紫花牡荊素對肺癌A549細胞增殖及凋亡的影響

張春春，軒亞茹，王亞華，閆荷露，李霞，唐輝，應(yīng)雪

(新疆石河子大學藥學院，新疆石河子 832000)

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紫花牡荊素對肺癌A549細胞增殖及凋亡的影響

張春春，軒亞茹，王亞華，閆荷露，李霞，唐輝，應(yīng)雪

(新疆石河子大學藥學院，新疆石河子 832000)

目的 探討紫花牡荊素對肺癌A549細胞(簡稱肺癌細胞)增殖及凋亡的影響，為其用于臨床治療肺癌提供依據(jù)。方法 取對數(shù)生長期的肺癌細胞，分別加入終濃度為0.1、0.5、1、5、10、25、50、100 μmol/L紫花牡荊素溶液，分別作用24、48 h，采用SRB法檢測增殖抑制率，計算50%抑制濃度(IC50)。取對數(shù)生長期的肺癌細胞，分別加入最終濃度為0、5、15 μmol/L紫花牡荊素溶液，Hoechst33258染色后共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)；采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期時相分布。結(jié)果 隨紫花牡荊素濃度升高，作用24、48 h的肺癌細胞增殖抑制率均呈上升趨勢。經(jīng)0.5～100 μmol/L紫花牡荊素作用48 h的肺癌細胞增殖抑制率均明顯高于同一濃度作用24 h的肺癌細胞(P均<0.05)。紫花牡荊素作用24、48 h時的IC50分別為14.74、8.16 μmol/L。隨紫花牡荊素濃度升高，作用24 h的肺癌細胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊、核裂解和細胞碎片等細胞凋亡形態(tài)學改變越來越明顯；與同濃度紫花牡荊素作用24 h比較，作用48 h的肺癌細胞凋亡形態(tài)學改變更明顯。經(jīng)0、5、15 μmol/L紫花牡荊素作用24、48 h的肺癌細胞凋亡率均逐漸升高，處于G1、S期的比例均逐漸降低，處于G2/M期的比例均逐漸升高(P均<0.05)。與同一濃度紫花牡荊素作用24 h的肺癌細胞比較，經(jīng)5、15 μmol/L紫花牡荊素作用48 h的肺癌細胞凋亡率均升高，處于G1、S期的比例均降低，處于G2/M期的比例均升高(P均<0.05)。結(jié)論 紫花牡荊素可將肺癌細胞阻滯于G2/M期，具有增殖抑制作用和凋亡促進作用，并呈時間、濃度依賴性。

肺癌；A549細胞；紫花牡荊素；細胞凋亡；細胞增殖；細胞周期

紫花牡荊素為天然存在的多甲氧基黃酮類化合物，存在于水果、蔬菜、中草藥等多種植物中[1]。國內(nèi)外研究表明，紫花牡荊素對正常細胞的增殖無影響或影響很小，對人前列腺癌[2]、結(jié)腸癌[3]、白血病[4]、乳腺上皮癌[5]細胞增殖有明顯的抑制作用，但其對肺癌細胞影響的報道較少。2013年8月～2015年12月，本研究觀察了紫花牡荊素對人肺癌A549細胞增殖及凋亡的影響，以期為肺癌的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌A549細胞(簡稱肺癌細胞)購自中國科學院上海細胞生物學研究所，將其置于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。試劑及儀器：紫花牡荊素(純度>98%，批號14111206)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司，DMSO、磺酰羅丹明B蛋白(SRB)均購自美國Sigma公司，PBS緩沖溶液購自上海生工生物工程有限公司，凋亡試劑盒、RNaseA和碘化丙啶(PI)均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，酶標免疫測定儀購自美國Bio-rad公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫花牡荊素對肺癌細胞增殖影響的觀察 取對數(shù)生長期肺癌細胞接種于96孔板中，調(diào)整細胞密度為5 000個/孔，設(shè)置3個復孔。將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、95%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細胞貼壁生長后分別加入紫花牡荊素溶液使其最終濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、25、50、100 μmol/L。另外設(shè)置3個復孔作為空白對照，將細胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中進行孵育。分別于孵育24、48 h時取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入10%三氯乙酸100 μL，-4 ℃冰箱中放置1 h進行固定。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌，以去除三氯乙酸。在空氣中干燥后，每孔加入0.4% SRB(以1%醋酸配制)100 μL，室溫條件下放置15 min。棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合染料?？諝庵懈稍锖蠹尤?0 mmol/L Tris堿(pH 10.5)100 μL溶解，在平板振蕩器上振蕩20 min，置于酶標儀中，測定540 nm波長下每孔吸收度OD值。參照應(yīng)雪等[6]的方法計算增殖抑制率和50%抑制濃度(IC50)。

