患兒進(jìn)行基因診斷,并行基因分析。結(jié)果 2 579名兒童初篩共511例為可疑地中海貧血,男性和女性α地中海貧血、β地中海貧血檢出率無顯著差異(P均>0.05)。221例初篩為可疑α地中海貧血,經(jīng)基因診斷確診54例；290例初篩為可疑β地中海貧血,經(jīng)基因診斷確診90例。α地中海貧血中,--SEA/αα基因型構(gòu)成比最高(66.7%),其次為--SEA/-α3,7基因型(18.5%)；β地中海貧血中,CD41-42(-CTTT)/N基因型最高(36.7%),其次為IVS-2-654(C→T)/N基因型(16.7%)。α地中海貧血基因檢出頻率--SEA等位基因數(shù)最高,檢出頻率76.3%；β地中海貧血CD41-42(-CTTT)的等位基因數(shù)最高,檢出頻率45.2%。結(jié)論 遵義市城區(qū)兒童地中海貧血發(fā)病率較高,基因分布情況復(fù)雜,應(yīng)加強(qiáng)常規(guī)篩查及基因?qū)W診斷。

地中海貧血；兒童；發(fā)病狀況；基因分布；遵義城區(qū)

地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血,與遺傳基因缺陷有關(guān),我國南方發(fā)病率較高[1,2]。輕型地中海貧血可不需要特殊治療,中間型和重型需要給予相應(yīng)治療。了解地中海貧血在本地區(qū)的流行情況,對(duì)預(yù)防和控制具有重要指導(dǎo)意義,而對(duì)地中海貧血攜帶者進(jìn)行基因診斷、篩查等是疾病控制的主要方法[3]。2016年1月1日～5月31日,我們對(duì)遵義市城區(qū)兒童的地中海貧血發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查,并分析基因分布情況?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 以遵義市城區(qū)學(xué)生為研究對(duì)象,共納入2 579名兒童。其中男1 748例、女831例,年齡11～13歲。

1.2 調(diào)查方法 抽取受檢者ACD抗凝血2 mL,將血紅蛋白(Hb)含量調(diào)至10 g/L。采用前以自動(dòng)Hb電泳儀進(jìn)行電泳,出現(xiàn)異?？焖賻У臉?biāo)本,加入pH 6.5磷酸緩沖液電泳,確定HbH或Hb Bart。將確定的標(biāo)本凍存。HbA2<2.5%者結(jié)合紅細(xì)胞形態(tài)、臨床表現(xiàn)、Heniz小體陽性等,定位可疑α地中海貧血；HbF、HbA2水平超過范圍者,結(jié)合臨床表現(xiàn)、紅細(xì)胞形態(tài),定位可疑β地中海貧血；HbF>60%,結(jié)合嚴(yán)重的溶血性貧血、幼年發(fā)病、肝脾腫大等臨床表現(xiàn),調(diào)查家系后,符合者定位β0地中海貧血,其余為β+地中海貧血。采用EDTA抗凝的全血,以DNA快速提取技術(shù)提取地中海貧血患兒的DNA。α地中海貧血缺失基因診斷采用單管多重PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測待檢DNA,總反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件：96 ℃變性15 min,98 ℃ 45 s,64 ℃ 90 s,72 ℃延伸3 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),然后72 ℃延伸5 min。β地中海貧血可疑基因診斷采用PCR-RDB方法檢驗(yàn),β珠蛋白基因擴(kuò)增,生物素標(biāo)記反向點(diǎn)雜交。統(tǒng)計(jì)地中海貧血的檢出率,分析檢出基因型及構(gòu)成比,比較不同性別患兒地中海貧血的檢出率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別可疑地中海貧血檢出率比較 2 579名兒童初篩共511例為可疑地中海貧血,其中可疑α地中海貧血221例、可疑β地中海貧血290例；男性可疑α地中海貧血、β地中海貧血的檢出率分別為8.92%、10.93%,女性分別為7.82%、11.91%,不同性別比較無顯著差異(P均>0.05)。見表1。

2.2 可疑地中海貧血者基因診斷結(jié)果 221例初篩為可疑α地中海貧血,經(jīng)基因診斷確診54例；290例初篩為可疑β地中海貧血,經(jīng)基因診斷確診90例。α地中海貧血中,--SEA/αα基因型構(gòu)成比最高,(66.7%),其次為--SEA/-α3,7基因型(18.5%)。β地中海貧血中,CD41-42(-CTTT)/N基因型最高(36.7%),其次為IVS-2-654(C→T)/N(16.7%)。見表2。α地中海貧血基因檢出頻率--SEA等位基因數(shù)最高,占76.3%；β地中海貧血CD41-42(-CTTT)的等位基因數(shù)最高,占45.2%。見表3。

