涂容芳， 張秀峰， 何振華

(南華大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科， 湖南 衡陽 421001)

?

5-HTR2B、E-cad、α-SMA在博萊霉素致大鼠肺纖維化中的表達變化*

涂容芳+， 張秀峰+， 何振華△

(南華大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科， 湖南 衡陽 421001)

目的：觀察5-羥色胺2B受體(5-HTR2B)、E-鈣粘素(E-cad)、α-平滑肌蛋白(α-SMA) 在博萊霉素(BLM)致大鼠肺纖維化中的表達變化。方法：健康雄性SD大鼠45只，隨機分為3組(n=15)：對照組、BLM組、潑尼松+BLM組。各組分別于第7、14和28天各處死動物5只，取肺組織，行HE、Masson染色，觀察大鼠肺組織炎癥和纖維化的程度；免疫組化法及逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測肺組織中5-HTR2B、上皮細胞標記物E-cad和間質細胞標記物(α-SMA) mRNA及蛋白的表達水平。結果：BLM組肺組織病理切片HE和Masson染色按時間順序呈現(xiàn)由肺泡炎癥至纖維化的動態(tài)改變。免疫組化及RT-PCR結果顯示肺纖維化大鼠肺組織中5-HTR2B、α-SMA的蛋白及mRNA表達均增加(P<0.05)，28 d時最高；E-cad蛋白及mRNA表達均減弱(P<0.05)，28 d時最低；潑尼松+BLM組，相應時間點5-HTR2B、α-SMA蛋白及mRNA表達有所下降(P<0.05)，E-cad蛋白及mRNA表達不同程度增強(P<0.05)。結論：5-HTR2B可促進大鼠肺纖維化發(fā)生，機制可能與減弱E-cad，促進α-SMA表達，誘導上皮細胞間質轉化(EMT)有關。

5-HT2B受體；肺纖維化；上皮細胞間質轉化；博萊霉素；大鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.020

特發(fā)性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種以反復肺泡上皮/內皮損傷，成纖維細胞(fibroblast,FB)異常增殖轉型和細胞外基質 (extracellular matrix,ECM)大量沉積為主要表現(xiàn)特點的肺間質疾病[1]。其發(fā)病機制與不明原因的上皮/內皮細胞損傷后發(fā)生異常損傷修復有關[2]，且“成纖維細胞灶的形成”是損傷修復的主要標志[3]。關于成纖維細胞灶的形成目前有四種說法，其中EMT占肌成纖維細胞來源的30%以上，是目前研究的熱點[4-6]。5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)亦稱血清素，是一種新近發(fā)現(xiàn)的促纖維化生長因子，其生物學功能主要通過7種不同類型(5-HTlR-5-HT7R)受體及相應14種亞型受體實現(xiàn)，其中與肺組織關系最密切的為5-羥色胺2B受體(5-Hydroxytryptamine 2B receptor,5-HTR2B)。最新研究發(fā)現(xiàn)，5-HTR2B在肺纖維化肺泡上皮細胞特別是II型肺泡上皮細胞上存在高度表達[7]。因此，至于5-HTR2B是否可通過作用于肺泡上皮細胞誘導上皮細胞間質轉化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)，促進肺纖維化發(fā)生值得我們進一步探究。糖皮質激素是目前國內臨床抗肺纖維化使用的比較經(jīng)典的藥物之一[8]，常在肺纖維化作用機制探討研究中被作為治療組[9]。本研究以BLM氣管內注射誘導大鼠肺纖維化，觀察肺組織中5-HTR2B與上皮細胞標記物E-Cad和間質細胞標記物α-SMA的表達變化及關系，探討5-HTR2B在肺纖維化中的作用及其對EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

注射用鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號410102，每支15 mg)；醋酸潑尼松片(天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，每片5 mg，批號1109112)。兔抗Cadherin-Pan及α-SMA多克隆抗體購自ABZOOM公司。鼠抗5-HTR2B單克隆抗體購自BD公司。

1.2 動物分組及纖維化模型的建立

健康雄性SD大鼠45只，體重250～300 g，由南華大學動物實驗部提供，隨機數(shù)字表法分為對照組、BLM組、潑尼松+BLM組(n=15)。BLM組和潑尼松+BLM組各大鼠稱重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5 ml/kg)，仰臥固定于鼠臺上，頸部酒精消毒后逐層分離并暴露氣管，注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，注入博萊霉素生理鹽水溶液(5 mg/kg )，后立即將動物直立并左右旋轉2 min，盡量使藥液均勻分布于肺內，縫合皮膚待動物自然清醒后放置籠內常規(guī)飼養(yǎng)。造模當天開始，對照組、BLM組分別每天給予1%羧甲基纖維素鈉(14 ml/kg)灌胃；潑尼松+BLM組每天灌予醋酸潑尼松甲基纖維素鈉混懸液(0.56 mg/kg)。

