司藝玲， 張金英， 鄧子輝， 薛 輝， 顏光濤

(解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)研究室， 北京 100853)

?

瘦素對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)元凋亡的影響*

司藝玲， 張金英， 鄧子輝， 薛 輝， 顏光濤△

(解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)研究室， 北京 100853)

目的：研究Leptin在腦缺血性損傷神經(jīng)元凋亡中的作用及其機(jī)制。方法：將75只雄性昆明小鼠完全隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組、缺血/再灌注模型組、Leptin干預(yù)組；通過大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)復(fù)制小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，Leptin干預(yù)組在缺血0 min腹腔注射Leptin(1 μg/g體重)，TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡，RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2和caspase-3 mRNA表達(dá)，免疫組化凋亡相關(guān)基因bcl-2和caspase-3 蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果：模型組腦缺血中心區(qū)神經(jīng)元以壞死為主，與假手術(shù)組相比，其半影區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著增多、促凋亡基因caspase-3和抑凋亡基因bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，Leptin干預(yù)組半影區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著減少、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，抑凋亡基因bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)論：Leptin能夠通過上調(diào)抑凋亡基因bcl-2表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因caspase-3表達(dá)抑制神經(jīng)元凋亡，在腦缺血性損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

瘦素；腦缺血；神經(jīng)元；凋亡；神經(jīng)保護(hù)；小鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.005

瘦素(leptin)是由ob基因編碼的一種脂源性多肽分子，在機(jī)體的能量調(diào)節(jié)方面具有重要作用。然而越來越多的證據(jù)也表明，Leptin與腦發(fā)育關(guān)系密切，嚙齒類動(dòng)物出生第二周Leptin水平就顯著升高，此時(shí)Leptin并不是作為能量調(diào)節(jié)因子在起作用，而是作為營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)下丘腦攝食控制環(huán)路的發(fā)育[1-4]。此外，大腦皮層、海馬、神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和運(yùn)動(dòng)能力均需要Leptin存在，Leptin缺陷的ob/ob小鼠腦組織較小，而且髓磷脂水平顯著降低，給予外源性Leptin后可明顯增加腦的重量、糾正神經(jīng)發(fā)育的缺陷[5,6]。近年來，Leptin在腦缺血性損傷中的作用引起關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Leptin在腦缺血性損傷后能夠通過修復(fù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)而間接發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]，但是，Leptin對(duì)于受損神經(jīng)元是否具有直接修復(fù)作用，目前尚未見有研究報(bào)道。因此，本文擬建立復(fù)制小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，研究Leptin在腦缺血性損傷神經(jīng)元凋亡中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康昆明小鼠75只，雄性，體重20～25g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自由飲食，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。將75只小鼠完全隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組、缺血/再灌注模型組、腹腔給予Leptin組，每組25只。

1.2 主要試劑

小鼠Leptin(mLeptin)購(gòu)自美國(guó)PEPROTECH公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TUNEL原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Promega公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；2×PCR Master Mix 購(gòu)自北京天根生化技術(shù)有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；羊血清、SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PubMed GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的小鼠bcl-2、caspase-3和β-actin cDNA序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列、產(chǎn)物大小及擴(kuò)增條件見表1。

Tab. 1 The primer sequences of bcl-2, caspase-3 and β-actin

1.4 小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的制備及處理方法

用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(80 mg/kg體重)麻醉小鼠，采用改良的Longa線栓法[8]制備MCAO模型：分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小口(距頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處約0.5 cm)，用眼科鑷夾取適當(dāng)直徑的尼龍栓線沿切口插入，輕輕提起頸外動(dòng)脈，以便于栓線順利進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)栓線順利進(jìn)入約1.5 cm時(shí)遇阻力即為進(jìn)入顱內(nèi)，結(jié)扎固定栓線后縫合皮膚，關(guān)閉切口，將栓線的尾端暴露在皮外。腦缺血2 h后輕輕回拉栓線1 cm，使頭端撤回頸總動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)再灌注。入選標(biāo)準(zhǔn)：小鼠清醒2 h后參照Longa等[8]方法進(jìn)行評(píng)分，評(píng)為1～3分而且解剖取腦時(shí)未發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。 Leptin干預(yù)組于栓線插入正確位置時(shí)(即缺血0 min)腹腔注射Leptin(1 μg/g體重)，模型組腹腔注射等體積PBS作為對(duì)照，假手術(shù)組僅插入線栓0.5 cm。

