椰子織蛾高毒力金龜子綠僵菌菌株的篩選

孫曉東, 李富恒, 閻 偉, 李朝緒, 呂朝軍, 覃偉權(quán)*

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所, 文昌 571339; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030)

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椰子織蛾高毒力金龜子綠僵菌菌株的篩選

孫曉東1,2, 李富恒2, 閻 偉1, 李朝緒1, 呂朝軍1, 覃偉權(quán)1*

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所, 文昌 571339; 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030)

椰子織蛾是為害熱帶地區(qū)棕櫚科植物的重要害蟲(chóng),本試驗(yàn)對(duì)從海南省陵水縣采集的椰子織蛾僵蟲(chóng)上分離得到的4株金龜子綠僵菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定,并測(cè)定了其對(duì)椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)的室內(nèi)生物活性,篩選出了高毒力菌株LS-Y1。試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)NCBI BLAST比對(duì),4株菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中已知基因序列相似性分別為99%、100%、99%、99%。菌株LS-Y1 處理椰子織蛾3 齡幼蟲(chóng)后6 d 的LC50為4.41×106個(gè)/mL。6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108個(gè)/mL 濃度處理下,金龜子綠僵菌LS-Y1 對(duì)椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)的 LT50分別為5.77、4.88、4.43、3.82和3.36 d。該菌株對(duì)椰子織蛾幼蟲(chóng)具有較高毒力,具有較好的生防潛力。

金龜子綠僵菌; 椰子織蛾; 分子鑒定; 毒力

椰子織蛾(OpisinaarenosellaWalker)(又稱椰子木蛾、黑頭履帶蟲(chóng)、椰蛀蛾、食葉履帶蟲(chóng)[1]),屬鱗翅目(Lepidoptera)織蛾科(Oecophoridae),英文名coconut black headed caterpillar,是一種嚴(yán)重為害椰子、檳榔、蒲葵、中東海棗、大王棕等棕櫚作物的外來(lái)入侵有害生物[2],目前主要分布于印度、泰國(guó)、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、斯里蘭卡、孟加拉、緬甸、巴基斯坦等地[3]。椰子織蛾幼蟲(chóng)取食葉片,嚴(yán)重時(shí)整個(gè)樹(shù)冠被啃食從而導(dǎo)致植株發(fā)育緩慢、果實(shí)產(chǎn)量大幅減少甚至絕產(chǎn)[4]。近年來(lái)棕櫚作物作為經(jīng)濟(jì)作物和園林景觀植物從國(guó)外大量引入并在我國(guó)南方大面積種植,導(dǎo)致椰子織蛾在我國(guó)暴發(fā)的可能性越來(lái)越大[5],目前海南、廣西、廣東三省已有大面積為害的報(bào)道[6]。2014年3月椰子織蛾被列為全國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物。

目前椰子織蛾主要還是依靠化學(xué)防治[4, 7],化學(xué)藥劑雖然在一定程度上可以快速控制該蟲(chóng),但是其引起的殘留、抗性與再猖獗等問(wèn)題嚴(yán)重影響到自然環(huán)境與人類(lèi)的健康。利用寄生蜂防控椰子織蛾在印度、斯里蘭卡等國(guó)取得了一定的效果,但是國(guó)內(nèi)尚未有效開(kāi)展優(yōu)質(zhì)寄生蜂品種引進(jìn)與大面積飼養(yǎng)、釋放[3, 8],因此如何結(jié)合國(guó)內(nèi)現(xiàn)有研究基礎(chǔ)尋找更加科學(xué)有效的控制椰子織蛾為害的生物防治手段顯得尤為重要。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)寄主范圍廣泛,能寄生直翅目、膜翅目、同翅目、雙翅目、鱗翅目、鞘翅目以及半翅目等7個(gè)目、42個(gè)科、約200余種昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)及螨類(lèi)[12]。金龜子綠僵菌是在生物防治上使用最為廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌之一,在森林、農(nóng)作物以及公共衛(wèi)生害蟲(chóng)防控方面都進(jìn)行了應(yīng)用效果的評(píng)估。如張澤華等人利用金龜子綠僵菌生防制劑成功防控蠐螬[11]、蝗蟲(chóng)[10]、葉蟬[12]等害蟲(chóng),Amerasan等[9]發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌對(duì)瘧疾的主要媒介昆蟲(chóng)伊蚊有著十分明顯的防控效果。金龜子綠僵菌作為一種重要的生防真菌具有寄生物種多、適應(yīng)性強(qiáng)、致病周期短、靶標(biāo)性強(qiáng)、對(duì)人類(lèi)和牲畜不會(huì)造成毒害以及環(huán)境友好的特點(diǎn)。目前利用金龜子綠僵菌防控椰子織蛾尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本文針對(duì)椰子織蛾在海南省南部市縣為害嚴(yán)重的現(xiàn)狀,因地制宜地收集了對(duì)椰子織蛾有毒力的金龜子綠僵菌菌株,進(jìn)行了高致病性金龜子綠僵菌菌株篩選與分子生物學(xué)鑒定,旨在提供優(yōu)良菌株用于生產(chǎn)防治棕櫚科植物的菌劑,為椰子織蛾的生物防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[11]與SDAY選擇性培養(yǎng)基(4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、2%瓊脂、100 μg/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素、多菌靈0.8 μg/mL)。