1.3 標本的處理及取材

分別在造模第7、14、28天取材，每次各組隨機處死5只大鼠。分離出氣管和雙肺，取左側完整肺葉置于經(jīng)DEPC水處理的4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，做HE、Masson染色及免疫組化，光鏡下觀察肺細胞損傷、膠原纖維增生及蛋白表達情況。取右肺切成小塊保存于DEPC水處理過的EP管中， -80℃冰箱凍存，用于進行RT-PCR測定。

1.4 免疫組化檢測及圖像分析

取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，SP法染色，分別滴加1∶2 500 5-HTR2B Antibody抗鼠單克隆抗體、1∶1 000 兔抗平滑肌多克隆抗體、1∶500 Cadherin-Pan Antibody兔抗多克隆抗體，DAB顯色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡檢。陰性對照采用PBS替代一抗，其余步驟相同。將標本置于鏡下40倍視野，在每張病理切片在染色陽性區(qū)隨機選取6個視野，陽性表達為胞質內呈棕黃色顆粒，在400 倍視野下，采用Motic Image 3.2軟件計算平均光密度值后進行統(tǒng)計學分析。

1.5 RT-PCR法檢測肺組織中各指標mRNA的表達

取肺組織樣品100 mg，將組織剪碎，加入1 ml Trizol，提取肺組織總RNA。采用第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，檢測大鼠肺組織5-HTR2B、E-cad、α-SMA、β-actin 1、β-actin 2的引物均由上海生工生物技術有限公司設計和合成，5-HTR2B序列F1：AGGCTACATGGCCCCTCCCACT及R1：TAGGGACTGGGATGGCGATG，擴增產(chǎn)物長度為222 bp；E-cad序列 F1：AGCCAGACACATTCATGGAAC 及 R1：TGGTTATCCGAGAGCTTGAGA擴增產(chǎn)物長度為351 bp；α-SMA 序列 F1： TTCCTTCGTGACTACTGCTGAG及R1：CAATGAAAGATGGCTGGAAGAG 擴增長度為209 bp；β-actin 1序列F1: TCAGGTCATCACTATCGGCAAT 及R1: AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA擴增長度為432 bp；β-actin 2 序列 F1: CCCATCTATGAGGGTTACGC及R1: TTTAATGTCACGCACGATTTC擴增長度為150 bp。按試劑盒說明書取2×PCR Master-mix 12.5 μl，cDNA 2 μl, 10 μmmol/L的上游、下游引物各1 μl加無酶水配成25 μl PCR反應體系，離心混勻(表1)。

取PCR產(chǎn)物和內參PCR產(chǎn)物按要求加入配制好的含溴化己錠的1.5%瓊脂糖凝膠上，電泳后紫外燈下進行拍照，在凝膠圖像分析系統(tǒng)中計算各組產(chǎn)物的灰度值，目的產(chǎn)物mRNA表達量的半定量結果用兩者的比值表示。

Tab. 1 PCR amplification reaction conditions of genes

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 HE和Masson染色光學顯微鏡觀察

對照組大鼠肺組織結構正常，HE染色未見炎性細胞滲出，Masson染色僅見細支氣管壁周圍及肺泡間隔有少量膠原纖維沉著。BLM組7 d肺組織結構被破壞，肺泡腔出現(xiàn)萎陷變窄，肺泡間隔出現(xiàn)增寬，有少許炎癥細胞浸潤、成纖維細胞增生及藍綠色膠原纖維沉積；14 d肺組織結構破壞加重，更多肺泡腔出現(xiàn)萎陷變窄，肺泡間隔進一步增寬，可見較多炎癥細胞浸潤、成纖維細胞增生及藍綠色膠原纖維沉積；28 d肺組織結構破壞明顯，肺泡腔塌陷融合或消失，肺泡間隔明顯增寬，肺泡炎癥改變有所減輕，但可見大量成纖維細胞增生及藍綠色膠原纖維增生沉積。與BLM組對應時間點相比，潑尼松+BLM組大鼠肺組織在肺泡腔塌陷，肺泡間隔增寬，炎癥細胞浸潤，肺泡結構破壞及膠原纖維沉積等各方面均有不同程度減輕(圖1、圖2，圖1-2見彩圖頁Ⅸ)。