1.5 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)

每組分別取小鼠5只，缺血2 h再灌注24 h后麻醉小鼠，開胸剪破右心耳，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水(含肝素0.4%)30 ml，4%多聚甲醛30 ml，立即取腦，置4%多聚甲醛中固定2 h，在額極后5 mm處取2 mm厚冠狀切片，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，根據(jù)HE染色結(jié)果判定缺血梗死灶部位并進(jìn)行切片。切片用雙蒸水洗滌，5 min×3次；滴加3%H2O2，50 μl，室溫處理10 min，雙蒸水洗2 min×3次；加0.01 mol/L TBS 1∶200 新鮮稀釋的蛋白酶K，50 μl，37℃消化15 min，雙蒸水洗2 min×3次；加標(biāo)記緩沖液20 μl，室溫放置15 min；分別取1 μl寡核苷酸末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)及地高辛標(biāo)記的(DIG-dUTP)加至18 μl標(biāo)記緩沖液中，混勻；甩掉切片上的標(biāo)記緩沖液，加上上述混合標(biāo)記液，20 μl，37℃ 濕盒中孵育2 h，0.01 mol/L TBS 洗2 min×3 次；加封閉液50 μl，室溫30 min，甩去液體；用封閉液1∶100 稀釋生物素化抗地高辛抗體，加至標(biāo)本片上，50 μl，37℃濕盒中反應(yīng)30 min，0.01 mol/L TBS 洗2 min×3 次；取SABC 加至切片，37℃反應(yīng)30 min，0.01 mol/L TBS 洗5 min×4 次； DAB顯色，水洗，蘇木素輕度復(fù)染；常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

顯微鏡觀察，細(xì)胞核呈棕褐色顆粒者為TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling)陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片各取5個(gè)相互不重疊的高倍視野(10×40)，計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性率。

1.6 RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2、caspase-3的表達(dá)

每組分別取小鼠15只(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組5只)，分別于缺血2 h再灌注12 h、24 h、36 h頸椎脫臼處死小鼠、迅速取腦，按照Promega公司Trizol說明書提取缺血側(cè)腦組織總RNA，RNA純度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求。cDNA第一鏈的合成按Invitrogen公司試劑盒操作，然后以cDNA第一鏈為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得bcl-2、caspase-3和β-actin目的片段，PCR反應(yīng)條件見表2。

取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用Gel-Pro Imager Kit成像系統(tǒng)拍照，半定量分析產(chǎn)物的累積光密度值(IOD)，與內(nèi)參照β-actin比較的相對(duì)光密度值(relative OD)來評(píng)定表達(dá)水平。

Tab. 2 The parameter of polymerase chain reaction

1.7 免疫組化檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)

各組分別取小鼠5只，缺血2 h再灌注24 h后麻醉小鼠，按照1.5方法處死并處理腦組織標(biāo)本。根據(jù)HE染色結(jié)果判定缺血梗死灶部位并進(jìn)行切片，按試劑盒說明書采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3% H2O2，室溫10 min，雙蒸水洗3 min×3 次， 微波修復(fù)抗原；滴加5%BSA 血清封閉液，室溫20 min；分別滴加PBS 1∶200～1∶300稀釋的一抗(兔抗小鼠caspase-3、Bcl-2 IgG)，37℃孵育120 min，PBS洗2 min×3 次；分別滴加PBS 1∶2 000稀釋的二抗(生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG)，37℃孵育20 min，PBS洗2 min×3 次；滴加試劑SABC，37℃ 反應(yīng)20 min，PBS洗5 min×4 次；DAB顯色, 蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。

顯微鏡觀察，胞漿著色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)4.0(北京航空航天大學(xué))測(cè)定平均光密度值，進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元凋亡(TUNEL染色)

