劉 婷，夏鵬亮，解曉菲，羅心誠(chéng)，王 怡，胡宗偉，張浩然，張 燚，王玉雪，王香萍，張建民*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434000；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000)

內(nèi)生昆蟲(chóng)病原真菌(Endophytic insect-pathogenic fungi，EIPF)具有多種功能，作為殺蟲(chóng)劑可穿透害蟲(chóng)表皮層直接感染和殺死害蟲(chóng)，部分則可定殖于植物根系為植物提供多種益處，包括促生、提高植物抗逆性以及防治害蟲(chóng)等作用[1-2]。

目前，昆蟲(chóng)病原真菌綠僵菌作為殺蟲(chóng)劑已廣泛用于害蟲(chóng)的綠色防控，部分綠僵菌可作為植物內(nèi)生菌，對(duì)植物生長(zhǎng)和抗逆境等具有積極的影響，這在近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。本文主要對(duì)植物內(nèi)生綠僵菌的研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析和闡述。

1 綠僵菌的基本特性

綠僵菌(MetarhiziumSpp.)隸屬于真菌門(mén)(Eumycota)子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)核菌綱(Pyrenomyceles)球殼菌目(Sphaeriales)麥角菌科(Clavicipitetaceae)。在1879年俄國(guó)生物學(xué)家Metchnikoff首次從奧地利金龜子上成功分離得到金龜子綠僵菌(M.anisopliae)，并將其應(yīng)用于防治奧地利金龜子(Anisopliaaustriaca)和甜菜象甲(Cleonuspunativentris)，隨后綠僵菌逐漸成為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)生物防治的研究熱點(diǎn)[3]。隨著研究的逐步深入，人們陸續(xù)認(rèn)識(shí)到綠僵菌是一類(lèi)種類(lèi)豐富、分布廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，可感染和殺死各類(lèi)節(jié)肢動(dòng)物(包括昆蟲(chóng))。同時(shí)，大多數(shù)綠僵菌還是腐生菌、根際真菌及有益根系內(nèi)生菌，并具備在不同生命周期轉(zhuǎn)換的能力[4]。綠僵菌具有5個(gè)基本特征：菌落初期呈現(xiàn)出白色，產(chǎn)孢時(shí)表現(xiàn)出不同程度的綠色；分生孢子梗單生或者聚集，呈分生孢子梗座；分生孢子以粘液粘成平行排列的柱狀孢子團(tuán)；分生孢子長(zhǎng)形至長(zhǎng)橢圓形；可感染寄生昆蟲(chóng)[5]。綠僵菌生長(zhǎng)最適溫度在24～26℃之間，最適pH值在6.9～7.4之間，此外，綠僵菌適合生長(zhǎng)在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中。在干燥的情況下，綠僵菌分生孢子可以保存3年以上[6]。迄今為止，已報(bào)道的綠僵菌可以在直翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目等8個(gè)目42個(gè)科200多種昆蟲(chóng)體內(nèi)寄生，甚至可在螨類(lèi)及線蟲(chóng)等中寄生[7]。以上特點(diǎn)使綠僵菌成為廣泛使用的生物殺蟲(chóng)劑之一。