2.2 肺組織5-HTR2B蛋白及mRNA的表達

5-HTR2B主要分布于肺泡上皮細胞。與對照組比較，BLM組大鼠肺組織5-HTR2B蛋白和mRNA在7 d、14 d、28 d時均存在表達增強，以28 d時最明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。潑尼松+BLM組大鼠肺組織5-HTR2B蛋白和mRNA水平在7 d、14 d、28 d時均較BLM組均有不同程度降低(P<0.05)；但較對照組均有不同程度升高(P<0.05)(圖3，表2，圖3見彩圖頁Ⅸ)。

2.3 肺組織E-cad蛋白及mRNA的表達

E-cad表達的范圍與5-HTR2B基本相似，主要分布于肺泡上皮細胞。與對照組相比，BLM 7 d、14 d、28 d時的E-cad蛋白和mRNA含量均存在降低，28 d時達最低，差異有統(tǒng)學意義(P<0.05)；與BLM組對應時間點比較，潑尼松+BLM組7 d、14 d、28 d的E-cad蛋白和mRNA含量較BLM組對應時間點存在不同程度升高(P<0.05)；但與對照組比較有降低(P<0.05，圖4，表3，圖4見彩圖頁Ⅸ)

2.4 肺組織α-SMA蛋白及mRNA的表達

α-SMA主要存在肺間質基質及成纖維細胞中。與對照組比較，BLM組7 d、14 d、28 d時的α-SMA蛋白和mRNA含量均升高，28 d時達最高，差異均有統(tǒng)學意義(P<0.05)；潑尼松+BLM組各時間點的α-SMA蛋白和mRNA含量較BLM組均存在不同程度降低(P<0.05)；但與對照組相比均顯著升高(P<0.05，圖5，表4，圖5見彩圖頁Ⅹ)。

Tab.

A： Control group； B： Bleomycin group； C： Bleomycin +prednisone; 5-HTR2B: 5-Hydroxytryptamine 2B receptor

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsbleomycin group

Tab. 3 Protein and mRNA expression of E-cad in lung tissue of ±s)

A： Control group； B： Bleomycin group； C： Bleomycin +prednisone; E-cad: E-cadherin

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsbleomycin group

Tab. 4 The protein and mRNA expression of α-SMA in lung tissue of ±s)

A： Control group； B： Bleomycin group； C： Bleomycin +prednisone; α-SMA： Alpha-smooth muscle actin

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsbleomycin group

3 討論

目前關于IPF的治療研究已由傳統(tǒng)“抗炎”轉向“抗纖維化”[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)：5-HT是一種致纖維化生長因子，可促進呼吸系統(tǒng)中肺動脈血管、支氣管收縮，刺激多種細胞等生長，誘導肺血管和/或呼吸道發(fā)生組織重建，導致肺纖維化形成[11]。繼Eickelberg工作組報道發(fā)現(xiàn)5-HTR2B在IPF及非特異性間質性肺炎患者中表達增強后，Melanie[12]等運用RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)肺纖維化實驗模型和肺纖維化患者5-HT2RB mRNA水平均顯著升高，Svejda[13]等在體外細胞培養(yǎng)實驗中也發(fā)現(xiàn)5-HTR2B拮抗劑特麥角脲(terguride)或SB 204741可有效降低TGF-β誘導纖維母細胞產(chǎn)生的膠原蛋白水平。因此G蛋白偶聯(lián)受體5-HTR2B被認為是抗纖維化治療潛在靶點。本實驗首次利用免疫組化和RT-PCR方法檢測大鼠肺組織5-HTR2B蛋白及mRNA的表達。結果發(fā)現(xiàn)5-HTR2B在肺泡上皮細胞中存在表達。根據(jù)中華醫(yī)學會呼吸病學分會特發(fā)性肺間質纖維化診斷和治療指南，糖皮質激素是抗纖維化治療中推薦藥物[14]，其中醋酸潑尼松片在臨床抗肺纖維化中常被使用。本實驗以潑尼松+BLM為治療組，發(fā)現(xiàn)潑尼松治療后各組5-HTR2B蛋白及mRNA水平存在不同程度的下降。由此進一步證實，5-HTR2B與肺纖維化發(fā)生密切相關，是促纖維化發(fā)生的重要因子。

