蘭旭 顧正棟 丁艷菲 王珂 江瓊 朱誠(chéng)

(中國(guó)計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院/浙江省海洋食品品質(zhì)與危害物控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310018；*通訊聯(lián)系人， E-mail: pzhch@cjlu.edu.cn)

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花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花生理特性的影響

蘭旭 顧正棟 丁艷菲 王珂 江瓊 朱誠(chéng)*

(中國(guó)計(jì)量學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院/浙江省海洋食品品質(zhì)與危害物控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310018；*通訊聯(lián)系人， E-mail: pzhch@cjlu.edu.cn)

LAN Xu, GU Zhengdong, DING Yanfei, et al. Effect of high temperature stress on physiological characteristics of spikelet of rice during flowering stage. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 637-646.

以野生型水稻中花11及其耐熱型突變體(hst)為材料，于抽穗揚(yáng)花期高溫處理7 d (40℃，每天處理6 h)，探討開花期水稻穎花生理特性與耐熱性之間的關(guān)系。研究表明，花期高溫導(dǎo)致劍葉葉綠素含量、穎花可溶性蛋白和可溶性糖含量均顯著下降，突變體hst的降幅明顯小于野生型中花11；同時(shí)，高溫下穎花中丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)及游離脯氨酸含量均顯著增加，而突變體hst的增幅明顯低于野生型中花11。在抗氧化酶活性方面，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及過氧化氫酶(CAT)活性對(duì)水稻開花期高溫脅迫的響應(yīng)有所不同，其變化與耐熱性之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。高溫脅迫下水稻劍葉中保持較穩(wěn)定的光合作用，穎花中保持較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及較低的MDA和H2O2含量，是突變體耐高溫的生理基礎(chǔ)。

水稻； 抽穗揚(yáng)花期； 高溫脅迫； 穎花； 生理特性

近年來，隨著全球工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，溫室氣體大肆排放，導(dǎo)致全球表面平均氣溫逐步上升，極端高溫天氣頻發(fā)。據(jù)預(yù)測(cè)，到21世紀(jì)末，全球溫度將升高2～4℃[1]，夏季炎熱期可能延長(zhǎng)，高溫?zé)岷⒊蔀樽魑锷L(zhǎng)的主要限制因素之一[2.3]。水稻是重要的糧食作物，世界近一半的人口以水稻為主食。水稻最適生長(zhǎng)溫度是28～32℃[4]，據(jù)報(bào)道，水稻生長(zhǎng)期間，平均夜間最低溫度每升高1℃，水稻產(chǎn)量就下降10%[3]。2013年中國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)的最高溫度和保持高溫的天數(shù)均創(chuàng)歷史新高，嚴(yán)重影響稻米產(chǎn)量與品質(zhì)，威脅長(zhǎng)江流域這一重要商品糧基地的生產(chǎn)安全[5]。我國(guó)人口眾多，水稻高產(chǎn)依然是我國(guó)糧食生產(chǎn)的首要條件，也是保障我國(guó)糧食安全的重要措施之一[6]。因此，在全球氣候持續(xù)變暖、極端高溫頻發(fā)的背景下,開展水稻耐熱性研究對(duì)于確保糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有十分重要的戰(zhàn)略意義。

日本學(xué)者Yoshida等[7]通過大量研究證明，水稻揚(yáng)花期是對(duì)高溫脅迫最敏感的時(shí)期。周建霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)高溫處理下穎花育性對(duì)開花當(dāng)天高溫最敏感，而高溫后移處理下穎花育性對(duì)開花期前1 d高溫最敏感，開花前高溫主要 通過影響花藥散粉、花粉粒萌發(fā)和花粉管延伸從而引起穎花敗育。謝曉金等[9]研究表明，高溫脅迫下水稻花藥中的脯氨酸(pro)、游離氨基酸、可溶性蛋白質(zhì)、抗壞血酸(ASA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量較對(duì)照處理均顯著降低(P<0.01)，并且隨著脅迫溫度的升高與脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其花粉活力、花粉萌發(fā)率、結(jié)實(shí)率、每穗實(shí)粒數(shù)與單株產(chǎn)量均有所下降。張桂蓮等[10]研究認(rèn)為，高溫脅迫下水稻花藥保持較高抗氧化酶活性、較好的花粉散落特性和花粉萌發(fā)特性及較低的膜透性和丙二醛(MDA)含量，是品種耐高溫的生理基礎(chǔ)。受精過程是水稻產(chǎn)生籽粒的必要環(huán)節(jié)，對(duì)水稻結(jié)實(shí)產(chǎn)生重要影響[11]。抽穗揚(yáng)花期對(duì)高溫最為敏感，極易導(dǎo)致花粉敗育和子房受精受阻，空粒率大幅度提高，結(jié)實(shí)率大幅度下降，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[12-14]。

