袁博，王金海，張星華，田亮，任朝展，杜小正

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

熱補針法干預風濕性關(guān)節(jié)炎寒證模型家兔尿液代謝組學研究

袁博1，王金海2，張星華1，田亮1，任朝展3，杜小正1

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的通過對風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）寒證模型家兔尿液中內(nèi)源性代謝物的分析，探討熱補針法治療RA的特異性機制。方法采用卵蛋白誘導聯(lián)合低溫冷凍建立RA寒證家兔模型。將40只清潔級青紫藍家兔隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉(zhuǎn)補法組、熱補針法組，每組8只。分別應用平補平瀉、捻轉(zhuǎn)補法、熱補針法針刺“足三里”，1次/d，留針30 min，共7 d。干預結(jié)束后收集新鮮尿液，氣相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜采集各組尿液代謝物圖譜，利用主成分分析和偏最小二乘判別分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。結(jié)果與正常組比較，模型組尿液代謝物變化顯著，氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)降低，三羧酸循環(huán)、糖類代謝、脂肪酸代謝相關(guān)物質(zhì)增高；與模型組比較，各針刺組三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝相關(guān)物質(zhì)降低（P＜0.05）；熱補針法組三羧酸循環(huán)相關(guān)物質(zhì)明顯低于平補平瀉組和捻轉(zhuǎn)補法組（P＜0.05）。結(jié)論熱補針法治療RA的特異性體現(xiàn)在對三羧酸循環(huán)的調(diào)控。

熱補針法；風濕性關(guān)節(jié)炎；代謝組學；系統(tǒng)生物學；氣相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜；兔

風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病。目前尚無根治方法，針灸具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]，對RA具有確切的臨床療效[4]。熱補針法是鄭魁山教授簡化燒山火手法和進火法而形成的一種復式手法，具有補益正氣、溫陽散寒功效。課題組前期研究表明，熱補針法在治療RA過程中具有相對特異性的效果[5-8]。但前期研究僅從鎮(zhèn)痛方面進行了初步分析，缺乏對針刺后機體產(chǎn)生的全部生物信息的綜合分析。

代謝組學是一種能夠反映生物系統(tǒng)中所有低分子量（＜1000）代謝物質(zhì)的定性和定量分析手段，通過考察生物體系終末代謝產(chǎn)物的變化，研究生物體系代謝途徑[9-10]。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是最早應用于代謝組學的色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，除具有較高的分辨率和檢測靈敏度外，還具有用來參考比較的標準代謝物譜庫。因此，該研究手段的優(yōu)勢與針灸作用特點甚相吻合。為了進一步探討熱補針法治療RA的特異性機制，本研究以RA模型家兔為載體，采用氣相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（GC-Q/TOF-MS）從系統(tǒng)生物學角度探討熱補針法治療RA的特異性機制。

1　材料與方法

1.1動物

2～3月齡清潔級健康青紫藍家兔40只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，蘭州生物制品研究所，許可證號SCXK（甘）2012-0001。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃，相對濕度（50±10）%，每日光照時間12 h，自由進食飲水。

1.2針具、主要試劑與儀器

針灸針（華成牌，蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司）。卵蛋白干粉（批號A5253-250G）、弗氏完全佐劑（批號F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，國藥集團；尿素酶、甲氧胺鹽酸吡，Sigma公司。Agilent 7890A/5975C GC/MS系統(tǒng)、毛細管色譜柱（HP-5 ms Agilent），J&W Scientific公司。

1.3分組及造模

家兔適應性飼養(yǎng)7 d，隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉(zhuǎn)補法組、熱補針法組，每組8只。采用卵蛋白誘導聯(lián)合低溫冷凍進行RA寒證模型復制[11-12]。實驗正式開始前3 d，用電推剃去家兔背部肩胛骨間的毛。將4 mg/mL卵蛋白溶液與等量弗氏完全佐劑混勻，充分震蕩成乳化劑，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均勻選定的6個點，每點皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同劑量重復皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔雙后腿膝關(guān)節(jié)周圍的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒雙膝關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)內(nèi)注入20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL。24 h內(nèi)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫觸痛，表明模型復制成功。成模后第2日，乙醇消毒兩后腿足，上、下、左、右圍置冰袋（3份冰＋1份結(jié)晶氯化鈣，粉碎混合，溫度降至-20～-25 ℃冷凍1.5 h，45 ℃溫水復溫5 min（室溫12 ℃)，共冷凍1次。冷凍后14 d，家兔表現(xiàn)為精神萎糜不振，兩后肢匍伏跛行，膝關(guān)節(jié)腫脹、周徑明顯大于對照組，局部青紫、皮溫不高，表示成功建立RA寒證模型。