凋亡神經(jīng)元呈核固縮、濃染的棕褐色顆粒(圖1，圖1見彩圖頁(yè)Ⅴ)。假手術(shù)組僅見少量TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞；模型組TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞與假手術(shù)組相比明顯增多(P<0.01)，凋亡細(xì)胞主要分布于缺血梗死灶周邊區(qū)(即半影區(qū))，在缺血中心區(qū)較少；Leptin干預(yù)組凋亡細(xì)胞較模型組顯著減少(P<0.01，表3)。

GroupApoptosisnumberPositivepercentage(%)Sham1．00±0．004．40±0．00Model12．83±1．77??68．60±5．79??Leptininterven?tion7．38±1．36##42．30±8．45##

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsmodel group

2.2 小鼠腦組織凋亡相關(guān)基因bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)產(chǎn)物分析

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，bcl-2、caspase-3 所對(duì)應(yīng)的條帶大小正確；對(duì)各組條帶進(jìn)行光密度值分析，結(jié)果顯示模型組再灌注各時(shí)間點(diǎn)抑凋亡基因bcl-2、促凋亡基因caspase-3表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組相比，Leptin干預(yù)組caspase-3表達(dá)水平于再灌注12 h、24 h兩個(gè)時(shí)間注點(diǎn)顯著降低(P<0.01, 圖3)，而抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)于再灌注24 h、36 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著增強(qiáng)(P<0.01，圖4)。

Fig. 2 Amplification of apoptosis related gene bcl-2 and caspase-3 by RT-PCR

M: DL2000 Marker; 1,4,7: Sham group after reperfusion 12 h, 24 h, 36 h; 2,5,8: Model group after reperfusion 12 h, 24 h, 36 h; 3,6,9: Leptin intervention group after reperfusion 12 h, 24 h, 36 h

Fig. 3 Effect of leptin on mRNA expression of promo-apoptosis gene caspase-3

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsmodel group

Fig. 4 Effect of leptin on mRNA expression of anti-apoptosis gene bcl-2

*P<0.05，**P<0.01vssham group;##P<0.01vsmodel group

2.3 腦缺血半影區(qū)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)

假手術(shù)組有少量Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)，模型組缺血半影區(qū)Bcl-2和Caspase- 3蛋白表達(dá)光密度值較假手術(shù)組顯著增加(P<0.01)；Leptin干預(yù)組Caspase-3蛋白較模型組則顯著減少，但是Bcl-2蛋白表達(dá)則顯著高于模型組(P<0.01，表4，圖5，圖5見彩圖頁(yè)Ⅴ)。

GroupBcl?2expressionCaspase?3expressionSham0．35±0．010．37±0．03Model0．51±0．04??0．57±0．05??Leptinintervention0．76±0．09##0．45±0．04??##

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsmodel group

3 討論

腦缺血后受損神經(jīng)元最終以壞死和凋亡兩種形式死亡，在腦缺血急性期，神經(jīng)元壞死與凋亡并存，缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速壞死，缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡被啟動(dòng)；而腦缺血的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期，則以細(xì)胞凋亡為主。因此，大量研究認(rèn)為，凋亡可能決定了缺血腦組織最終的梗死體積，針對(duì)凋亡環(huán)節(jié)的干預(yù)可減輕缺血/再灌注損傷程度，改善卒中的預(yù)后[9-11]。

本研究通過TUNEL染色觀察凋亡神經(jīng)元形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)MCAO模型小鼠損傷側(cè)腦組織缺血中心區(qū)主要以細(xì)胞壞死為主，周圍的半影區(qū)存在較多的神經(jīng)元凋亡，而Leptin干預(yù)組缺血半影區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著減少，提示Leptin的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抗凋亡作用有關(guān)。

腦缺血損傷引起細(xì)胞凋亡機(jī)制非常復(fù)雜，受到多種凋亡相關(guān)基因及蛋白的調(diào)控，其中研究較多的有caspase-蛋白酶家族和bcl-2基因家族等。caspase-蛋白酶即半胱氨酸-天冬氨酸特異性的蛋白酶，是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路，即凋亡的核心所在，各種引起細(xì)胞凋亡的因素，如Fas、P53等均須激活caspase才能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，caspase家族中的caspase-3被認(rèn)為是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，caspase-3水平可間接反映細(xì)胞凋亡程度，對(duì)caspase-3的干預(yù)可減少凋亡的發(fā)生；另一方面，bcl-2基因家族中的bcl-2具有抑制凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活的作用[12-14]。因此，細(xì)胞是否發(fā)生凋亡, 依賴于caspase-3和bcl-2表達(dá)水平的相對(duì)濃度。