1.2.2 紫花牡荊素對肺癌細胞凋亡影響的觀察 取對數(shù)生長期的肺癌細胞接種于6孔板中，調(diào)整細胞密度為2×105個/孔，于37 ℃、95%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。待細胞貼壁生長后分別加入紫花牡荊素溶液使其最終濃度分別為0、5、15 μmol/L，將細胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24、48 h，收集細胞。預冷的PBS沖洗2遍，經(jīng)磷脂酰絲氨酸(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。取對數(shù)生長期肺癌細胞接種于12孔板中，調(diào)整細胞密度為2×104個/孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁生長后分別加入紫花牡荊素溶液使其最終濃度分別為0、5、15 μmol/L，將細胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24、48 h，收集細胞。預冷的PBS 洗滌2遍，4%甲醛固定，加入濃度為10 μg/mL的Hoechst 33258，于37 ℃條件下染色10 min，PBS洗滌2遍，置于共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖抑制率 隨紫花牡荊素濃度升高，作用24、48 h的肺癌細胞增殖抑制率均呈上升趨勢。經(jīng)0.5～100 μmol/L紫花牡荊素作用48 h的肺癌細胞增殖抑制率均明顯高于同一濃度作用24 h的肺癌細胞(P均<0.05)。經(jīng)0.1 μmol/L紫花牡荊素作用24 h和作用48 h的肺癌細胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。紫花牡荊素作用24、48 h時的IC50分別為14.74、8.16 μmol/L。

2.2 細胞凋亡率及形態(tài)變化 經(jīng)0、5、15 μmol/L紫花牡荊素作用24、48 h的肺癌細胞凋亡率均逐漸升高，兩兩比較P均<0.05。經(jīng)5、15 μmol/L紫花牡荊素作用48 h凋亡率均高于同一濃度作用24 h(P均<0.05)。見表2。隨紫花牡荊素濃度升高，作用24 h的肺癌細胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊、核裂解和細胞碎片等細胞凋亡形態(tài)學改變越來越明顯。與同濃度紫花牡荊素作用24 h比較，作用48 h的肺癌細胞凋亡形態(tài)學改變更明顯。見插頁Ⅱ圖3。

2.3 細胞周期 隨紫花牡荊素濃度升高(0、5、15 μmol/L)，作用24、48 h的肺癌細胞處于G1、S期的比例均逐漸降低，處于G2/M期的比例均逐漸升高(P均<0.05)。經(jīng)5、15 μmol/L作用48 h，處于G1、S期的細胞比例均低于同一濃度作用24 h，處于G2/M期的比例均高于同一濃度作用24 h(P均<0.05)。見表3。

表1 不同濃度紫花牡荊素作用24、48 h肺癌細胞增殖抑制率比較

注：與同濃度紫花牡荊素作用24 h比較，*P<0.05。

表2不同濃度紫花牡荊素對肺癌細胞作用24、48 h的細胞凋亡率比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與5 μmol/L比較，#P<0.05；與同濃度紫花牡荊素作用24 h比較，△P<0.05。

表3 不同濃度紫花牡荊素作用24、48 h肺癌細胞周期分布比較±s)

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與5 μmol/L比較，#P<0.05；與同濃度紫花牡荊素作用24 h比較，△P<0.05。

3 討論

腫瘤形成的主要原因是細胞周期紊亂導致細胞增殖過多和凋亡減少，因此抑制細胞增殖、誘導其凋亡已經(jīng)成為腫瘤治療的重要手段之一[7]。紫花牡荊素分子式為C19H18O8，相對分子質(zhì)量374.35，熔點為186～187 ℃，純品為淡黃色晶體。紫花牡荊素學名5,3′-二羥基-3，6,7,4′ - 四甲氧基黃酮，又叫蔓荊子黃素，屬于多甲氧基黃酮類化合物。本研究結(jié)果顯示，隨紫花牡荊素濃度升高，作用24 h和作用48 h的肺癌細胞增殖抑制率均呈上升趨勢；經(jīng)0.5～100 μmol/L紫花牡荊素作用48 h的肺癌細胞增殖抑制率均明顯高于作用24 h；說明紫花牡荊素對肺癌細胞具有較強的抑制作用，且呈一定的時間、濃度依賴性。根據(jù)本研究中細胞增殖抑制率計算得到紫花牡荊素作用24、48 h的IC50分別為14.74、8.16 μmol/L，處于微摩爾水平，如在臨床使用，該藥的應(yīng)用劑量較小。