2 植物內(nèi)生綠僵菌的功能及機(jī)理

植物內(nèi)生綠僵菌的主要功能是具有殺蟲(chóng)作用、促生作用以及提高植物抗病蟲(chóng)的能力。

2.1 對(duì)植物的促生作用

綠僵菌除了殺蟲(chóng)作用外，一些綠僵菌還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。已有多個(gè)研究表明綠僵菌可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，尤其是在脅迫條件下。如綠僵菌可顯著增加洋蔥產(chǎn)量，促進(jìn)番茄果實(shí)變大，促進(jìn)鹽脅迫下豌豆幼苗和缺肥條件下玉米的生長(zhǎng)[8-11]。一般情況下，綠僵菌等真菌通過(guò)吸收磷和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)顯著促進(jìn)植物生長(zhǎng)，此外，還可從腐爛的有機(jī)物中捕獲氮素，并有助于氮在土壤中儲(chǔ)存[12]。有研究表明，綠僵菌可通過(guò)浸種、種子包衣等方法與植物建立共生關(guān)系[13-14]。而綠僵菌和植物共生關(guān)系建立與綠僵菌黏附素(MAD2)有關(guān)，當(dāng)分生孢子接觸植物根表面時(shí)，MAD2促進(jìn)分生孢子附著到根表面[15]。但是綠僵菌如何穿透植物表皮，而且植物細(xì)胞間的綠僵菌菌絲如何循序漸進(jìn)的在細(xì)胞壁周?chē)L(zhǎng)上尚不清楚。相關(guān)研究表明金龜子綠僵菌的MAD1黏附素與對(duì)昆蟲(chóng)的毒力相關(guān)，而MAD2黏附素則能夠使金龜子綠僵菌黏附于植物，這一事實(shí)表明金龜子綠僵菌具有特殊的基因來(lái)維持其雙功能的生活方式[16]。其他的特異性調(diào)控基因則包括一種新型的運(yùn)輸根際和根定殖所需的根源養(yǎng)分低聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，一種在腐食營(yíng)養(yǎng)和致病性中扮演重要角色的RNA結(jié)合蛋白[17]，一種幫助調(diào)節(jié)水解酶的轉(zhuǎn)化酶[18]。此外，綠僵菌能在整個(gè)冬季在卷心菜的根部保持較高水平，這種優(yōu)勢(shì)可使作為根內(nèi)生菌的綠僵菌在植物死亡后為自身營(yíng)腐生生活提供營(yíng)養(yǎng)[19]。目前綠僵菌在植物中的內(nèi)生作用已在棉花、玉米和番茄等植物中進(jìn)行了大量研究，如廖興剛等研究發(fā)現(xiàn)羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)(Mr2575，Mr23和Mr1046)、M.anisopliae(Ma808，Ma932和Ma939)、M.brunneum(Mb820，Mb1187和Mb2974)及M.acridum(Mac324)等綠僵菌均能定殖玉米根部，菌株Mb820、Ma939對(duì)玉米幼苗葉片發(fā)育增效最高達(dá)42.8%，Mr23對(duì)玉米莖稈生長(zhǎng)增效最高達(dá)15.7%[20]。Sasan和Bidochka等發(fā)現(xiàn)羅伯茨綠僵菌能夠定殖于柳枝稷草和扁豆植株中，并表現(xiàn)出促進(jìn)根毛的生長(zhǎng)作用[21]。此外，近幾年來(lái)，金龜子綠僵菌與昆蟲(chóng)及植物宿主互作關(guān)系的相關(guān)研究已成為昆蟲(chóng)病原真菌開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究領(lǐng)域的新方向。目前，已初步探明金龜子綠僵菌能定殖于植物根部[19]，還可利用植物根部分泌的蔗糖和棉籽糖等多糖類(lèi)碳源物質(zhì)營(yíng)腐生生活[18]。

2.2 提升植物的抗蟲(chóng)性

現(xiàn)有研究表明，許多昆蟲(chóng)病原真菌可提升植物的抗蟲(chóng)性。如Quesada-Moraga等從罌粟癭蜂(Iraellaluteipes)幼蟲(chóng)體內(nèi)分離出一株球孢白僵菌，并通過(guò)種子處理成功定殖于罌粟中，定殖后的植株表現(xiàn)出一定的抗蟲(chóng)性[22]。此外，孫藝昕等報(bào)道4株玉米內(nèi)生真菌(一株為白僵菌)可影響玉米蚜的生長(zhǎng)發(fā)育，且具有趨避作用[23]。綠僵菌作為真菌，也具有提升宿主作物抗蟲(chóng)性的作用。Liao等報(bào)道金龜子綠僵菌在與宿主植物共生期間，可殺死取食根部的害蟲(chóng)并轉(zhuǎn)移氮素給植株以維系自身的養(yǎng)分來(lái)源，或通過(guò)分泌植物發(fā)育必需的某些生長(zhǎng)激素(如IAA)激活植物免疫系統(tǒng)，提高對(duì)病蟲(chóng)害的防御等途徑促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)[24]。而Ahmad等報(bào)道玉米內(nèi)生菌羅伯茨綠僵菌可促進(jìn)玉米植株生長(zhǎng)，抑制小地老虎(Agrotisipsilon)的發(fā)育和改變植物防御基因的表達(dá)[25]。綜上所述，一些昆蟲(chóng)病原真菌綠僵菌在植物上定殖后，可在一定程度上提高植物的抗蟲(chóng)性。