水稻作為模式植物被研究多年，但目前關(guān)于高溫對(duì)水稻影響機(jī)理的系統(tǒng)研究大多是在不同的基因型材料中開展的，而同種植物不同的基因型對(duì)于熱脅迫的耐性反應(yīng)機(jī)制不完全相同。本研究的材料是實(shí)驗(yàn)室自繁的粳稻品種中花 11(ZH11)和已通過多次自交獲得純合體的ZH11為背景的耐高溫突變體(hst)，我們對(duì)突變體hst的突變基因進(jìn)行了初步定位和克隆，發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)區(qū)段一個(gè)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因發(fā)生了4個(gè)堿基插入，造成了移碼突變，導(dǎo)致了該基因功能缺失。遺傳分析表明，該突變體屬單基因隱性突變，由于突變基因HST功能的缺失，使得突變體具有了花期耐高溫的能力，因此HST為水稻花期耐高溫的負(fù)調(diào)控因子。利用突變體開展熱脅迫方面的研究工作在擬南芥中開展較多，在水稻中開展很少。本研究利用人工氣候室對(duì)生殖生長(zhǎng)期-抽穗開花期遺傳背景相同但耐高溫性狀具有顯著差異的兩水稻品系進(jìn)行高溫處理，通過對(duì)穎花生理生化指標(biāo)的測(cè)定，探討開花期穎花生理生化特性變化與耐熱性的關(guān)系，探明開花期高溫脅迫對(duì)水稻花器官的影響機(jī)理，為選育耐熱性水稻品種或改良已有高產(chǎn)水稻品種的耐熱性提供理論依據(jù)。特別是以水稻耐熱突變體為研究材料，為耐熱機(jī)制的闡明及利用分子技術(shù)選育水稻耐高溫品種提供了更好的平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料是本實(shí)驗(yàn)室自繁的粳稻品種中花 11和已通過多次自交獲得純合體的中花11為背景的耐高溫突變體hst。二者在耐熱性方面具有顯著差異，在高溫條件下種植，前者的結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量受到明顯影響，而后者受影響較小，兩品系熱脅迫指數(shù)差異顯著(P<0.01)。試驗(yàn)于2015年在中國(guó)計(jì)量學(xué)院進(jìn)行，2015年3月10日和4月12日分兩期播種，并于4月11日和5月10日移栽。待水稻生長(zhǎng)到抽穗揚(yáng)花期前10 d，將生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程基本一致的植株移栽到盆缽中，每盆8株，每批次共計(jì)40盆。當(dāng)水稻生長(zhǎng)到抽穗揚(yáng)花期前1 d，將其移入人工氣候室，抽穗揚(yáng)花期當(dāng)天，分別進(jìn)行高溫和適溫處理，高溫處理如下：30℃(6:00-9:00)、40℃(9:00-15:00)、30℃(15:00-19:00)、23℃(19:00-6:00)，相對(duì)濕度為60%。適溫處理溫度如下28℃(6：00-19：00)、23℃(19：00-6：00)，相對(duì)濕度為60%。高溫處理7 d，并于處理1、3、5和7 d后分別取樣，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3次。高溫處理結(jié)束后，將植株移到適溫條件下繼續(xù)生長(zhǎng)到成熟，進(jìn)行考種和測(cè)產(chǎn)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 結(jié)實(shí)率、千粒重等農(nóng)藝性狀測(cè)定