1.1.2 引物

由生工生物工程股份有限公司(廣州)合成真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)引物ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),ITS 5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[13]擴(kuò)增致病菌的ITS 1-5.8S-ITS 2 rDNA區(qū)。

1.1.3 菌株

供試菌株分離自海南省陵水縣椰子織蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)。剝開(kāi)椰子卷曲葉片,收集椰子織蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)并進(jìn)行保濕培養(yǎng)和菌株的分離,然后轉(zhuǎn)接到SDAY選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,經(jīng)顯微形態(tài)學(xué)鑒定為綠僵菌后進(jìn)行純化培養(yǎng),共分離得到4株金龜子綠僵菌菌株,對(duì)照菌株R3是由紅棕象甲僵蟲(chóng)中分離得到的金龜子綠僵菌[16],相關(guān)信息參見(jiàn)表1。

表1 供試金龜子綠僵菌菌株編號(hào)、寄主信息、采集時(shí)間與采集地

1.1.4 主要試蟲(chóng)

椰子織蛾由本實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng),飼料為新鮮椰子葉片,恒溫氣候箱中飼養(yǎng)條件:溫度為(28±1)℃,RH為飽和濕度,光周期為L(zhǎng)∥D=12 h∥12 h。

1.1.5 主要試劑

2×TaqMix、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司;真菌基因組DNA快速抽提試劑盒購(gòu)自Sangon Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

取采集的椰子織蛾僵蟲(chóng)樣品,先用70%乙醇消毒1 min,無(wú)菌水清洗后再用0.1%的氯化汞表面消毒30 s,無(wú)菌水清洗3次,挑取少許僵蟲(chóng)組織接種于SDAY選擇性培養(yǎng)基上,于(28±1)℃恒溫氣候箱中倒置培養(yǎng)3～4 d,選取單孢子接種于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化,每皿3點(diǎn),呈三角形排列,石蠟?zāi)っ芊?0℃保存。

1.2.2 金龜子綠僵菌基因組DNA的提取與鑒定

將純化后的金龜子綠僵菌接種在PDA培養(yǎng)基上,26℃恒溫條件下培養(yǎng)72 h,無(wú)菌條件下刮取菌體并用紗布抽濾收集菌絲,使用真菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA,將DNA沉淀溶解于300 μL無(wú)菌水中,加入RNA酶(終濃度50 μg/mL)處理溶液,使DNA充分溶解,-20℃保存?zhèn)溆?。ITS鑒定PCR反應(yīng)體系參見(jiàn)Song Zhangyong[14]。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,采用Vector NTI 11軟件的AlignX進(jìn)行rDNA-ITS同源性分析。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室殺蟲(chóng)活性測(cè)定