1.4針刺方法

先將家兔固定，選取后腿“足三里”[13]。各針刺組分別施以相應針法。熱補針法操作參照《鄭氏針灸全集》[14]：左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內(nèi)8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續(xù)捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應的部位，連續(xù)重插輕提5次；拇指再向前連續(xù)捻按5次，反復操作1 min；最后使針下沉緊，留針30 min。平補平瀉法、捻轉(zhuǎn)補法操作參照《刺法灸法學》[15]。平補平瀉法：針刺得氣后，前后均勻捻轉(zhuǎn)，不單向捻轉(zhuǎn)，指力均勻，角度180°～360°，頻率60～90 r/min，反復操作1 min。捻轉(zhuǎn)補法：針刺得氣后，小幅度前后捻轉(zhuǎn)針體（角度180°～360°，頻率60～90 r/min），拇指向前左轉(zhuǎn)時用力重、指力沉重向下，拇指向后右轉(zhuǎn)還原時用力輕，反復操作1 min。每日1次，每次留針30 min，連續(xù)7 d。

1.5樣本采集

針刺結(jié)束后，收集各組新鮮尿液，8000 r/min離心10 min，用EP管收集上層尿液，離心分裝后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6樣品衍生化處理

尿液常溫解凍后，混勻，取200 μL，12 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL，加尿素酶10 μL，混勻，37 ℃反應15 min；加200 μL甲醇，轉(zhuǎn)入進樣瓶，置溫和氮氣下吹干；加入30 μL甲氧胺鹽酸吡啶（20 mg/mL）溶液，強烈震蕩30 s，37 ℃反應90 min；取出，加入30 μL BSTFA（含1%TMCS，BSTFA∶TMCS＝99∶1）的衍生試劑，70 ℃反應60 min。取出樣本，室溫放置30 min備檢。

1.7氣相色譜-質(zhì)譜條件

進樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度＞99.999%）作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0 μL。升溫程序為：初始溫度80 ℃，維持2 min，10 ℃/min速度升至320 ℃，維持6 min。采用全掃描模式進行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測范圍為50～550 m/z。采用隨機順序進行連續(xù)樣本分析，避免儀器信號波動所造成的影響。

1.8統(tǒng)計學方法

原始數(shù)據(jù)采用XCMS軟件進行特征離子峰提取、峰對齊、色譜峰識別及峰匹配，然后構(gòu)建多維數(shù)據(jù)集，采用SIMCA-P13.0進行多維數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)預處理采用Par的方式，數(shù)據(jù)分析方法包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），最后獲得差異物質(zhì)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1原始色譜圖的可視化檢查

對所有樣本的總離子流色譜圖（TIC）進行重疊與匹配分析（見圖1），結(jié)果表明，質(zhì)譜峰形明顯、界限清晰、重現(xiàn)性好，與標準品譜峰一致，5組樣品質(zhì)譜峰重疊性良好。

2.2模式識別

各組PCA圖見圖2。為了最大化反映各組別間代謝模式的差異，采用監(jiān)督性PLS-DA，見圖3。從圖3中可以看出各組明顯區(qū)別，針刺干預后向正常組回歸，并且熱補針法組更突出。據(jù)PLS-DA模型第一主成分VIP值（閾值＞1）并同時結(jié)合P值（P＜0.05）來尋找差異性表達代謝物。通過以上分析，最終獲得的生物標記物見表1?？梢缘贸觯Ｐ徒M尿液代謝物變化較正常組主要體現(xiàn)為氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)降低，三羧酸循環(huán)、糖類代謝、脂肪酸代謝增強。各針刺組較模型組主要體現(xiàn)為三羧酸循環(huán)代謝及脂肪酸代謝降低，且熱補針法組三羧酸循環(huán)明顯于低平補平瀉組和捻轉(zhuǎn)補法組。

