奉水東， 伍 迪， 楊絲絲， 何劍琴， 張愷芳， 凌宏艷Δ

(1. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室， 2. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

?

檳榔堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

奉水東1+， 伍 迪2+， 楊絲絲2， 何劍琴2， 張愷芳2， 凌宏艷2Δ

(1. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室， 2. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的：觀察檳榔堿對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法：采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度(0、10、30、50、100、300、500 μmol/L)檳榔堿對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響，Hoechst 33342染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)Bax，Bcl-2和P53蛋白表達(dá)。結(jié)果：低濃度(0、10、30、50 μmol/L)檳榔堿不影響細(xì)胞的增殖和凋亡；而高濃度(100、300、500 μmol/L)檳榔堿呈濃度依賴性抑制MCF-7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡、提高P53和Bax蛋白表達(dá)、降低Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)論：高濃度檳榔堿抑制MCF-7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與提高P53和Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

檳榔堿；MCF7細(xì)胞；增殖；凋亡

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.021

乳腺癌是嚴(yán)重危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升。當(dāng)前，對(duì)乳腺癌的治療主要是手術(shù)治療、輔以化療，但輔助化療常會(huì)出現(xiàn)許多不良反應(yīng)。因此，尋找高效、特異和低毒的抗腫瘤藥物是腫瘤防治研究中的重要課題。天然植物由于來(lái)源廣泛、類型多樣、不良反應(yīng)小，具有開發(fā)為化療藥物增效減毒輔助藥物的潛力備受關(guān)注。檳榔堿(arecoline)是從天然植物檳榔中提取的生物堿，研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿具有殺菌、抗血栓形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善2型糖尿病大鼠糖、脂代謝紊亂和肝臟胰島素抵抗等作用[1-3]；檳榔堿也可通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡參與口腔黏膜下纖維性變的發(fā)生[4]，但檳榔堿是否影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究觀察不同濃度檳榔堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步探討作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，檳榔堿、MTT和Hoechst 33342染料均購(gòu)于Sigma公司，抗Bax、Bcl-2和P53抗體購(gòu)于Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將第7代人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的L-DMEM 培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè) 采用MTT法，將MCF-7細(xì)胞按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積100 μl，待細(xì)胞長(zhǎng)到50%～60% 融合時(shí)更換無(wú)血清的DMEM同步化24 h后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，然后加入不同濃度的檳榔堿處理，使其終濃度分別為0、10、30、50、100、300、500 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理24 h和48 h后，棄含藥物培養(yǎng)液，每孔分別加入新鮮培養(yǎng)液180 μl置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡30 min，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)液倒盡吸干，每孔加入150 μl DMSO，37℃振蕩15 min，在酶標(biāo)儀上選擇570 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光密度值。按下式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組平均OD-實(shí)驗(yàn)組平均OD 值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.2.3 Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Hoechst 33342染色法，將MCF-7細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，然后分別加入不同濃度的檳榔堿(0、10、30、50、100、300、500 μmol/L)處理48 h后。棄含藥物培養(yǎng)液，加入終濃度為10 μg/ml的Hoechst 33342熒光染料至藥物處理后的細(xì)胞中，37℃ 孵育20 min，用PBS清洗2次后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析MCF-7細(xì)胞凋亡率 不同濃度的檳榔堿(0、10、30、50、100、300、500 μmol /L)處理MCF-7細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞。按照Annex in-FITC/PI法流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將樣品1 500 r/min 離心10 min，棄上清，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1×106/ml，取195 μl細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl AnnexinV-FITC，輕輕混勻后間隔3 min，再加入10 μl 20 μg/ml PI 溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min， 加入300 μl結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，在流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞Bax，Bcl-2和P53蛋白的表達(dá) 將MCF-7細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，然后分別加入不同濃度的檳榔堿(0、100、300、500 μmol/L)處理48 h后，提取蛋白質(zhì)并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取蛋白樣品30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 轉(zhuǎn)膜、封閉、加入抗P53, Bax及Bcl-2抗體孵育，洗滌后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 檳榔堿對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

給予不同濃度的檳榔堿(10、30、50、100、300、500 μmol/L)處理MCF-7細(xì)胞24 h后，生長(zhǎng)抑制率結(jié)果顯示：低濃度(10、30、50 μmol/L)檳榔堿可促進(jìn)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)，但與對(duì)照組(0 μmol/L)相比無(wú)顯著性差異；而高濃度(100、300、500 μmol/L)檳榔堿呈濃度依賴性抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至48 h 時(shí)，高濃度的檳榔堿對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯，且呈劑量依賴效應(yīng)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1)。

GroupGrowthinhibitionrate(%)24h48hControl 0 010μmol/L2．7±0．83．2±1．130μmol/L4．4±1．25．7±1．650μmol/L6．3±2．18．9±3．2100μmol/L16．6±3．3??24．6±4．1??300μmol/L30．5±3．9??52．5±4．5??500μmol/L42．8±6．2??70．3±7．2??