對(duì)開花前1 d的水稻連續(xù)高溫處理7 d，處理結(jié)束后移至適溫條件下恢復(fù)培養(yǎng)至結(jié)實(shí)，考查每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重、單株產(chǎn)量、結(jié)實(shí)率及受精率。受精率(%) = (秕粒數(shù)+飽粒數(shù))/(空粒數(shù)+秕粒數(shù)+飽粒數(shù))×100%。

1.2.2 穎花生理指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 抗氧化酶活性測(cè)定

抗氧化保護(hù)酶[過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)]活性采用蔡沖主編的《植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》方法[15]測(cè)定。

1.2.2.2 丙二醛(MDA)含量測(cè)定

稱取0.5 g新鮮主莖稻穗穎花樣品，加入2 mL預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.8)，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5 mL刻度離心試管中，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5 mL。4500 r/min、4℃下離心10 min，上清液即為MDA提取液，測(cè)量提取液的體積，采用硫代巴比妥酸比色法[16]測(cè)定。

1.2.2.3 可溶性糖含量測(cè)定

稱取0.1～0.3 g新鮮主莖穎花樣品，剪碎后放入刻度試管中，加入5～10 mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，提取液過濾入25 mL容量瓶中，反復(fù)沖洗試管及殘?jiān)ㄈ葜量潭?，采用蒽酮比色法[17]測(cè)定可溶性糖含量。

1.2.2.4 游離脯氨酸含量測(cè)定

稱取0.3～0.5 g新鮮主莖穎花樣品，剪碎后放入具塞試管中，加5 mL 3%磺基水楊酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10 min，收集過濾液，采用磺基水楊酸提取，茚三酮顯色法測(cè)定。

1.2.2.5 可溶性蛋白含量測(cè)定

稱取0.3～0.5 g新鮮主莖稻穗穎花樣品，置于冷凍過的研缽中加50 mmol/L Tris-HCl提取液3 mL，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成勻漿，勻漿倒入離心管中，再用5 mL提取液(分2次)將研缽中勻漿洗入離心管。10000 r/min、4℃下離心20 min，上清液即為可溶性蛋白質(zhì)提取液，采用考馬斯亮藍(lán)比色法[18]測(cè)定。

1.2.2.6 過氧化氫含量測(cè)定。

稱取0.1 g新鮮主莖穎花樣品，加入3 mL預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液 (即PBS，50 mmol/L,pH 6.5 ),冰浴研磨。勻漿液在6000×g、4℃下離心25 min,上清即為H2O2提取液。加入1 mL 0.1%四氯化鈦(含20% H2SO4)?；旌弦涸?000×g、4℃下離心15 min。取上清測(cè)定波長(zhǎng)410 nm的OD值，消光系數(shù)0.28 μmol/cm，CH2O2(μmol/L)=OD410×3000/28。

1.2.2.7 劍葉中葉綠素含量測(cè)定。

稱取0.2 g新鮮水稻劍葉樣品，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3 mL 95%乙醇，研成勻漿，再加95%乙醇10 mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5 min，取濾紙一張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25 mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至25 mL，搖勻。采用分光光度計(jì)比色法[12]測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和方差分析采用Microsoft Excel和SPSS軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀

2.1.1 高溫脅迫對(duì)水稻受精率的影響

從圖1可知，在適溫條件下，兩水稻品系的受精率沒有顯著差異；在高溫脅迫下，兩水稻品系的受精率均顯著降低，野生型中花11的受精率比適溫下降低62.90個(gè)百分點(diǎn)，突變體hst的受精率比適溫下降低35.54個(gè)百分點(diǎn)；高溫下兩品系水稻的受精率存在顯著差異(P<0.05)，突變體hst的受精率顯著高于野生型中花11。由此可以說明，突變體hst的受精率受高溫?zé)岷Φ挠绊戄^野生型中花11小。

