酶法輔助提取山杏種皮黑色素工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性

李紅姣，李巨秀*，趙 忠*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，西部環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；

2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

酶法輔助提取山杏種皮黑色素工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性

李紅姣1,2，李巨秀3,*，趙 忠1,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，西部環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；

2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

以山杏種皮為原料，以黑色素得率為指標(biāo)，對(duì)堿性蛋白酶、纖維素酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶4 種酶輔助提取山杏種皮黑色素的效果進(jìn)行比較分析，篩選出酶解效果較好的胃蛋白酶。再通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化胃蛋白酶輔助提取山杏種皮黑色素的最佳工藝，最后對(duì)山杏種皮黑色素的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)的分析。結(jié)果表明，在酶解溫度32 ℃、酶解pH 2.0、加酶量90 000 U/g、酶解時(shí)間5 h的條件下進(jìn)行胃蛋白酶輔助提取的效果較好，黑色素得率達(dá)到7.4%。山杏種皮黑色素在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定，金屬離子Cu2+、Fe2+和Fe3+對(duì)其穩(wěn)定性有影響，而氧化劑、還原劑、蔗糖和檸檬酸對(duì)其穩(wěn)定性無(wú)影響。

酶；山杏種皮；黑色素；提取；穩(wěn)定性

李紅姣, 李巨秀, 趙忠. 酶法輔助提取山杏種皮黑色素工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 69-75. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610012. http://www.spkx.net.cn

LI Hongjiao, LI Juxiu, ZHAO Zhong. Optimization of enzyme-assisted extraction of melanin from testae of wild apricots and evaluation of its stability[J]. Food Science, 2016, 37(10): 69-75. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201610012. http://www.spkx.net.cn

植物來(lái)源的食品添加劑，特別是植物黑色素，安全性較高，應(yīng)用范圍廣，不僅可以作為食品色素，還具有生物半導(dǎo)體、抗氧化、清除自由基、防紫外線輻射、螯合重金屬離子等功能[1-7]。黑色素是生物界普遍存在的一

類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素[8]，來(lái)源廣泛，很多動(dòng)物、植物、微生物都含并且可以合成，具有很大的應(yīng)用潛力。已有研究人員對(duì)不同材料中黑色素的提取、性質(zhì)等方面做了大量研究，如黑米[9]、烏骨雞[10]、魷魚(yú)墨[11]、烏飯樹(shù)葉[12]、黑芝麻[13]等中的黑色素。

酶法提取主要采用酶破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，具有反應(yīng)條件溫和選擇性高的特點(diǎn)，而酶的專一性可避免對(duì)底物外物質(zhì)的破壞。在提取熱穩(wěn)定性差或含量較少的化學(xué)成分時(shí)，優(yōu)勢(shì)更為明顯[14-15]。酶法相對(duì)其他提取方法具有眾多優(yōu)點(diǎn)，可以提高有效成分產(chǎn)率，縮短提取時(shí)間，降低能耗，降低提取成本。由于酶法提取可以在常溫和非有機(jī)溶劑條件下進(jìn)行，所以得到的產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性及活性都較高，無(wú)污染。酶法提取無(wú)需投入昂貴新設(shè)備，成本較低，具有成本低廉、性價(jià)比高的優(yōu)勢(shì)。Noveilino等[16]用酶降解法從人的頭發(fā)和牛的虹膜中提取出真黑素。筆者已經(jīng)探索出了山杏種皮黑色素的常規(guī)提取方法-堿溶酸沉法[17]，但酶法輔助提取山杏種皮黑色素鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用酶法輔助堿溶酸沉淀法提取山杏種皮黑色素，利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶和胃蛋白酶的活性輔助提取黑色素，優(yōu)化確定酶輔助提取山杏種皮黑色素的最佳工藝條件。以山杏種皮為原料提取黑色素，可以提高杏仁深加工產(chǎn)品的附加值，研究山杏種皮黑色素作為天然食用色素的穩(wěn)定性，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用山杏種皮黑色素提供依據(jù)，并且對(duì)促進(jìn)山杏產(chǎn)區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、增加農(nóng)民的收入均有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山杏種皮：產(chǎn)自甘肅平?jīng)觯瑢⑿尤适止とテ?，種皮在自然條件下風(fēng)干后備用。

冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化亞鐵（均為分析純） 天津博迪化工有限公司；鹽酸、乙醇（均為分析純） 西安三浦化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、蔗糖（均為分析純） 四川西隴化工有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、胃蛋白酶（均為化學(xué)純） 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；氨水（分析純）成都市科龍化工試劑廠；氯化銅、氯化鐵（均為分析純） 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；雙氧水、硫代硫酸鈉（均為分析純） 西安化學(xué)試劑廠；檸檬酸（分析純） 天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站。

1.2 儀器與設(shè)備

EB-280-12型千分之一天平 日本島津公司；SC-3610型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-2型恒溫磁力攪拌器 國(guó)華電器有限公司；DZF型真空干燥箱北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 方舟科技（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山杏種皮黑色素的提取

稱取5.00 g山杏種皮，放入150 mL錐形瓶中，加入75 mL蒸餾水煮沸5 min后過(guò)濾，以除去水溶性雜質(zhì)和排除材料中的氧氣。向?yàn)V渣中加入酶，在最適溫度水浴保溫靜置2 h，分別對(duì)山杏種皮進(jìn)行酶解，然后酶失活后過(guò)濾，在濾渣中加入NaOH溶液進(jìn)行提取后，過(guò)濾離心，上清液用2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值到2，使黑色素沉淀，室溫靜置2 h，離心分離，沉淀反復(fù)堿溶酸沉進(jìn)行純化，最后真空干燥得到山杏種皮黑色素顆粒。山杏種皮黑色素的提取流程見(jiàn)圖1。

圖1 山杏種皮黑色素的提取工藝流程Fig. 1 The extraction process for MTWA

1.3.2 酶的篩選

表1 加酶條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions

在圖1提取所得的濾渣中加入75 mL去離子水，同時(shí)按照表1加入酶，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，在最適溫度水浴保溫靜置2 h，分別對(duì)山杏種皮進(jìn)行酶解，然后按照?qǐng)D1進(jìn)行提取純化。堿溶液的提取條件為0.5 mol/L的NaOH溶液60 ℃水浴提取2 h。以黑色素得率為指標(biāo)，選擇得率最高的酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 酶法輔助提取單因素試驗(yàn)

以黑色素得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)酶解pH值（1、2、3、4、5）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、酶解溫度（27、37、47、57、67 ℃）和加酶量（22 000、44 000、66 000、88 000、120 000 U/g）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的影響效果和適宜范圍。

1.3.4 酶法輔助提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解pH值、加酶量、酶解時(shí)間作為考察因素，以黑色素得率為考察指標(biāo)，通過(guò)四因素四水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels used for orthogonal experimental design

1.3.5 加酶方式對(duì)黑色素得率的影響

考察在酶解第1小時(shí)一次性加入酶22 000 U/g和分別在第1、2小時(shí)2 次各加入酶11 000 U/g對(duì)黑色素得率的影響。

1.3.6 黑色素得率計(jì)算

將有機(jī)溶劑洗滌過(guò)的黑色素塊狀物經(jīng)真空干燥后，稱質(zhì)量得到黑色素的質(zhì)量。黑色素得率計(jì)算公式為：

1.3.7 山杏種皮黑色素的穩(wěn)定性

1.3.7.1 山杏種皮黑色素溶液的配制

稱取5 mg山杏種皮黑色素，用500 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的氨水超聲波輔助溶解5～6 h，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓抽去多余氨氣，直至pH值達(dá)7.5，然后將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的山杏種皮黑色素溶液以3 500 r/min離心3 min，最后用pH7.5的磷酸緩沖溶液定容至100 mL，即配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L的山杏種皮黑色素溶液。

1.3.7.2 pH值對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

分別取50 mg/L山杏種皮黑色素溶液15 mL于6 支25 mL具塞刻度試管中，然后用1.0 mol/L NaOH溶液或1.5 mol/L HCl溶液調(diào)pH值分別至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫條件下放置30 min，觀察山杏種皮黑色素溶液顏色的變化，在210 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A210nm）。