為探討Leptin在腦缺血/再灌注損傷中的抗凋亡機(jī)制，本研究檢測(cè)了在Leptin干預(yù)下，凋亡相關(guān)基因bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組再灌注12 h bcl-2、caspase-3在mRNA水平均存在微量表達(dá)，再灌注24 h、36 h明顯減弱，可能為機(jī)體對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷的一過性應(yīng)激反應(yīng)所致；模型組腦組織bcl-2、caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高，Leptin干預(yù)組bcl-2 mRNA表達(dá)水平較模型組進(jìn)一步升高，caspase-3 mRNA表達(dá)水平較模型組顯著降低，此趨勢(shì)于再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)最為顯著。我們通過免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步分析Leptin對(duì)Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平的影響，得出的結(jié)論與mRNA表達(dá)水平一致，提示Leptin可通過抑制促凋亡基因caspase-3的表達(dá)活化、誘導(dǎo)抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)，從而抑制腦缺血性損傷誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活。

目前在腦缺血/再灌注損傷模型中針對(duì)Leptin和凋亡相關(guān)基因之間的關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，本研究初步明確了Leptin通過抑制促凋亡基因caspase-3表達(dá)活化、誘導(dǎo)抑凋亡基因bcl-2表達(dá)，在腦缺血性損傷中發(fā)揮抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。此結(jié)果與McGaffin KR等[15]在心臟缺血/再灌注模型中的研究結(jié)果一致，他們觀察到Leptin在小鼠心肌梗死模型中可通過STAT-3信號(hào)途徑上調(diào)bcl-2和survivin(存活素)基因表達(dá)水平、下調(diào)caspase-3表達(dá)水平，從而起到心肌保護(hù)的作用。雖然對(duì)Leptin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的詳細(xì)過程尚不十分清楚，但是越來越多的研究證據(jù)支持Leptin在損傷修復(fù)過程具有重要作用，提示其可能作為一個(gè)核心，以細(xì)胞能量調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)，以復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)方式發(fā)揮著保護(hù)作用。

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The effects of leptin on neuron apoptosis in mice with cerebral ischemia/reperfusion injury

SI Yi-ling, ZHANG Jin-ying, DENG Zi-hui, XUE Hui, YAN Guang-tao△

(Research Laboratory of Biochemistry, Basic Medical Institute, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)

Objective: To study the effect of leptin on neuron apoptosis in mice with cerebral ischemia injury. Methods: Seventy-five male Kuming mice were randomly divided into 3 groups: sham, model and leptin intervention group, respectively. Focal cerebral ischemia/reperfusion injury model in mice was established by middle cerebral artery occlusion. Leptin intervention group was injected with leptin (1 μg/g weight, I.P.) at 0 min of ischemic injury. Neuron apoptosis was detected by TUNEL staining. The mRNA expression of apoptosis relative gene bcl-2 and caspase-3 were detected by RT-PCR. The protein expression of bcl-2 and caspase-3 were detected by immunohistochemistry. Results: In model group, most of the neurons in the central area of cerebral ischemia had necrosis obviously, and the amount of neuron apoptosis was much higher than that in sham group (P<0.01). Compared with sham group, both expression of pro-apoptosis gene caspase-3 and anti-apoptosis gene bcl-2 increased significantly in model group (P<0.01). Compared with model group, the amount of neuron apoptosis and expression level of caspase-3 were decreased significantly (P<0.01), whereas the mRNA and protein expression of bcl-2 were increased significantly in leptin intervention group (P<0.01). Conclusion: Leptin could reduce neuron apoptosis through down-regulation the expression of caspase-3 and up-regulation the expression of bcl-2. It suggests that leptin could play a neuroprotective role in cerebral ischemia injury.

leptin; cerebral ischemia; neuron; apoptosis; neuroprotection; mice

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30670821)

2015-11-04

2016-04-05

R743.310

A

1000-6834(2016)04-305-06

△【通訊作者】Tel： 010-66937027； E-mail： yan301@263.net