將純化的綠僵菌菌株在PDA培養(yǎng)基上畫(huà)線,28℃培養(yǎng)10 d后,無(wú)菌條件下刮取菌體,然后使用滅菌去離子水制備成菌懸浮液(含0.1%吐溫-80),將椰子葉片用清水洗凈晾干,選取鮮嫩一致的椰子葉片切成15 cm的葉段,在各個(gè)濃度的混合均勻的菌懸液(含0.1%吐溫-80)中浸泡5 min,晾干,放入生測(cè)瓶中,每瓶接椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)30頭,每個(gè)處理重復(fù)3次,28℃生化培養(yǎng)箱中保溫,培養(yǎng)2 d后調(diào)查死、活蟲(chóng)數(shù),并觀察幼蟲(chóng)取食情況,調(diào)查至第6天。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株菌株的分子水平鑒定

LS-Y1、LS-Y6、LS-G2、LS-G3、R3 rDNA-ITS序列經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)后與GenBank中已注冊(cè)序列JN377427.1、NR132017.1、FJ545278.1、FJ545294.1、GU909512.1的相似性最高，分別為99%、100%、99%、99%、98%,在分子水平鑒定5株菌株均為金龜子綠僵菌,具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株的序列比對(duì)結(jié)果與對(duì)椰子織蛾幼蟲(chóng)的毒力1)

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,同列數(shù)據(jù)后不同字母者表示在0.05水平上差異顯著(DMRT 法)。Data were mean±SE, values in same column followed by different letters were significantly different at 0.05 level by DMRT.2.2 5株金龜子綠僵菌菌株對(duì)椰子織蛾的毒力

經(jīng)金龜子綠僵菌不同菌株配制的1.0×108個(gè)/mL孢子懸浮液處理后,椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)均有死亡,第4天的累計(jì)死亡率見(jiàn)表2。不同金龜子綠僵菌菌株對(duì)椰子織蛾的致病性存在很大差異,菌株LS-Y1、LS-Y6、R3對(duì)椰子織蛾的毒力較高,菌株LS-Y1對(duì)椰子織蛾的致病力最高,侵染后第4天,校正死亡率為66.67%,與菌株LS-G2、LS-G3差異顯著(P<0.05);菌株LS-G2對(duì)椰子織蛾的毒力最低,為17.22%。

2.3 綠僵菌菌株LS-Y1對(duì)椰子織蛾的毒力

生物測(cè)定結(jié)果顯示菌株LS-Y1對(duì)椰子織蛾幼蟲(chóng)具有高殺蟲(chóng)活性,第2天中毒的椰子織蛾陸續(xù)開(kāi)始死亡,死亡蟲(chóng)體色不變,但失去光澤,身體僵硬失去彈性。第3天部分蟲(chóng)體長(zhǎng)出白色菌絲;第4天部分蟲(chóng)體全身長(zhǎng)滿菌絲,且有淡綠色孢子產(chǎn)生;第5天橄欖綠色孢子覆蓋幼蟲(chóng)全身(圖1a);而對(duì)照試蟲(chóng)表現(xiàn)食量較大,蟲(chóng)活躍,發(fā)育正常(圖1b)。

圖1 椰子織蛾3齡期染菌幼蟲(chóng)與健康幼蟲(chóng)比較Fig.1 Comparison of the diseased 3rd instar larvae of Opisina arenosella with the healthy larvae

利用IBM-SPSS 21.0軟件對(duì)椰子織蛾3齡期幼蟲(chóng)進(jìn)行半致死濃度分析,金龜子綠僵菌LS-Y1不同濃度處理椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)的致死濃度回歸方程為Y=4.15+1.32X,表明其致死率與濃度成正比,LC50為4.41×106個(gè)/mL,95%置信區(qū)間為2.63×106～7.41×106個(gè)/mL。在6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108個(gè)/mL 孢子濃度處理下,金龜子綠僵菌LS-Y1對(duì)椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)的 LT50分別為5.77、4.88、4.43、3.82和3.36 d,LT50隨著孢子懸浮液濃度的增加而遞減(圖2)。

圖2 金龜子綠僵菌菌株LS-Y1 不同濃度處理的椰子織蛾3齡幼蟲(chóng)逐日累計(jì)死亡率Fig.2 The daily accumulative mortalities of the 3rd instar larvae of Opisina arenosella treated with the strain LS-Y1 at different spores concentrations