1.3.7.3 金屬離子對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度為0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的NaCl、CuCl2、FeCl2和FeCl3溶液，各取該4 種金屬離子溶液0.5mL，分別與4.5 mL的50 mg/L山杏種皮黑色素溶液混合，使山杏種皮黑色素溶液中的金屬離子濃度為0.00、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L，搖勻，室溫條件下放置12 h后測(cè)定A210nm。

1.3.7.4 氧化劑、還原劑對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

分別配制質(zhì)量濃度為0、0.1、1.0、10、100、1 000 mg/L的H2O2和Na2S2O3溶液，各取這2 種溶液0.5 mL，分別與4.5 mL的50 mg/L山杏種皮黑色素溶液混合，使山杏種皮黑色素溶液中的H2O2和Na2S2O3溶液質(zhì)量濃度為0、0.01、0.1、1.0、10、100 mg/L，搖勻，室溫條件下放置12 h后測(cè)定A210nm。

1.3.7.5 蔗糖、檸檬酸對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

分別配制質(zhì)量濃度為0.1、1.0、10、100、1 000 mg/L的蔗糖和檸檬酸溶液，各取這兩種溶液0.5 mL，分別與4.5 mL的50 mg/L山杏種皮黑色素溶液混合，使山杏種皮黑色素溶液中的蔗糖和檸檬酸溶液質(zhì)量濃度為0、0.01、0.1、1.0、10、100 mg/L，搖勻，室溫條件下放置12 h后測(cè)定A210nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用單因素Duncan法進(jìn)行多重比較，以DPS v7.55軟件進(jìn)行顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

不同種類酶的酶活范圍、最適工作溫度和最適工作pH值均不同，因此對(duì)蛋白質(zhì)等的提取效果有很大影響。已有研究證明酶的種類對(duì)大米蛋白得率有較大影響[18]。本研究以黑色素得率為指標(biāo)，篩選出輔助提取山杏種皮黑色素最合適的酶，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 單酶提取效果比較Fig. 2 Comparison of extraction yield of melanin with single enzymes

由圖2可知，在4 種酶中，胃蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)山杏種皮黑色素提取具有較好的輔助效果（P＜0.05），黑色素得率分別達(dá)到6.8%和6.1%；中性蛋白酶水解效果最差，得率只有4.7%（P＜0.05）。由于胃蛋白酶酶解條件溫和（37 ℃），便于酶解操作，因而將其選為山杏種皮黑色素輔助提取所用酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解pH值對(duì)提取效果的影響

酶活力受pH值得影響很大，不僅能夠影響酶的構(gòu)象，還影響底物的解離狀態(tài)[19]。因此確定酶的最適工作pH值能更加有效提取山杏種皮黑色素。在酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間2 h、加酶量22 000 U/g條件下，分別調(diào)節(jié)酶解pH值為1、2、3、4、5，分析山杏種皮黑色素的得率，見(jiàn)圖3。

圖3 酶解pH值對(duì)黑色素得率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis pH on melanin yield

由圖3可知，溶液的pH值在1.0～2.0之間，黑色素的得率升高；pH值為2.0時(shí)，達(dá)到最大值；pH＞2.0，隨著pH值的升高，黑色素得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。說(shuō)明pH 2.0左右對(duì)黑色素提取有較好的效果（P＜0.05），在其他pH值范圍內(nèi)，可能由于酶變性或沒(méi)有達(dá)到最大活性，致使黑色素得率較低。

2.2.2 酶解溫度對(duì)提取效果的影響

在加酶量22 000 U/g、酶解pH 2.0、酶解時(shí)間2 h條件下，選擇27、37、47、57、67 ℃考察酶解溫度對(duì)山杏種皮黑色素提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)黑色素得率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on melanin yield

由圖4可知，酶解溫度在37 ℃左右時(shí)黑色素得率最高（P＜0.05），在其他溫度范圍內(nèi)可能由于酶失活或沒(méi)有達(dá)到最大活性，導(dǎo)致黑色素得率較低。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在酶解pH 2.0、酶解溫度37 ℃、加酶量22 000 U/g條件下，考察酶解時(shí)間2、3、4、5、6 h對(duì)山杏種皮黑色素提取效果的影響，見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis time on melanin yield