2.1.2 高溫脅迫對(duì)水稻結(jié)實(shí)率、千粒重及產(chǎn)量的影響

從表1可知，在適溫條件下，兩品系水稻的千粒重、每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率均沒有顯著差異，而突變體hst的單株產(chǎn)量相對(duì)野生型中花11顯著增加。與適溫條件相比，兩水稻品系在高溫脅迫下的每穗實(shí)粒數(shù)、單株產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率均顯著下降。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，突變體hst水稻每穗實(shí)粒數(shù)、單株產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率較野生型中花11均有升高且差異達(dá)顯著水平，而千粒重呈顯著下降趨勢(shì)。熱敏感指數(shù)能有效地反映水稻受高溫?zé)岷Φ某潭?，其值越大，熱害越?yán)重。本研究結(jié)果顯示，野生型中花11的熱害程度為80.24%，而突變體hst為46.87%。結(jié)果表明突變體hst在高溫脅迫下的熱害程度相對(duì)野生型中花11明顯降低，即突變體hst受高溫?zé)岷Τ潭容^小。

ZH11-T-高溫脅迫下野生型中花11；hst-T-高溫脅迫下突變體；ZH11-CK-適溫條件下的野生型中花11;hst-CK-適溫條件下的突變體；圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；n=30；相同字母表示差異未達(dá)0.05 顯著水平。下同。

ZH11-T, Wild type under high temperature stress;hst-T， Mutant under high temperature stress; ZH11-CK， Wild type under natural condition;hst-CK， Mutant under natural condition; All data are mean±standard deviation;n=30; The same letter indicates no significant difference at 0.05 significant level. The same below.

圖1 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花受精率的影響

Fig. 1. Effect of high temperature stress on the fertilized rate of spikelets at the flowering stage.

表1 高溫脅迫對(duì)水稻結(jié)實(shí)率、千粒重及單株產(chǎn)量的影響

Table 1. Effect of high temperature stress on rice seed-setting rate,1000-grain weight and yield per plant.

品系Line處理Treatment千粒重1000-grainweight/g每穗實(shí)粒數(shù)Grainnumberperpanicle單株產(chǎn)量Yieldperplant/g結(jié)實(shí)率Seed-settingrate/%熱敏感指數(shù)HSI/%中花11Zhonghua11適溫CK23.92±0.02c48.6±5.6a20.94±1.34b68.1±9.5a80.24高溫T26.41±0.07a10.0±2.5c4.80±0.48d13.4±2.9c突變體hst適溫CK24.09±0.01b57.9±6.0a29.26±1.71a72.8±10.3a46.87高溫T24.19±0.09b27.1±3.7b13.79±0.99c38.4±4.8b

CK-適溫; T-高溫。下同。結(jié)實(shí)率=飽粒數(shù)/總粒數(shù)×100%；熱敏感指數(shù)(HSI)=(適溫結(jié)實(shí)率-高溫結(jié)實(shí)率)/適溫結(jié)實(shí)率×100%；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n=30。同一列中相同字母表示差異未達(dá)0.05 顯著水平。下同。

CK，Natural condition；T，High temperature condition； Seed-setting rate(%)= Full grain number/Total grain number×100%; Heat sensitivity index(HSI) = (Seed-setting rate under natural condition - seed-setting rate under high temperature condition) / seed-setting rate under natural condition ×100%; All data are mean±standard deviation;n=30; The same letter in the same column indicates no significant difference at 0.05 significant level. The same below.

2.2 生理特性

2.2.1 高溫脅迫對(duì)水稻劍葉中葉綠素含量的影響

光合作用被認(rèn)為是對(duì)高溫最敏感的過程之一，高溫主要影響類囊體的物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)組織，導(dǎo)致細(xì)胞膜的解體和細(xì)胞組分的降解，影響植物的光合效率[19]。本研究在不同處理?xiàng)l件下測(cè)定了水稻揚(yáng)花期劍葉中的葉綠素含量，結(jié)果如圖2。從圖2可知，高溫處理后，野生型中花11劍葉葉綠素含量與適溫下相比顯著下降，而突變體hst劍葉葉綠素含量與適溫下相比變化并不明顯；在相同的高溫脅迫條件下，野生型中花11劍葉葉綠素含量的降幅明顯高于突變體hst。這說明突變體hst的光合作用受高溫?zé)岷Φ挠绊戄^野生型中花11小。

2.2.2 高溫脅迫對(duì)水稻穎花可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影響

2.2.2.1 對(duì)水稻穎花可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用[20]。由圖3可知，高溫脅迫導(dǎo)致中花11及其突變體hst的穎花中可溶性蛋白含量

圖2 花期高溫脅迫對(duì)水稻劍葉中葉綠素含量的影響

Fig. 2. Effect of high temperature stress on chlorophyll content in flag leaf of rice at the flowering stage.