研究表明，細胞凋亡細胞早期主要細胞表面磷脂酰絲氨酸(PS)發(fā)生易位[8]，之后各種半胱氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，胱天蛋白酶-3和PARP裂解而激活，細胞核核碎裂活化后，出現(xiàn)凋亡小體的產(chǎn)生和細胞體積縮小[9]。本研究結(jié)果顯示，紫花牡荊素作用于肺癌細胞后可出現(xiàn)細胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊、核裂解和細胞碎片等細胞凋亡形態(tài)學改變，且呈一定的時間、濃度依賴性，與流式細胞術(shù)檢測得到的細胞凋亡率變化相符。本研究發(fā)現(xiàn)，紫花牡荊素將大部分肺癌細胞阻滯在G2/M期，可防止細胞形成紡錘體，抑制有絲分裂，最終達到促進細胞凋亡的目的。與長春新堿[10]、長春堿[11]和紫杉醇[12]等抗癌藥物對癌細胞周期的影響類似。

研究發(fā)現(xiàn)，紫花牡荊素誘導肺癌細胞凋亡的機制可能與其降低肺癌細胞線粒體跨膜電位、促進線粒體細胞色素C釋放、上調(diào)Bax蛋白表達水平有關(guān)[13,14]，此外與活性氧和Capase介導的凋亡靶向癌細胞或通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白如NF-κB抑制癌細胞的生長有關(guān)[18～21]。p53基因突變是腫瘤細胞產(chǎn)生藥物耐藥性的機制之一[22～25]，但是紫花牡荊素誘導細胞凋亡是否與p53途徑有關(guān)仍需進一步研究。

綜上所述，紫花牡荊素可以抑制肺癌細胞增殖、促進其凋亡，并呈一定的時間和濃度依賴性。紫花牡荊素是天然存在的化合物，已經(jīng)顯示出了良好的抗腫瘤作用，有望成為潛在的抗癌新藥。為了更好證明紫花牡荊素的抗癌潛力，還需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床前試驗，以確定其具體的作用機制及細胞內(nèi)靶點。

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Influence of casticin on proliferation and apoptosis of A549 cells

ZHANGChunchun,XUANYaru,WANGYahua,YANHelu,LIXia,YINGXue

(CollegeofPharmacy,XinjiangShiheziUniveristy,Shihezi832000,China)

Objective To investigate the influence of casticin on the proliferation and apoptosis of lung cancer A549 cells (lung cancer cells for short) and to provide basis for the clinical treatment of lung cancer. Methods We chose the lung cancer cells in the logarithmic phase and separately treated them with different concentrations of casticin (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50 and 100 μmol/L). The SRB method was used to detect the anti-proliferative rate of A549 cells in order to finally calculate its half inhibitory concentration (IC50). Furthermore, A549 lung cancer cells in the logarithmic phase were treated with final concentrations of casticin (0, 5 and 15 μmol/L) and meanwhile we observed their morphology of apoptosis by laser scanning confocal microscope after being treated with Hoechst33258 staining. The apoptosis rate of A549 cells was detected by flow cytometry. Results The anti-proliferative rates of A549 cells at 24 and 48 h were significantly increased with the increasing concentrations of casticin. In addition, after being treated with casticin from 0.5 to 100 μmol/L, the anti-proliferative rates of A549 cells at 48 h were significantly higher than those at 24 h (allP<0.05). The IC50of casticin were separately 14.74 μmol/L at 24 h and 8.16 μmol/L at 48 h. With the increasing concentrations of casticin, cell morphology at 24 h showed obvious changes, such as cell shrinkage, chromatin condensation, nucleus fragment and cellular debris. The morphology changes of A549 cells at 48 h were more obviously than those at 24 h. The apoptosis rates of A549 cells which were separately treated by casticin with concentrations of 0, 5 and 15 μmol/L for 24 and 48 h were all gradually increased. Furthermore, the proportion of cells at G1and S periods were all decreased and cells at G2/M period were increased (allP<0.05). The apoptosis rates of A549 cells treated by 5 and 15 μmol/L casticin at 48 h were all increased as compared to those at 24 h. With the same comparison, the proportion of cells at G1and S periods were both decreased and the cells at G2/M were increased (allP<0.05). Conclusion Casticin may block the cell cycle of A549 cells at G2/M period and is capable of anti-proliferation as well as promoting apoptosis, which is in a time- and dose-dependent manner.

lung carcinoma; A549 cells; casticin; apoptosis; proliferation; cell cycle

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團社會發(fā)展科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計劃項目(2015AD007)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510759066)。

張春春(1988-)，女，碩士研究生，研究方向為藥物新制劑與新劑型研究。E-mail: 1271403480@qq.com

簡介：應(yīng)雪(1981-)，女，博士、副教授，研究方向為藥物新劑型研究。E-mail: yingxue2011@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.004

R734.2

A

1002-266X(2016)36-0013-04

2016-01-04)