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，黑色素得率呈上升趨勢(shì)，酶解時(shí)間為5 h時(shí)，山杏種皮黑色素得率最高（P＜0.05），酶解6 h時(shí)得率有所下降（P＜0.05），考慮到黑色素得率和成本，以5 h作為進(jìn)一步試驗(yàn)的酶解時(shí)間。

2.2.4 加酶量對(duì)提取效果的影響

在酶解pH 2.0、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間2 h條件下，考察加酶量22 000、44 000、66 000、88 000、120 000 U/g對(duì)提取效果的影響，見(jiàn)圖6。

圖6 加酶量對(duì)黑色素得率的影響Fig. 6 Effect of enzyme concentration on melanin yield

由圖6可知，隨著加酶量的加大，黑色素得率呈上升趨勢(shì)，但在88 000 U/g以后趨勢(shì)變得緩慢。這可能是因?yàn)樵诩用噶枯^小時(shí)，酶與底物充分接觸并且結(jié)合，隨著加酶量的加大，底物濃度下降，反應(yīng)速度降低，導(dǎo)致酶的作用受到抑制[20]。考慮工業(yè)生產(chǎn)中的用酶成本，以88 000 U/g為最佳的加酶量（P＜0.05）。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件。以酶解溫度、酶解pH值、加酶量、酶解時(shí)間作為考察對(duì)象，優(yōu)化工藝條件，每個(gè)因素選用4個(gè)水平，選用L16（45）正交表，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

由表3、4可以看出，4 個(gè)因素對(duì)黑色素得率均有影響。影響大小順序?yàn)槊附鈖H值＞酶解溫度＞加酶量＞酶解時(shí)間。試驗(yàn)最佳組合為：A2B3C3D1。組合不在16組試驗(yàn)內(nèi)，因此進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即酶解pH 2、加酶量90 000 U/g、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度32 ℃條件下，測(cè)得山杏種皮黑色素得率為7.4%，高于其他任何一組黑色素得率。因此，在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，提取山杏種皮黑色素

最佳工藝為酶解pH 2、加酶量90 000 U/g、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度在32～37 ℃范圍。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design with experimental results

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array dessiiggnn

2.4 加酶方式對(duì)黑色素提取效果的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，加酶量過(guò)大，可能導(dǎo)致酶與底物接觸面積受到限制或者酶本身相互水解，使酶活力降低。在不增加加酶量的情況下，一次性加胃蛋白酶黑色素得率為6.8%，而采用分2 次加入胃蛋白酶，黑色素得率為7.0%，可見(jiàn)2 次加酶對(duì)山杏種皮進(jìn)行酶解效果更加理想。

2.5 pH值對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

黑色素除了溶于堿溶液，微溶于二甲基亞砜外，幾乎不溶于其他任何常規(guī)試劑和有機(jī)溶劑[21-22]。因此，溶液的pH值對(duì)黑色素的穩(wěn)定性有很大影響。經(jīng)1.0 mol/L NaOH溶液和1.5 mol/L HCl溶液調(diào)pH值，放置30 min后，測(cè)得的吸光度變化結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 pH值對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of pH on melanin stability

由圖7可以看出，山杏種皮黑色素對(duì)酸性條件比較敏感，pH1～4時(shí)有明顯沉淀，而pH＞5時(shí)溶液澄清。此外，肉眼觀察，pH 1～4時(shí)顏色較淡，呈現(xiàn)淡褐色，而pH＞5時(shí)顏色較深，呈現(xiàn)褐色。由此說(shuō)明，山杏種皮黑色素在酸性條件不穩(wěn)定，而在堿性條件下比較穩(wěn)定，且pH值變化黑色素溶液的色調(diào)不會(huì)發(fā)生變化。這與大多數(shù)報(bào)道的黑色素性質(zhì)相同，如張金萍等[23]報(bào)道的酶法合成黑色素的穩(wěn)定性研究，孫玲等[24]報(bào)道的黑芝麻黑色素提取條件和穩(wěn)定性的研究。因此，在食品加工中，添加山杏種皮黑色素時(shí)應(yīng)盡量在堿性環(huán)境中。