5-HTR2B可調節(jié)血管縮舒、促進炎癥發(fā)生、參與組織修復，是近年來被提出的抗纖維化治療靶點[15]。其發(fā)生機制可能與增強纖維化微環(huán)境中TGF-β、CTGF、纖溶酶原激活物抑制劑-1等細胞因子表達，促進成纖維細胞、上皮或內皮等多種來源肌成纖維細胞增殖、轉型、收縮，分泌大量細胞外基質蛋白有關[16]。Clara等[17]實驗發(fā)現(xiàn)5-HT與5-HTR2B結合后可通過激活TGF-β/Smad信號促進表皮纖維母細胞分泌大量細胞外基質蛋白。Konigshoff等[18]檢查發(fā)現(xiàn)肺纖維化患者肺組織中存在5-HTR2B的高度表達，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)使用相應拮抗劑后，TGF-β表達水平顯著下降，進一步證明5-HT/5-HTR2B /TGF-β軸的存在。

TGF-β是目前公認的最主要致纖維化細胞因子，除作用于成纖維細胞外，還是誘導EMT過程的關鍵因素。EMT是指已完全分化的上皮細胞經(jīng)歷細胞表型改變轉化成完全分化的間質細胞(通常指成纖維細胞和肌纖維母細胞)的過程。Ruiz[19]等研究發(fā)現(xiàn)5-HTR2B在纖維化肺組織肺泡上皮細胞中存在高度表達。有學者進一步研究發(fā)現(xiàn)5-HT與5-HTR2B結合后通過Ras/MAPK(絲裂素活化蛋白激酶)途徑促進細胞有絲分裂的同時可啟動下游TGF-β分子促進纖維化發(fā)生，而Ras和TGF-β分子已在實驗中被證實是EMT過程發(fā)生不可或缺的分子。于是我們大膽推測5-HTR2B受體可能為TGF-β介導的EMT的上游分子，即受損肺組織微血管中過量產(chǎn)生的5-HT可通過與上皮細胞上相應的5-HTR2B結合，在TGF-β作用下誘導上皮細胞喪失原有細胞表型(如上皮特異性的表型標記物E-cad)轉變?yōu)閾碛虚g質特征(如α-SMA)的肌成纖維細胞，與此同時獲得遷移、侵襲能力，在受損肺泡基底膜處聚集，形成“成纖維細胞灶”促進細胞外基質過量分泌和肺纖維化的發(fā)生。本實驗研究結果顯示：BLM致大鼠肺纖維化模型中，5-HTR2B和E-cad表達的范圍基本相似，主要分布于肺泡上皮細胞。E-cad的表達量和5-HTR2B表達量相反，E-cad在正常肺組織中表達較多，在BLM致大鼠肺纖維化模型中隨纖維化程度加重而表達逐漸減少；而5-HTR2B和α-SMA都隨著肺纖維化程度增加而逐漸增加。但兩者表達的區(qū)域不完全相同，5-HTR2B 主要存在肺泡上皮細胞中，而α-SMA主要存在肺間質基質及成纖維細胞中；且使用激素干預后可出現(xiàn)相反的結果。通過以上結果我們推測5-HTR2B促纖維化機制可能與減低E-cad的表達，促進α- SMA的表達，誘導EMT發(fā)生有關。故5-HTR2B可參與BLM致肺纖維化發(fā)生，機制之一可能與誘導 EMT 發(fā)生有關。

肺纖維化預后差，病死率高，嚴重危害人類健康，目前除了肺移植，尚無有效治療措施。深究5-HT/5-HTR2B信號通路，不僅可進一步闡述肺纖維化發(fā)生機制，還可為新型抗纖維化藥物的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。

[1] Wynn TA. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis[J].JExpMed, 2011, 208(7): 1339-1350.

[2] Wynn TA. Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various-fibroproliferative-diseases[J].JClinInvest, 2007, 117(3): 524-529.

[3] Gharaee-Kermani M, Gyetko MR, Hu B,etal． New insights into the pathogenesis and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis: A potential role for stem cells in the lung parenchyma and implications for therapy [J]．PharmRes, 2007, 24(5): 819-841.

[4] Willis BC, duBois RM, Borok Z. Epithelial origin of myofibroblasts during fibrosis in the lung[J].ProcAmThoracSoc, 2006, 3(4): 377-382.

[5] Hashimoto N,Phan SH, Imaizumi K，etal. Endothelial mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]．AmJRespirCellMolBiol, 2010, 43(2): 161-172.

[6] Piera-Velazquez S, Li Z, Jimenez SA. Role of Endothelial-mesenchymal transition (EMT)in the pathogenesis of fibrotic disorders [J]．AmJPathol, 2011, 179(3): 1074-1080.

[7] Thrall RS, Barton RW, D′Amato DA,etal. Differential cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid obtained at various stages during the development of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat[J].AmRevRespirDis, 1982, 126(3): 488-492.

[8] 秦 靜， 趙銘山. 丹參素干預對肺纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號通路的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2013， 29(5): 937-940.