表1 不同性別可疑地中海貧血檢出情況比較(例)

表2 α地中海貧血及β地中海貧血的基因型分布

3 討論

地中海貧血是遺傳性珠蛋白基因發(fā)生突變、缺失等缺陷導(dǎo)致的一種或者多種珠蛋白肽鏈生物合成減少或者完全不能合成,因此珠蛋白肽鏈間的正常平衡不能維持,同時(shí)正常成人型Hb合成降低的一種遺傳性血紅蛋白病[4,5]。我國長江以南的省份是地中海貧血的高發(fā)區(qū),尤其廣西、廣東、海南、四川等省多發(fā),而貴州也是高發(fā)區(qū)之一。

Hb由血紅素和珠蛋白組成,血紅素包括原卟啉與二價(jià)鐵離子,珠蛋白包括1對(duì)α類肽鏈和1對(duì)非α類肽鏈[6,7]。珠蛋白肽鏈可分為兩大類,α類肽鏈基因定位在16號(hào)染色體上(α,ξ),非α類肽鏈基因定位在11號(hào)染色體上(β,δ,γ,ε)。成人Hb包括HbA(α2β2)、HbA2(α2δ2),胎兒Hb包括HbF(α2γ2),胚胎Hb包括Gower1(ξ2ε2)、Gower2(α2ε2)、Potland(ξ2γ2)。胚胎9周后就會(huì)出現(xiàn)成人型Hb。α、β、及δ肽鏈見于成人正常Hb[8]。根據(jù)肽鏈合成障礙的不同,地中海貧血分為α、β、δβ、γδβ地中海貧血。地中海貧血的發(fā)病機(jī)制：一種或者多種珠蛋白基因缺陷,導(dǎo)致一種或者多種珠蛋白肽鏈合成減少或者缺如,導(dǎo)致其他類型珠蛋白肽鏈相對(duì)過多,珠蛋白肽鏈合成間平衡異常,正常Hb生物合成降低,導(dǎo)致貧血；過多的珠蛋白肽鏈沉積在紅細(xì)胞,導(dǎo)致紅細(xì)胞遭到破壞,出現(xiàn)無效造血和溶血,導(dǎo)致骨髓造血代償性增強(qiáng),可引起肝脾腫大、骨骼病變、腸道鐵吸收增加,加上輸血治療可繼發(fā)性鐵負(fù)荷增多[9,10]。

表3 α地中海貧血及β地中海貧血等位基因分布

α地中海貧血是α珠蛋白基因缺失,導(dǎo)致α肽鏈合成障礙。根據(jù)α珠蛋白基因缺失的程度不同,分為Hb Bart胎兒水腫綜合征、HbH病[11]、標(biāo)準(zhǔn)型α地中海貧血、靜止型α地中海貧血[12]。嚴(yán)重的α地中海貧血可表現(xiàn)為早產(chǎn)、死產(chǎn)或者生后不久死亡,存活患兒可出現(xiàn)嚴(yán)重貧血、黃疸、肝脾腫大、心臟擴(kuò)大、水腫及胸腔、心包、腹腔積液[13]。實(shí)驗(yàn)室檢查,血象顯示小細(xì)胞低色素性貧血,網(wǎng)織紅細(xì)胞升高；骨髓象顯示增生性貧血骨髓象,紅細(xì)胞滲透脆性下降,出現(xiàn)Heinz小體,異丙醇試驗(yàn)陽性；Hb電泳,初生新生兒Hb Bart大約為25%,HbH較少,隨著年齡的增長,Hb Bart下降,而HbH升高,年長兒主要以HbH為主,Hb Bart微量。標(biāo)準(zhǔn)型α地中海貧血臨床無癥狀或者癥狀輕微,無或者僅有輕微的貧血和血常規(guī)改變,容易誤診為低色素營養(yǎng)性貧血。靜止型α地中海貧血可無任何癥狀以及血常規(guī)改變,僅在家系調(diào)查或者臍帶血Hb普查中才發(fā)現(xiàn)。本次研究中可疑α地中海貧血篩查檢出率為8.57%。