2.6 金屬離子對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

黑色素對(duì)金屬離子具有很高的結(jié)合能力，金屬離子的結(jié)合對(duì)黑色素的抗氧化活性、團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)等方面產(chǎn)生影響，從而影響黑色素的穩(wěn)定性[25]。4 種金屬離子對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響如圖8所示。

圖8 金屬離子對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響Fig. 8 Effect of metal ions on melanin stability

由圖8可以看出，F(xiàn)e2+和Fe3+對(duì)山杏種皮黑色素有一定增色作用，Cu2+對(duì)山杏種皮黑色素有一定減色作用，Na+對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性無(wú)影響。此外，F(xiàn)e2+和Fe3+濃度大于0.10 mmol/L時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)沉淀，Cu2+濃度大于0.15 mmol/L時(shí)也出現(xiàn)沉淀。由此說(shuō)明，Na+對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性無(wú)影響，而Cu2+、Fe2+和Fe3+對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性均有影響。在食品加工中，添加或保存山杏種皮黑色素時(shí)應(yīng)避免使用這些金屬容器。

2.7 氧化劑和還原劑對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響

黑色素是一類含有多種官能團(tuán)的聚合物，在較寬的pH值范圍內(nèi)既可以作為電子供體，又可以作為電子受體，因此具有氧化還原特性[25]。氧化劑、還原劑對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖9。

圖9 H 9 H2O2和NaNa2S2O3對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響Fig. 9 Effect of H2O2and Na2S2O3on melanin stability

由圖9可以看出，低質(zhì)量濃度（質(zhì)量濃度小于10 mg/L）的氧化劑H2O2和還原劑Na2S2O3對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性無(wú)太大影響，但氧化劑和還原劑質(zhì)量濃度大于10 mg/L時(shí)，吸光度顯著增大（P＜0.05），可能是由于山杏種皮黑色素在氧化劑、還原劑的作用下，解離或者結(jié)合了部分吲哚醌結(jié)構(gòu)。這與張金萍等[23]報(bào)道的氧化劑、還原劑對(duì)酶法合成黑色素穩(wěn)定性影響的結(jié)果基本一致。

2.8 蔗糖和檸檬酸對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定的影響

圖10 蔗糖和檸檬酸對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性的影響Fig. 10 Effect of sucrose and citric acid on melanin stability

由圖10可以看出，蔗糖和檸檬酸對(duì)山杏種皮黑色素的穩(wěn)定性無(wú)明顯影響。在食品工業(yè)中，添加山杏種皮黑色素可以同時(shí)添加蔗糖和檸檬酸。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶解pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量與加酶方式對(duì)山杏種皮黑色素得率均有影響，酶法輔助提取山杏種皮黑色素的適宜條件為酶解pH 2、加酶量90 000 U/g、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度在32～37 ℃范圍，此時(shí)山杏種皮黑色素得率為7.4%。采用分2 次加入胃蛋白酶對(duì)山杏種皮進(jìn)行酶解效果較好。山杏種皮黑色素在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定性好，Na+、蔗糖和檸檬酸、低質(zhì)量濃度的氧化劑和還原劑（質(zhì)量濃度小于10 mg/L）對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性影響不大，而高于10 mg/L的氧化劑還原劑、Cu2+、Fe2+和Fe3+對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性均有影響。