顯著下降。高溫處理1 d后這兩個(gè)品系的穎花可溶性蛋白含量下降幅度達(dá)最大值,此時(shí)野生型中花11和突變體hst分別比適溫下降低了49.50%和38.70%；高溫下突變體hst的可溶性蛋白含量降幅低于野生型中花11。突變體hst穎花中可溶性蛋白含量在整個(gè)高溫脅迫期間顯著高于野生型中花11(處理7 d后除外)。

2.2.2.2 對(duì)水稻穎花可溶性糖含量的影響

植物體內(nèi)糖的積累與細(xì)胞的滲透壓有關(guān)，提高滲透性，降低水勢(shì)，增強(qiáng)保水力，通過調(diào)節(jié)滲透濃度來啟動(dòng)脫落酸的形成，誘發(fā)蛋白質(zhì)的合成，增加抗性[21]。由圖4可知，高溫脅迫導(dǎo)致中花11及其突變體hst的穎花可溶性糖含量均顯著降低，處理7 d后降幅達(dá)最大值，此時(shí)野生型中花11比適溫下降低41.54%，突變體hst比適溫下降低26.34%。高溫下突變體hst的可溶性糖含量降幅低于野生型中花11。突變體hst穎花中可溶性糖含量在整個(gè)高溫脅迫期間顯著高于野生型中花11(處理1 d后除外)。

2.2.2.3 對(duì)水稻穎花脯氨酸含量的影響

在逆境脅迫下，游離氨基酸可以維持細(xì)胞的水勢(shì)，解除物質(zhì)毒害和儲(chǔ)存氮物質(zhì)等。研究證實(shí)，在水分脅迫下，植物可通過游離氨基酸的累積參與滲透調(diào)節(jié)，通過滲透勢(shì)的改變來維持膨脹，進(jìn)而抵御高溫干旱脅迫的影響[22]。由圖5可知，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，中花11及其突變體hst的游離脯氨酸含量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)。與適溫條件相比，高溫脅迫1 d和3 d后兩品系水稻穎花中游離脯氨酸含量均升高，且處理3 d后增幅達(dá)最大值，此時(shí)野生型中花11和突變體hst穎花中游離脯氨酸含量分別比適溫下升高25.92%和11.31%。隨后兩品系水稻穎花中游離脯氨酸含量開始降低，處理5 d后脯氨酸含量顯著低于適溫水平；處理7 d后脯氨酸含量與適溫下相比沒有顯著差異。在整個(gè)高溫脅迫期間，突變體hst穎花中游離脯氨酸含量顯著高于野生型中花11(處理7 d后除外)。

2.2.3 高溫脅迫對(duì)水稻穎花SOD、POD和CAT活性的影響

2.2.3.1 對(duì)水稻穎花SOD活性的影響

在膜保護(hù)酶系統(tǒng)中，SOD可清除超氧陰離子和過氧化氫，減少膜系統(tǒng)所受的傷害[23]。由圖6可見，高溫脅迫下中花11及其突變體hst穎花中SOD活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。與適溫條件相比，兩水稻品系SOD活性在高溫脅迫1 d和3 d后均升高，高溫脅迫5 d和7 d后均顯著降低。高溫下野生型中花11穎花中SOD活性顯著高于突變體hst(處理1 d后除外)。

圖3 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花可溶性蛋白含量的影響

Fig. 3. Effect of high temperature stress on soluble protein content in spikelets of rice at the flowering stage.

圖4 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花可溶性糖含量的影響

Fig.4. Effect of high temperature stress on soluble sugar content in spikelets of rice at the flowering stage.

圖5 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花游離脯氨酸含量的影響

Fig. 5. Effect of high temperature stress on free proline content in spikelets of rice at the flowering stage.

圖6 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花SOD活性的影響

Fig. 6. Effect of high temperature stress on SOD activity in spikelets of rice at the flowering stage.