圖1　樣本TIC（重疊）

圖2　各組尿液PCA圖

圖3　各組尿液PLS-DA圖

表1　各組間潛在生物標志物及代謝途徑

3　討論

RA屬中醫(yī)學“痹證”范疇。正氣虛弱是RA發(fā)病的內(nèi)因，風寒濕邪侵犯是外因，邪氣乘虛侵入四肢關(guān)節(jié)筋骨，陽氣虛不能驅(qū)邪外出，邪氣黏滯纏綿，閉阻經(jīng)絡，發(fā)為此病。熱補針法是鄭魁山教授臨床治療RA的經(jīng)驗結(jié)晶，具有補益正氣、溫陽散寒的功用，與RA的病機特點相吻合?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，RA的發(fā)生與三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、葡萄糖代謝等密切相關(guān)[16-19]，其涉及的相關(guān)代謝物有檸檬酸、琥珀酸、肉堿、亮氨酸、麥芽糖、乳糖、嘧啶核苷酸、尿酸等。說明RA的發(fā)病機制具有途徑廣、層次多等復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)特點。因此，從現(xiàn)代醫(yī)學角度而言，其發(fā)病機制與針灸多靶點、多途徑、多層次、類似于網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的作用特點相符。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中琥珀酸、檸檬酸、異檸檬酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸的量異常升高，以上這些物質(zhì)均是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。三羧酸循環(huán)反應在線粒體內(nèi)發(fā)生，線粒體是細胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，它為細胞的活動提供了能量，這些代謝物的排泄增加可能會引發(fā)能量的供應不足。有研究顯示，RA關(guān)節(jié)腔缺氧[20]，細胞適應缺氧主要是從氧化磷酸化向糖酵解途徑轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生ATP，模型組中乳糖參與糖代謝，是機體內(nèi)的能量物質(zhì)，其生成的半乳糖磷酸酯可以為糖酵解途徑提供能量，尿液中乳糖排泄量的異常說明RA體內(nèi)糖酵解途徑發(fā)生改變而導致能量代謝通路出現(xiàn)紊亂。因此，我們的研究證實了這一結(jié)論。模型組中L-亮氨酸水平下降，它屬于支鏈亮氨酸，對于促進肌肉蛋白質(zhì)的合成、骨豁肌微細損傷的修復、糖異生以及骨豁肌葡萄糖的攝取都起著重要的作用[21]；模型組參與多不飽和脂肪酸代謝的2-羥基十六烷酸、前列腺素E2甲酯、癸二酸、壬二酸的水平異常增高，以上這些物質(zhì)可促使炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6的產(chǎn)生，TNF-α是RA發(fā)病機制中關(guān)鍵的促炎因子，可刺激軟骨細胞合成IL-6與IL-8，產(chǎn)生進一步的炎性反應，與IL-6、IL-1β等協(xié)同共同促進破骨細胞的生成導致骨質(zhì)的破壞[22]，TNF-α又可增加一氧化氮、前列腺素E的生成和骨的吸收[23]。綜上所述，這些代謝途徑的改變可以解釋RA機體全身炎性反應狀態(tài)導致對能量的需求增加及供給的相對不足，經(jīng)針刺干預后，參與脂肪酸代謝的上述代謝物均顯著降低（P＜0.05），各針刺組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺干預后參與三羧酸循環(huán)的上述物質(zhì)普遍下調(diào)，尤以熱補針法組琥珀酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸下調(diào)最顯著（P＜0.05），說明熱補針法可以調(diào)節(jié)RA異常的能量代謝通路。

平補平瀉法、捻轉(zhuǎn)補法及熱補針法均可使RA異常的三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝發(fā)生逆轉(zhuǎn)，提示這些針刺手法可調(diào)控RA體內(nèi)三羧酸循環(huán)（能量代謝）、脂肪酸代謝（抗炎效應）通路，而熱補針法在調(diào)控三羧酸循環(huán)方面均明顯優(yōu)于平補平瀉、捻轉(zhuǎn)補法?；诖?，我們認為調(diào)控三羧酸循環(huán)（能量代謝）可能是熱補針法治療RA的特異性機制。

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Study on Intervention of Heat-reinforcing Needling for Metabonomics of Rabbits Urine with Rheumatoid Arthritis Cold Syndrome

YUAN Bo1, WANG Jin-hai2, ZHANG Xing-hua1, TIAN Liang1,REN Chao-zhan3, DU Xiao-zheng1
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. The Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, China; 3. Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China)

Objective To analyze the endogenous metabolites in urine of rabbits with rheumatoid arthritis (RA) cold syndrome; To investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods Egg albumin inducing method combined with low temperature and freezing method was used to establish RA cold syndrome rabbit models. A total of 40 healthy purple blue rabbits were randomly divided into normal control group (NC), model control (MC), reinforcing-reducing needling group (RRN), twirling-reinforcing needling group (TRN) and heat-reinforcing needling group (HRN) (n=8/group). Except NC and MC, RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli (ST36), TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli, and HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli, once a day and retaining 30 min, a total of seven days. Fresh urine sample after the intervention was collected and then gas chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry technology were used to evaluate metabolic profiles. All the data were analyzed by principal component analysis and partial least squares discriminant analysis. Results Compared with NC, the urine metabolites of MC changed significantly, mainly reflecting in the increase of amino acid metabolism were decreased, metabolites of TCA cycle, carbohydrate and fatty acid metabolism were increased; Compared with MC, the urine metabolites of TCA cycle and fatty acid metabolism were decreased in all intervention of acupuncture group (P＜0.05), but the metabolites of TCA cycle in HRN were obviously less than that of RRN and TRN (P＜0.05). Conclusion The specificity of heat-reinforcing needling for RA manifests in regulation of TCA cycle.

heat-reinforcing needling; rheumatoid arthritis; metabonomics; systems biology; GC-Q/TOF-MS; rabbits

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.016

R245

A

1005-5304(2016)12-0064-05

國家自然科學基金（81260558）；甘肅省自然科學基金（1208RJZA185）；甘肅省高?；究蒲袠I(yè)務費項目（2011年）

杜小正，E-mail：lz-duxiaozheng@163.com

（2016-01-23）

（2016-02-20；編輯：華強）