β地中海貧血包括β0地中海貧血和β+地中海貧血,前者是β基因突變導(dǎo)致β肽鏈完全不能合成,后者是β基因突變導(dǎo)致β肽鏈部分不能合成[14]。編碼區(qū)移碼突變、起始密碼突變形成無功能mRNA,不能合成正常的β鏈,產(chǎn)生β0地中海貧血。非編碼區(qū)突變影響mRNA的剪切加工過程,形成異常mRNA,不能合成正常β鏈或者合成減少,導(dǎo)致β0或者β+地中海貧血；影響轉(zhuǎn)錄的突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速率下降,mRNA生成減少,產(chǎn)生β+地中海貧血。β珠蛋白基因缺失,導(dǎo)致β0地中海貧血；γ、δ、β基因連鎖在一起,根據(jù)基因缺失長短不同,產(chǎn)生δβ、γδβ地中海貧血[15]。β基因突變有100多種,國內(nèi)常見的有6種。CD41-42(-CTTT)：缺失4個(gè)堿基,導(dǎo)致框架突變,終止密碼提前出現(xiàn),幾乎無β鏈合成,為β0地中海貧血,本次研究中檢出頻率為38.3%。IVS-2-654(C→T)：內(nèi)含子Ⅱ中654位點(diǎn)C→T堿基替換,導(dǎo)致潛在的拼接位點(diǎn)活化,mRNA加工異常,不能翻譯為正常的β鏈。CD17(A→T)：導(dǎo)致終止密碼TAG形成,β鏈不能合成。-28(A→T)：突變位于起始位點(diǎn)上游的啟動(dòng)子TATA盒,轉(zhuǎn)錄效率降低,mRNA生成量減少。CD71-72(+A)：在71和72插入1個(gè)堿基A,造成閱讀框架改變,mRNA不能翻譯為正常β鏈。CD26(G→A)：β鏈26密碼子由G變A,影響mRNA加工,βE mRNA合成減少,β鏈減少。重型β地中海貧血Hb<60 g/L,小細(xì)胞低色素性貧血,易見靶形紅細(xì)胞；骨髓象表現(xiàn)為增生性貧血骨髓象,紅細(xì)胞脆性下降,HbF升高,HbA2正常；X線檢查可見顱骨內(nèi)外板變薄,髓腔增寬,骨小梁增粗?；純撼３Ｐ枰K生輸血,如果不治療,多在5歲前死亡。中間型β地中海貧血,臨床癥狀介于輕型和重型之間,中度貧血,肝脾輕中度腫大,可有黃疸,骨骼變化輕。血象表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血,骨髓象表現(xiàn)為增生性貧血骨髓象,紅細(xì)胞脆性降低,HbF升高,HbA2正常或者升高。患兒可能需要輸血,患者可活至成年甚至老年。輕型β地中海貧血表現(xiàn)為無癥狀或者僅有輕度貧血,可有輕度脾大,大多在家系調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)。血象檢查紅細(xì)胞形態(tài)正?；蛘咻p度改變,紅細(xì)胞脆性正?；蛘呓档?HbA2升高,HbF正常,患者壽命正常。

本研究結(jié)果顯示,α地中海貧血中,--SEA/αα基因型構(gòu)成比最高,其次為--SEA/-α3,7基因型；β地中海貧血中,CD41-42(-CTTT)/N基因型最高,其次為IVS-2-654(C→T)/N。α地中海貧血基因檢出頻率--SEA等位基因數(shù)最高,而β地中海貧血CD41-42(-CTTT)的等位基因數(shù)最高。這與我國的基本情況相似：在我國南方,導(dǎo)致α地中海貧血的分子基礎(chǔ)主要是α珠蛋白基因簇3種大的缺失,包括-α3,7和-α4,2兩種單基因缺失和--SEA(東南亞型缺失),而--SEA在我國最常見。α地中海貧血臨床表現(xiàn)及血液學(xué)陽性指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)型、HbH病篩查結(jié)果陽性率高,而靜止型篩查率較低,說明靜止型在篩查中難以檢出。β地中海貧血患兒輕型表現(xiàn)較多,說明β遵義市城區(qū)是地中海貧血的高發(fā)區(qū),應(yīng)加強(qiáng)婚前檢查、產(chǎn)檢等,同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)篩查強(qiáng)度以及基因診斷,采取有效措施,保障患者健康。

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貴州省科技廳聯(lián)合基金計(jì)劃資助項(xiàng)目(黔科合LH字2015-7447號(hào))。

陳艷(E-mail: cyz600@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.036

R725.5

B

1002-266X(2016)38-0097-03

2016-07-04)