圖7 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花POD活性的影響

Fig. 7. Effect of high temperature stress on POD activity in spikelets of rice at the flowering stage.

圖8 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花CAT活性的影響

Fig. 8. Effect of high temperature stress on CAT activity in spikelets of rice at the flowering stage.

2.2.3.2 對(duì)水稻穎花POD活性的影響

POD主要作用在于清除活性氧，消除過氧化氫的危害，減少膜系統(tǒng)的傷害[24]。從圖7中可以看出，POD活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，處理5 d后活性達(dá)最大值。與適溫條件相比，高溫處理1 d、3 d和5 d后兩品系水稻穎花中POD活性均顯著下降，高溫處理7 d后POD活性變化均不顯著。與野生型中花11相比，在相同高溫處理1d后，突變體hst穎花中POD活性相對(duì)較低；而在高溫處理3 d和5 d后突變體hst水稻穎花中POD活性均相對(duì)較高。

圖9 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花H2O2含量的影響

Fig. 9. Effect of high temperature stress on H2O2content in spikelets of rice at the flowering stage.

2.2.3.3 對(duì)水稻穎花CAT活性的影響

從圖8中可知，CAT活性變化較為復(fù)雜，與適溫條件相比，兩水稻品系穎花中CAT活性在高溫脅迫下均顯著下降(處理3 d后除外)；高溫脅迫下兩水稻品系穎花中CAT活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，處理3 d后達(dá)最大值，隨后開始降低。同時(shí)可以看出，在高溫處理下兩水稻品系穎花中CAT活性存在顯著差異,高溫下突變體hst穎花中CAT活性顯著高于野生型中花11。

2.2.4 高溫脅迫對(duì)水稻穎花H2O2和MDA含量的影響

2.2.4.1 對(duì)水稻穎花H2O2含量的影響

H2O2是活性氧(ROS)，激素等信號(hào)以及生物、非生物脅迫刺激均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累[25]。活性氧積累以及由此引發(fā)的膜脂過氧化是高溫傷害的原因之一[26]。由圖9可知，與適溫條件相比，兩品系水稻穎花H2O2含量在高溫脅迫下均顯著上升。在高溫處理1 d和3 d后，突變體hst穎花中H2O2含量顯著高于野生型中花11；而隨著高溫處理時(shí)間延長(zhǎng)，高溫處理5 d和7 d后，突變體hst穎花中H2O2含量顯著低于野生型中花11。從穎花中H2O2含量變化上來看，突變體hst比野生型中花11變幅小(處理1 d后除外)，即花期高溫脅迫對(duì)兩水稻品系穎花H2O2含量變化的影響存在差異。

2.2.4.2 對(duì)水稻穎花MDA含量的影響

MDA作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，能夠抑制細(xì)胞保護(hù)酶活性和降低抗氧化物的含量，從而加劇膜脂過氧化[27]。由圖10分析可知，與適溫條件相比，高溫脅迫導(dǎo)致野生型中花11穎花中MDA含量顯著升高(處理1 d后除外)，而對(duì)突變體hst影響不明顯。突變體hst穎花中MDA積累量在整個(gè)高溫脅迫期間均顯著低于野生型中花11。

圖10 花期高溫脅迫對(duì)水稻穎花MDA含量的影響

Fig. 10. Effect of high temperature stress on MDA content in spikelets of rice at the flowering stage.

3 討論

溫度是影響水稻生長(zhǎng)的重要因子之一，溫度過低或過高均不利于水稻生長(zhǎng)[28，29]。高溫脅迫導(dǎo)致水稻花期的花器官傷害，而花器官是與水稻產(chǎn)量關(guān)系最密切的器官，它的正常發(fā)育是水稻獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵。水稻花期日平均溫度升高導(dǎo)致小穗不育率增加,尤其與日最高溫度的關(guān)系更為密切[30]。本研究結(jié)果表明，花期高溫脅迫明顯降低了兩水稻品系的每穗實(shí)粒數(shù)、單株產(chǎn)量和結(jié)實(shí)率，該結(jié)果與符冠富等[31]和Liao等[32]的研究結(jié)果相似。在高溫脅迫下，與野生型中花11相比，突變體hst具有更高的每穗實(shí)粒數(shù)、單株產(chǎn)量及結(jié)實(shí)率，這表明中花11與其突變體hst在耐熱性方面存在顯著差異，突變體hst具有更強(qiáng)的高溫耐性。高溫下突變體hst的受精率遠(yuǎn)高于野生型中花11，這與其結(jié)實(shí)率及產(chǎn)量高于野生型中花11的趨勢(shì)一致，說明高溫脅迫下水稻開花受精受到影響，導(dǎo)致其結(jié)實(shí)率及單株產(chǎn)量的下降。此外，花期高溫脅迫對(duì)突變體hst的千粒重影響較小，而提高了野生型中花11的千粒重，其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