2.3 直接殺蟲(chóng)功能

綠僵菌的殺蟲(chóng)功能及機(jī)理研究一直是綠僵菌相關(guān)研究的重點(diǎn)。綠僵菌可通過(guò)分生孢子對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行觸殺，且不同于必須通過(guò)攝入才能致病的細(xì)菌和病毒，綠僵菌通常只需通過(guò)穿透昆蟲(chóng)表皮層就可感染昆蟲(chóng)。因此，綠僵菌特別適合發(fā)展為生物農(nóng)藥，替代化學(xué)殺蟲(chóng)劑。相關(guān)殺蟲(chóng)機(jī)理研究表明，綠僵菌在識(shí)別到一種合適的昆蟲(chóng)寄主后，即可通過(guò)形成感染結(jié)構(gòu)(附著胞)和分泌不同的特異性效應(yīng)子穿透昆蟲(chóng)表皮層，然后通過(guò)產(chǎn)生芽生孢子和器官特異性效應(yīng)子用于侵染昆蟲(chóng)的血腔[26]。綠僵菌主要借用表皮層降解酶和機(jī)械壓力分解穿透和同化昆蟲(chóng)的表皮層，同時(shí)克服侵染過(guò)程中遇到的障礙[27]。綠僵菌一旦到達(dá)血腔就會(huì)成功獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和避免能夠吞噬和包裹入侵微生物的抗菌蛋白和循環(huán)細(xì)胞(血細(xì)胞)而進(jìn)行繁殖[28]。一旦寄主死亡后綠僵菌就會(huì)從內(nèi)到外破壞角質(zhì)層產(chǎn)生分生孢子，之后在傳播過(guò)程中開(kāi)始新的感染。

3 綠僵菌與植物根際微生物群相互作用及其與昆蟲(chóng)-植物的關(guān)系

在自然界中綠僵菌會(huì)與整個(gè)寄主植物根際相關(guān)的微生物群相互作用，包括作為促進(jìn)生長(zhǎng)的根際細(xì)菌或真菌生防菌等有益微生物[29]。如某些木霉(Trichodermaspp.)種類(lèi)產(chǎn)生的SM(6-pentyl-alpha-pyrone，peptaibols，harzianum A and aspinolides)可誘發(fā)植物防御病害，同時(shí)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育也具有積極的影響[30]。綠僵菌與木霉存在相關(guān)性[31]，且有研究表明，它們?cè)趯?duì)植物的作用中存在共性：M.robertsii綠僵菌和根際生防真菌木霉(T.virens)都能進(jìn)行蔗糖代謝和控制根系定殖[18]。然而，綠僵菌和木霉在寄主根系定殖的機(jī)制存在差異[32]。

同時(shí)，有研究表明綠僵菌與植物、昆蟲(chóng)之間的聯(lián)系主要是在營(yíng)養(yǎng)的基礎(chǔ)之上，它們?nèi)叩年P(guān)系是互惠互利、相互依存的。此外，植物可以昆蟲(chóng)作為氮的來(lái)源[33]，如豬籠草在充滿(mǎn)液體的深腔中誘捕昆蟲(chóng)后可獲得氮源，昆蟲(chóng)產(chǎn)生的氮可占植物氮含量的70%[34]。綠僵菌還可以寄生并殺死土壤中的昆蟲(chóng)，然后將昆蟲(chóng)產(chǎn)生的氮轉(zhuǎn)移到植物中供植物生長(zhǎng)利用[35]。同樣植物的生長(zhǎng)也有益于綠僵菌，植物可通過(guò)光合作用為綠僵菌提供碳[36]。這樣綠僵菌從昆蟲(chóng)體內(nèi)獲得的氮源越多，宿主植物生長(zhǎng)的就越茂盛，從而回饋越多的碳源給綠僵菌，最終形成一種互惠互利的穩(wěn)定關(guān)系：生長(zhǎng)旺盛的植物可為綠僵菌提供更大更穩(wěn)定的棲息地，同時(shí)綠僵菌的寄生可以進(jìn)一步滋養(yǎng)和保護(hù)植物。因而通過(guò)根施、浸根或澆灌等方法將綠僵菌施用于土壤，不但有利于綠僵菌的生存，而且還可有效防治地下害蟲(chóng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)植株上害蟲(chóng)的防治亦具有良好的效果，可做到“一菌多用”。