雖然酶法輔助提取黑色素最高得率能達(dá)到7.4%，無(wú)需投入昂貴設(shè)備，如微波機(jī)器[12]等，但是由于酶的成本較高，與NaOH提取法（最高得率達(dá)到7.2%）[17]無(wú)顯著差異，因此酶法輔助提取不是最理想的提取方式，探索一條更加經(jīng)濟(jì)、合理、高得率的黑色素提取方法也是后續(xù)研究的重點(diǎn)。天然黑色素是不溶于水和一般有機(jī)溶劑的多聚化合物，是在植物、動(dòng)物和微生物細(xì)胞中合成的最廣的一類色素，它的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是一些共價(jià)交聯(lián)的吲哚環(huán)。酪氨酸是合成黑色素的前體物，酪氨酸在酪氨酸氧化酶的催化作用下氧化生成二羥苯丙氨酸（多巴），繼續(xù)氧化生成多巴醌，再進(jìn)一步氧化閉環(huán)生成5,6-二羥吲哚，再轉(zhuǎn)化生成5,6-吲哚二醌，在酶的作用下，最后氧化聚合而形成黑色素[23,26]。在酶法輔助提取過(guò)程中，一部分黑色素可能被酶解，因此有望通過(guò)其他方法避免酶解從而提高山杏種皮黑色素的得率。

天然黑色素具有重要的生物活性、無(wú)毒無(wú)害，具有作為天然食用色素的巨大潛力，雖然Wang Hengshan等[27]研究表明桂花種皮黑色素對(duì)紫外線和可見(jiàn)光非常穩(wěn)定，紫外線或可見(jiàn)光照射15 d對(duì)桂花種皮黑色素?zé)o顯著影響，但是不同來(lái)源的黑色素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異很大，有關(guān)天然黑色素穩(wěn)定性的資料相當(dāng)有限。山杏種皮黑色素適用于許多領(lǐng)域，比如食品、化妝品、漆類或其他燃料，但其在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定性好，這就局限了黑色素的應(yīng)用范圍，在應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)該控制好pH值范圍。本研究表明在210 nm波長(zhǎng)處Na+、低質(zhì)量濃度的氧化劑和還原劑（質(zhì)量濃度小于10 mg/L）、蔗糖和檸檬酸對(duì)山杏種皮黑色素穩(wěn)定性影響不大，但Cu2+、Fe3+、Fe2+等離子具有增色或減色作用，可能是由于這些金屬離子與黑色素形成了不同的配合物，姚增玉[25]報(bào)道的山杏種皮黑色素在200 nm波長(zhǎng)處的穩(wěn)定性與210 nm波長(zhǎng)處基本一致。總的來(lái)說(shuō)，山杏種皮黑色素有望成為一種新型的天然色素，但是由于其在一些方面不甚穩(wěn)定，因此必須采取一定的穩(wěn)定化技術(shù)，如盡量避免加工、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中使用金屬容器，控制好pH值范圍等。另外，對(duì)黑色素進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椈蛘吒男?，增大其溶解度，?duì)進(jìn)一步探索山杏種皮黑色素的功能效用有很重要的作用，也是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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Optimization of Enzyme-Assisted Extraction of Melanin from Testae of Wild Apricots and Evaluation of Its Stability

LI Hongjiao1,2, LI Juxiu3,*, ZHAO Zhong1,*
(1. Key Laboratory of Environment and Ecology in Western China, Ministry of Education, College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. College of Forestry, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China; 3. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Melanin, a complex, high molecula r weight substance composed of phenolic or indolic compounds, is widespread in the biosphere. In this work, we isolated melanin from the testae of wild apricots (MTWA) using an enzyme-assisted procedure. Pepsase was selected to optimize the extraction conditions. The stability of MTWA was analyzed. The results showed that the optimal conditions for MTWA extraction was found to be extraction with 0.5 mol/L NaOH after enzymatic hydrolysis with 90 000 U/g pepsase at 32 ℃ and pH 2 for 5 h. Under these conditions, the maximum yield of MTWA of 7.4% was obtained. MTWA was stable in alkaline medium. Cu2+, Fe2+and Fe3+affected its stability while oxidants, reducing agents, sucrose and citric acid had no effect on MTWA.

enzyme; testae of wild apricots; melanin; extraction; stability

10.7506/spkx1002-6630-201610012

S789.9

A

2015-07-08

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（200904020）

李紅姣（1987—），女，博士，研究方向?yàn)樯质称贰⒘之a(chǎn)品加工。E-mail：lihongjiao0103@163.com

*通信作者：李巨秀（1972—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)和功能食品。E-mail：juxiuli@msn.com趙忠（1958—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯峙嘤碚撆c技術(shù)。E-mail：zhaozh@nwsuaf.edu.cn