葉綠素含量降低通常被認(rèn)為是光合作用對(duì)高溫脅迫響應(yīng)的主要表現(xiàn)[33]。高溫顯著降低熱敏感水稻品系的劍葉葉綠素含量，而耐熱性品系在高溫下能維持相對(duì)較高的光合速率[18]。因此，葉綠素含量變化可作為評(píng)判植物高溫耐性的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下，兩水稻品系劍葉中葉綠素含量均降低，野生型中花11劍葉中葉綠素降幅顯著大于突變體hst，表明高溫脅迫對(duì)突變體hst水稻劍葉光合作用的影響較野生型中花11小，高溫下突變體hst能維持相對(duì)較高的光合強(qiáng)度，從而保證了供籽粒充實(shí)的光合產(chǎn)物的高效合成。

可溶性蛋白容易受到逆境脅迫的影響，是一種比較重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量可以作為植物抗逆性的指標(biāo)[34]?？扇苄蕴强删S持細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性[35]，高溫下可溶性糖含量下降，可能是高溫下水稻葉片蒸騰速率加快，為防止干旱脅迫，降低其可溶性糖含量以降低植物水勢(shì)，從而維持細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性[36]。李萍萍等[37]研究高溫對(duì)水稻劍葉生理特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，高溫加速了劍葉中可溶性糖和可溶性蛋白的含量降低。本研究結(jié)果也顯示高溫脅迫導(dǎo)致兩水稻品系穎花中可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著下降，且突變體hst降幅小于野生型中花11。游離脯氨酸溶解度高，水合作用強(qiáng)，可提高原生質(zhì)滲透壓，防止和減少水分散失，對(duì)原生質(zhì)有保護(hù)作用[38]，但對(duì)于脯氨酸含量在逆境脅迫下的響應(yīng)變化仍存在不同觀點(diǎn)。有一些研究認(rèn)為逆境脅迫下植物體內(nèi)脯氨酸含量下降；另有些研究得出在逆境脅迫下，脯氨酸合成酶類對(duì)脯氨酸的反饋抑制的敏感性降低，導(dǎo)致脯氨酸含量升高。脯氨酸積累量可作為植物抗逆性的一個(gè)指標(biāo)[39]。本研究結(jié)果表明，穎花中游離脯氨酸含量在高溫處理初期顯著升高，高溫下突變體hst游離脯氨酸含量顯著高于野生型中花11。本研究認(rèn)為可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及游離脯氨酸含量高有助于維持穎花細(xì)胞較低的滲透水平、增強(qiáng)耐脫水能力、保護(hù)原生質(zhì)體，以抵御高溫脅迫的傷害。高溫下突變體hst穎花中具有更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因而具備了更強(qiáng)的生物膜保護(hù)能力，能保持膜結(jié)構(gòu)及功能的相對(duì)穩(wěn)定性，減少細(xì)胞內(nèi)容物外滲，從而減輕高溫對(duì)水稻穎花的傷害，增強(qiáng)了它耐受高溫逆境的能力。