4 綠僵菌在害蟲(chóng)綠色防控中的應(yīng)用潛力

綠僵菌目前作為殺蟲(chóng)劑已在世界各地得到廣泛應(yīng)用。在世界上最成功的生物控制項(xiàng)目之一就是在巴西每年使用金龜子綠僵菌防治200萬(wàn)hm2的甘蔗田害蟲(chóng)沫蟬[37]。但是，綠僵菌使用的最大限制是殺蟲(chóng)效率慢，雖然這有利于綠僵菌從害蟲(chóng)體內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)。此外，綠僵菌同樣也具有其他微生物農(nóng)藥無(wú)法避免的問(wèn)題。如Nahar等研究證明綠僵菌在繼代培養(yǎng)幾代后，其ITS序列并沒(méi)有任何變化，但是毒力卻出現(xiàn)下降，表明綠僵菌對(duì)害蟲(chóng)毒力的穩(wěn)定性對(duì)于綠僵菌商品化至關(guān)重要[38]。綠僵菌在使用時(shí)還存在其它一些缺陷，主要表現(xiàn)在：效果較緩慢，作用成分復(fù)雜，有害生物控制范圍較窄，易受環(huán)境因素的影響，產(chǎn)品有效期短、質(zhì)量穩(wěn)定性較差。目前，隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)組成性表達(dá)綠僵菌毒力基因提高殺蟲(chóng)活性或者將外源毒素基因?qū)刖G僵菌并獲得超表達(dá)，從而克服了這些缺陷并提高了綠僵菌殺蟲(chóng)效率。如郭冰峰先后進(jìn)行了多種與綠僵菌毒力相關(guān)的基因的克隆和功能分析研究[39]。此外，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也可以應(yīng)用于昆蟲(chóng)病原真菌綠僵菌中[40]。另外，還可以將綠僵菌與其他低毒高效的化學(xué)農(nóng)藥或者一些植物源藥劑混合使用，降低田間環(huán)境因素的干擾。如研究表明綠僵菌與多種化學(xué)藥劑具有良好的相容性，可與多種化學(xué)農(nóng)藥甚至寄生蜂等協(xié)同作用而達(dá)到增效的效果[41-42]。

綠僵菌作為重要的生物殺蟲(chóng)劑之一，在害蟲(chóng)的綠色防控中占據(jù)十分重要的地位。將綠僵菌通過(guò)種衣，根施、浸根和澆灌等方式帶入土壤，不僅對(duì)地下害蟲(chóng)具有良好的防控作用，而且可以促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高農(nóng)作物的抗病蟲(chóng)能力。此外，部分內(nèi)生綠僵菌還表現(xiàn)對(duì)某些植物病原微生物具有拮抗作用，比如Ramanpreet等發(fā)現(xiàn)羅伯茨綠僵菌對(duì)豆科植物病原菌枯萎病菌具有一定的拮抗作用[43]。其次，綠僵菌具有多功能的生活方式，除了寄生昆蟲(chóng)之外還可以營(yíng)腐生生活，在適宜的條件下能夠大量的繁殖，持續(xù)控制害蟲(chóng)。此外，土壤的存在對(duì)綠僵菌具有一定的保護(hù)作用，如可防止紫外線的傷害和溫度的急劇變化[44-45]?？傊?，植物內(nèi)生綠僵菌對(duì)于農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育和害蟲(chóng)的綠色防控具有極大的挖掘與開(kāi)發(fā)潛力。