[9] 陳 寶, 李惠萍. 三氧化二砷對博萊霉素致大鼠肺纖維化的影響及其作用機制[J]. 中國病理生理雜志， 2010, 26(5): 858-864.

[10]Graham JR. Cardiac and pulmonary fibrosis during methysergide therapy for headache[J]．TransAmClinClimatolAssoc, 1967， 78: 79-92.

[11]Nebigil CG, Launay JM, Hickel P,etal. 5-Hydroxytryptamine 2B receptor regulates cell-cycle progression: Cross-talk with tyrosine kinase pathways[J].ProcNatlAcadSciUSA， 2000， 97(6): 2591-2596.

[12]K?nigshoff M, Dumitrascu R, Udalov S,etal. Increased expression of 5-hydrox ytryptamine 2A/B receptors in idiopathic pulmonary fibrosis: a rationale for therapeutic intervention [J]．Thorax， 2010, 65(11): e949-955.

[13]Svejda B, Kidd M, Giovinazzo F,etal． The 5-HT(2B) receptor plays a key regulatory role in both neuroendocrine tumor cell proliferation and the modulation of the fibroblast component of the neoplastic microenvironment[J].Cancer, 2010, 116(12): 2902-2912.

[14]中華醫(yī)學會呼吸病學分會. 特發(fā)性肺間質纖維化診斷和治療指南草案[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學, 2003, 15(2)： 129-130.

[15]Mann DA, Oakley F. Serotonin paracrine signaling in tissue fibrosis[J]．BiochimBiophysActa, 2013, 1832(7): 905-910.

[16]Launay JM, Hervé P, Callebert J,etal. Serotonin 5-HT2B receptors are required for bone-marrow contribution pulmonary arterial hypertension [J]．Blood, 2012, 119(7): 1772-1780.

[17]Dees C, Akhmetshina A, Zerr P,etal. Platelet-derived serotonin links vascular disease and tissue fibrosis[J].JExpMed, 2011, 208(5): 961-972.

[18]K?nigshoff M, Dumitrascu R, Udalov S,etal． Increased expression of 5-hyd roxytryptamine 2A/B receptors in idiopathic pulmonaryfibrosis: a-rationale-for-the-rapeutic-intervention[J].Thorax, 2010, 65(11): 949-955.

[19]Ruiz-Perez MV, Sanchez-Jimenez F, Quesada AR,etal. A re-evaluation of the mitogenic effect of serotonin on vascular endothelial cells[J].JBiolRegulHomeostAgents, 2011， 25(1): 13-20.

The expression of 5-HTR2B、E-cad、α-SMA in the pulmonary fibrosis in rats

TU Rong-fang+, ZHANG Xiu-feng+, HE Zhen-hua△

(Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001， China)

Objective: To observe the expression of 5-Hydroxytryptamine 2B receptor (5-HTR2B)、E-cadherin (E-cad)、alpha-smooth muscle actin(α-SMA) in the bleomycin -induced pulmonary fibrosis tissue of rats. Methods: Forty-five healthy male SD rats were randomly divided into control group，bleomycin group and bleomycin +prednisone group(n=15)． Five rats in each group randomly sacrificed at the 7th、the 14thand the 28thday after eastablishing models． The lung tissue was observed by microscope in HE and Masson staining． Lung hydroxyproline (HYP) content was evaluated． The expression of protein and mRNA of 5-HTR2B, E-cad and α-SMA were analyzed by immunohistochemistry and/or RT-PCR． Results: A dynamic changes from alveolitis to pulmonary fibrosis could be observed in the slices by HE and Masson staining. The experimental results by immunohistochemistry and RT-PCR showed that the protein and mRNA expression of 5-HTR2B and a-SMA enhanced rat pulmonary fibrosis (P<0.05)and reached the highest at the 28thday； the corresponding protein and mRNA expression of E-cad reduced (P<0.05)， and reduced to the lowest value at the 28thday． Compared with bleomycin group， the corresponding mRNA and protein expression of 5-HTR2B and a-SMA in bleomycin+prednisone group had decreased (P<0.05)； however， the corresponding mRNA and protein expression of E-cad had increased(P<0.05)． Conclusion: 5-HTR2B is involved in the pathogenesis of pulmonary fibrosis throught epithelial- mesenchymal transition (EMT)．

5-HTR2B； pulmonary fibrosis； epithelial-mesenchymal transition； bleomycin; rat

2015-06-04

2016-03-04

+： 共同第一作者

R73-3

A

1000-6834(2016)04-365-07

△【通訊作者】Tel： 13974755267； E-mail： 1425271618@qq.com.