MDA作為脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)，是脂質(zhì)過氧化的一種典型產(chǎn)物[24]。本研究中，高溫脅迫導(dǎo)致穎花膜脂過氧化程度加劇，MDA含量升高，這與張桂蓮等[10]的研究一致。與突變體hst相比，高溫下野生型中花11穎花中積累了更多的MDA，MDA大量與膜蛋白結(jié)合，造成膜結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失，質(zhì)膜透性加大，電解質(zhì)外滲，從而影響到花器官的生理生化機(jī)能。H2O2是植物代謝中產(chǎn)生的一種過氧化物，其積累對(duì)細(xì)胞具有氧化破壞作用，在逆境脅迫下可根據(jù)其值變化，來了解組織的破壞程度。本研究結(jié)果表明，高溫脅迫初期突變體hst穎花中H2O2含量較野生型中花11顯著升高，此時(shí)H2O2作為重要的抗性誘導(dǎo)因子，可觸發(fā)植物細(xì)胞啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生大量的過氧化保護(hù)酶來清除體內(nèi)過多的活性氧，減輕穎花受到的氧化脅迫，但隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，穎花抗氧化酶活性下降，穎花中H2O2積累量持續(xù)升高，穎花受到的氧化損傷程度不斷加重，野生型ZH11比突變體hst積累了更多的H2O2，因而其穎花受到了更嚴(yán)重的氧化損傷。

SOD、POD和CAT是酶促活性氧清除系統(tǒng)的主要組成成分，對(duì)防止膜脂過氧化，減輕逆境造成的膜傷害和延緩植物衰老有重要作用，不同的酶對(duì)水稻開花期高溫脅迫的反應(yīng)有所不同[9]。本研究結(jié)果顯示，高溫下兩水稻品系穎花中SOD活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，而POD和CAT活性呈先升高后下降的趨勢(shì)，其中POD活性至處理5 d后達(dá)最大值，CAT活性至處理3 d后達(dá)最大值。聯(lián)系到高溫脅迫下MDA及H2O2含量的升高和酶活性的降低，說明高溫脅迫會(huì)減弱水稻自身清除活性氧及防止膜脂過氧化的作用，造成生物膜結(jié)構(gòu)的破壞和功能的喪失，嚴(yán)重影響水稻穎花的生理代謝，這可能是高溫脅迫導(dǎo)致水稻熱害的生理原因。

以上研究結(jié)果表明，高溫脅迫下水稻劍葉中維持較穩(wěn)定的光合作用，穎花中保持較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及較低的MDA和H2O2含量，使得水稻花器官具備較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力和生物膜保護(hù)能力，從而保證了正常的授粉受精過程，維持了較高的結(jié)實(shí)率，這可能是突變體耐高溫的生理基礎(chǔ)。要明確突變基因在高溫脅迫調(diào)控通路中發(fā)揮的作用，還需要利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行深入研究。

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Effect of High Temperature Stress on Physiological Characteristics of Spikelet of Rice During Flowering Stage

LAN Xu, GU Zheng-dong, DING Yan-fei, WANG Ke, JIANG Qiong, ZHU Cheng*

(CollegeofLifeScience,ChinaJiliangUniversity/KeyLaboratoryofMarineFoodQualityandHazardControllingTechnologyofZhejiangProvince,Hangzhou310018,China；*Corresponding author, E-mail: pzhch@cjlu.edu.cn )

To ascertain the effect of high temperature stress on the physiological characteristics of rice spikelet at flowing stage, wild type Zhonghua 11(ZH11) and its heat-resistant mutant (hst) were exposed to heat stress (40℃,6 h per day) for 7 days in growth chambers. The results showed that under heat stress the chlorophyll content in flag leaf, soluble protein and soluble sugar contents in spikelet of rice decreased obviously with lower decline in the mutanthstcompared to the wild type ZH11. While malonyldialdehyde (MDA), hydrogen peroxide(H2O2) and free proline contents in spikelets increased significantly with greater increase in wild type ZH11 than in the mutanthst. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase(POD) activities showed different responses to high temperature stress, and the correlation between the enzyme activities and the thermal sensitivity would be further investigated. Under high temperature stress, higher photosynthesis efficiency, better osmotic adjustment ability as well as lower MDA and H2O2content of spikelets in the mutant could be the physiological basis of high temperature tolerance．

rice; flowering stage; high temperature stress; spikelet; physiological characteristics

2015-12-02； 修改稿收到日期: 2016-03-09。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401299，31470368，31170251，31101133)； 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LZ14C020001)。

Q785; S435.112+.3

A

1001-7216(2016)06-0637-10

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