**P<0.01vscontrol group

2.2 檳榔堿對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色和流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：低濃度(10、30、50 μmol/L)檳榔堿不影響細(xì)胞凋亡，高濃度(100、300、500 μmol /L)檳榔堿呈濃度依賴性促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡(P<0.05,P<0.01,圖1、表2)。Hoechst 33342染色顯示：凋亡的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核染色質(zhì)聚集、致密、濃染、熒光增強(qiáng)、細(xì)胞核染色質(zhì)固縮或碎裂成2塊以上。隨后我們選擇(0、100、300、500 μmol /L)檳榔堿濃度進(jìn)行機(jī)制分析。

Fig. 1 Effects of different concentration of arecoline on the nuclear morphology of MCF-7

A，B，C，D，E，F(xiàn)，G is 0，10，30, 50、100、300、500 μmol/L arecoline group

GroupCellapoptosisrate(%)Control2．98±0．3610μmol/L3．27±0．3330μmol/L3．65±0．2950μmol/L4．26±0．35100μmol/L21．53±0．46?300μmol/L45．21±0．53??500μmol/L53．47±0．69??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 檳榔堿對(duì)MCF-7細(xì)胞P53, Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，高濃度(100、300、500 μmol/L)檳榔堿可提高M(jìn)CF-7細(xì)胞P53, Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá) (圖2,表3)。

Fig. 2 Effects of arecoline on protein level of P53，Bax and Bcl-2 of MCF7 cells

1: Control group; 2: 100 μmol/L group; 3: 300 μmol/L group; 4: 500 μmol/L group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 討論

腫瘤無(wú)限制增生的惡性生物學(xué)特征與腫瘤細(xì)胞凋亡減少有關(guān)，增加腫瘤細(xì)胞凋亡是一種有效治療手段。中藥治療腫瘤以其低毒性，有一定的療效而日益引起人們的重視。檳榔堿是從中藥檳榔果中提取出的單體生物堿，具有驅(qū)蟲、促消化、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用。也有研究顯示檳榔堿可通過(guò)誘導(dǎo)DNA 損傷斷裂、阻滯細(xì)胞周期、調(diào)控凋亡基因等作用而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。但檳榔堿是否對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)MTT分析、Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)觀察這一現(xiàn)象，結(jié)果顯示：高濃度的檳榔堿可抑制MCF-7增殖，促進(jìn)凋亡。為進(jìn)一步探討檳榔堿的作用機(jī)制，我們檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Bcl-2基因家族是目前較為公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因，其中Bcl-2在細(xì)胞受到外界刺激時(shí)可延長(zhǎng)細(xì)胞周期、保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，而Bax在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，發(fā)揮著重要的樞紐作用[6]。P53基因?yàn)橐职┗?，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檳榔堿可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白P53、Bax的表達(dá)，提示檳榔堿可能是通過(guò)調(diào)控P53、Bax和Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的作用。

總之，該研究為檳榔堿用于乳腺癌的治療提供了有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但檳榔堿是否對(duì)其他乳腺癌細(xì)胞具有類似MCF-7細(xì)胞的作用，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

[1] 姚起鑫, 亓竹青, 王 光, 等. 檳榔堿改善2型糖尿病大鼠糖、脂代謝紊亂[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2009, 25(11): 1477-1481.

[2] 亓竹青, 姚起鑫, 王 光, 等. 檳榔堿對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺細(xì)胞PDX-1 mRNA表達(dá)的影響[J]. 國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志， 2010, 30(1): 14-19.

[3] 凌宏艷， 姚起鑫， 亓竹青, 等. 檳榔堿對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗的作用[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2014， 30(3)： 254-258.

[4] Li M, Gao F, Zhou ZS,etal. Arecoline inhibits epithelial cell viability by upregulating the apoptosis pathway: implication for oral submucous fibrosis[J].OncolRep， 2014， 31(5): 2422-2428.

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Effect of arecoline on proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells

FENG Shui-dong1+, WU Di2+, YANG Si-si2, HE Jian-qin2, ZHANG Kai-fang2, LING Hong-yan2Δ

(1. Department of Social Medicine and Health Service Management, School of Public Health, 2. Department of Physiology,School of Medicine, University of South China, Hengyang 421001, China)

Objective: To observe the effects of arecoline on proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells and to explore its possible mechanism. Methods：Human breast cancer MCF-7 cells were treated with arecoline at the concentrations of 0,10,30,50,100,300,500 μmol/L, the cell proliferation were detected by MTT assay, cell apoptosis were analyzed by Hoechst 33342 staining and flow cytometry, the protein expression of Bax,Bcl-2 and P53 were detected by Western blot. Results： Low concentration(0，10，30, 50 μmol/L)arecoline had no effect on the proliferation and apoptosis of MCF-7. However, high concentration(100,300,500 μmol/L)arecoline inhibited proliferation and induced apoptosis of MCF-7 cells in a concentration-dependent manner, arecoline also significantly increased P53 and Bax protein expression and decreased Bcl-2 protein expression. Conclusion: High concentration arecoline inhibited the proliferation and induced the apoptosis of MCF-7 cells， the mechanism was probably corrected with increasing P53 and Bax protein expression and decreasing Bcl-2 protein expression.

arecoline; MCF-7 cells; proliferation; apoptosis

教育部留學(xué)歸國(guó)基金(教外司留[2014]1685號(hào))；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2012M511384)；湖南省科技廳(2015JC3085)項(xiàng)目資助；南華大學(xué)留學(xué)歸國(guó)基金項(xiàng)目(2013XQD49)

2015-06-08

2016-02-29

R781.5

A

1000-6834(2016)04-370-03

△【通訊作者】Tel: 86-0734-8281389; E-mail: linghongyan0203@126.com.+： 共同第一作者