3 討論

本研究中的5株金龜子綠僵菌菌株在1×108個(gè)/mL 孢子濃度處理下,對(duì)椰子織蛾的室內(nèi)毒力差異較大,其中分離自第一寄主椰子織蛾的菌株LS-G2與LS-G3對(duì)椰子織蛾毒力明顯低于分離自第二寄主的紅棕象甲菌株R3,表明金龜子綠僵菌的毒力高低與是否是分離自第一寄主并無(wú)直接聯(lián)系。同時(shí),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離自紅棕象甲僵蟲(chóng)的菌株對(duì)椰子織蛾也有較高的毒力,基于棕櫚作物害蟲(chóng)椰子織蛾、紅棕象甲有混合發(fā)生的實(shí)際情況[15],今后有必要開(kāi)展以上菌株對(duì)紅棕象甲的致病性測(cè)定工作,以拓寬菌株的防治范圍。

采用本試驗(yàn)篩選的金龜子綠僵菌菌株LS-Y1 1×108個(gè)/mL 孢子濃度處理椰子織蛾，4 d后累計(jì)死亡率接近66.67%,說(shuō)明該菌株對(duì)椰子織蛾具有相對(duì)較高的毒力,但由于田間氣候條件復(fù)雜,尚需研究適合于田間應(yīng)用的金龜子綠僵菌菌劑、施用方法等,今后將就該菌株對(duì)椰子織蛾不同蟲(chóng)態(tài)的毒力、不同劑型與環(huán)境的兼容性、與其他生防產(chǎn)品的協(xié)調(diào)防控等方面開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)椰子織蛾幼蟲(chóng)有較高毒力的綠僵菌菌株LS-Y1,這是首次報(bào)道金龜子綠僵菌對(duì)棕櫚科作物重要害蟲(chóng)椰子織蛾幼蟲(chóng)有生物活性,表明其具有較大的生防潛力。但是尚未測(cè)定該菌株對(duì)椰子織蛾成蟲(chóng)的生物活性,下一步將優(yōu)化試驗(yàn)方案進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株對(duì)椰子織蛾成蟲(chóng)的生物活性。

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(責(zé)任編輯:楊明麗)

Screening of highly toxic strains of Metarhizium anisopliae againstOpisinaarenosellaWalker

Sun Xiaodong1,2, Li Fuheng2, Yan Wei1, Li Chaoxu1, Lü Chaojun1, Qin Weiquan1

(1. Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China;2. College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

OpisinaarenosellaWalker is an important insect pest on palm plants in the tropical area of China. In order to find efficient biocontrol agent againstO.arenosella, fourMetarhiziumanisopliaestrains with good cultural characters were obtained from dead overwinteringO.arenosellalarvae collected from Lingshui, Hainan Province. The strains were identified by molecular method and their toxicities against the 3rd instar ofO.arenosellawere investigated in laboratory. Strain LS-Y1 demonstrated high toxicity againstO.arenosella. NCBI BLAST with the rDNA-ITS fragments from the four tested strains revealed that the nucleotide sequences of these genes have the similarity of 99%, 100%, 99% and 99% with the sequences of JN377427.1, NR132017.1, FJ545278.1, FJ545294.1, respectively. LC50value of LS-Y1 on the 3rd instar larvae ofO.arenosellawas 4.41×106conidia/mL 6 days after treatment. The LT50values of LS-Y1 on the 3rd instar larvae ofO.arenosellaat the spores concentrations of 6.25×106, 1.25×107, 2.5×107, 5×107and 1×108conidia/mL were 5.77 d, 4.88 d, 4.43 d, 3.82 d and 3.36 d, respectively. These results showed that the strain LS-Y1 was highly toxic againstO.arenosellalarvae, which was the promising candidate in the biological control ofO.arenosella.

Metarhiziumanisopliae;Opisinaarenosella; molecular identification; toxicity

2015-12-03

2016-02-18

海南省重大科技項(xiàng)目(ZDZX2013008)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金

S 436.67

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.039

* 通信作者 E-mail: qwq268@163.com