李萍 李延海

1西安體育學院運動醫(yī)學教研室（西安 710068）2西安交通大學生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室，生命科學與技術學院，康復科學與技術研究中心（西安 710049）

大鼠紋狀體內部結構特征的研究

李萍1李延海2

1西安體育學院運動醫(yī)學教研室（西安 710068）2西安交通大學生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室，生命科學與技術學院，康復科學與技術研究中心（西安 710049）

目的：探討大鼠紋狀體的內部結構特征。方法：應用膽堿酯酶組織化學染色方法，研究紋狀體從嘴側到尾側不同冠狀切面的細胞組織形態(tài)特性。結果：在整個紋狀體內的任一冠狀切面上，均存在邊界較清楚、大小不同的斑塊狀淡染色區(qū)紋狀小體（patch）和其周圍面積較大的深染色區(qū)基質（matrix），二者相間分布；從嘴側到尾側，紋狀體呈現(xiàn)深染區(qū)域逐漸增多的變化趨勢，即靠近嘴側的紋狀體以patch為主，而靠近尾側的紋狀體則以matrix為主；從內側向外側，紋狀體也呈現(xiàn)出matrix逐漸增多的變化趨勢；膽堿酯酶染色陽性神經元主要分布在matrix區(qū)域。結論：紋狀體內部具有patch鑲嵌在matrix中的細胞構筑特征，并存在著matrix所占比例從嘴側到尾側及從內側向外側逐漸增大的分布趨勢，這種內部細胞構筑的復雜性與不均一性可能是紋狀體對運動具有學習與記憶能力等多種生理功能的結構基礎，為進一步探討紋狀體內的不同區(qū)域在運動中的作用奠定了基礎。

紋狀體；紋狀小體；基質

紋狀體是大腦皮層下的高級運動中樞，與機體隨意運動的穩(wěn)定、肌張力的調節(jié)和軀體運動的協(xié)調密切相關，對控制和執(zhí)行各種運動行為具有關鍵作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，它不僅在觸發(fā)和計劃多種行為方式中

具有重要作用，而且還是習慣形成以及復合運動方式信息儲存的中心[1-3]。乙酰膽堿是紋狀體內的重要神經遞質，主要由膽堿能中間神經元軸突末梢釋放產生。而膽堿能中間神經元，作為紋狀體中間神經元的一種，不僅對紋狀體主神經元具有調節(jié)作用，而且是紋狀體神經網絡的重要組成部分，通過調節(jié)主神經元的正常突觸傳遞和突觸可塑性，進而調節(jié)了自主運動及情景依賴性行為等[4]。以往的神經解剖學研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體內部呈淡染色區(qū)紋狀小體（patch）和其周圍面積較大的深染色區(qū)基質（matrix）兩種邊界清楚的區(qū)域間隔性分布，二者在形態(tài)結構上具有不同的組織學結構特點；在功能上具有調節(jié)軀體運動以及習慣行為兩種完全不同的功能特征[5-7]。因此，區(qū)分這兩種組織學結構將為揭示紋狀體完成不同功能的細胞與分子機制提供重要資料。本實驗應用膽堿酯酶組織化學染色方法，顯示紋狀體從嘴側到尾側不同冠狀切面的形態(tài)，尋找patch和matrix在不同冠狀切面的分布特點及其在整個紋狀體內的分布規(guī)律，為進一步研究紋狀體內部不同區(qū)域在運動調控中的生理功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用體重為140~180 g的健康Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，由西安交通大學實驗動物中心提供。大鼠在12/12 h明/暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由取食及飲水。

1.2 組織制備

1.2.1 灌流、取材和固定

成年SD大鼠給予2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射。動物麻醉后取仰臥位，打開胸腔，從左心室插入鈍針頭至升主動脈，剪開右心耳，同時打開輸液器開關，快速灌注溫生理鹽水100 ml，然后用4°C的4%多聚甲醛（pH 7.4）500 mL灌注固定，先將250 ml固定液快速灌入，剩余的250 ml緩慢滴入，共持續(xù)2~3 h。灌注完畢，立即斷頭取全腦，置相同固定液后固定4~6 h后，浸入20%、30%的蔗糖的磷酸鹽緩沖鹽液（PBS）（4°C）中，直至沉底。

1.2.2 切片

腦塊在30%蔗糖中沉底后，立即取出，用刀片將其分為左右兩半球，分別將其用OCT包埋固定后，用冰凍切片機進行冠狀連續(xù)切片，切片厚40 μm，并將含有紋狀體的大腦切片按前后次序收集于預先注入0.01 M的磷酸鹽緩沖鹽液（PBS）（pH 7.4）六孔板中，用于膽堿酯酶染色。

1.3 膽堿酯酶組織化學染色

對腦片進行膽堿酯酶染色前30 min，配制孵育液。具體步驟如下：先稱取12.5 mg底物乙酰硫代膽堿碘化物，放入玻璃皿內，然后依次加入以下各溶液：0.82%醋酸鈉15.8 ml、0.6%醋酸0.5 ml、2.94%檸檬酸鈉1.2 ml、0.75%硫酸銅2.5 ml、0.137%四異丙焦磷酰銨0.5 ml、0. 165%鐵氰化鉀2.5 ml，以1 M HCl或NaOH將pH調為5.6，孵育液呈亮綠色。將切片放入24孔培養(yǎng)板內，每孔一張切片，1 ml孵育液。37°C水浴箱孵育2~3 h，0.01 M PBS洗3次，每次5 min，然后裱片，陰干，脫水，透明，封片，光鏡下檢測結果。

1.4 顯微鏡觀察

光鏡下觀察紋狀體不同冠狀切面的形態(tài)以及膽堿酯酶染色結果。光鏡低倍鏡（×40）下對紋狀體進行顯微數(shù)碼攝片；高倍鏡（×100）觀察patch和matrix間區(qū)的分布以及陽性神經元的形態(tài)及分布特點。用Photoshop軟件測量patch和matrix間區(qū)的面積，并計算其百分比。

2 結果

2.1 紋狀體不同冠狀切面膽堿酯酶染色結果

實驗將SD大鼠腦在連續(xù)冠狀切片后，選取從嘴側到尾側含有紋狀體的腦片進行膽堿酯酶染色。結果如圖1所示，A、B、C、D、E、F六張圖片分別代表取自位于前囟2.2、1.6、1.0、0.2、－0.2、－1.0 mm的腦片染色結果。這些圖片中均包含了皮層、胼胝體和紋狀體等腦區(qū)。A圖中，紋狀體染色雖然與皮層和胼胝體相比呈陽性，但是與其它5張圖片相比，染色淡而且較均勻。而F圖中，紋狀體膽堿酯酶染色呈強陽性，染色深且較均一?？傮w趨勢是，在接近嘴側的切片中紋狀體以淺染區(qū)域為主，而接近尾側的切片中紋狀體以深染區(qū)域為主；從嘴側到尾側，紋狀體呈現(xiàn)深染區(qū)域逐漸增多的變化趨勢；而從內側到外側，紋狀體的染色強度也呈現(xiàn)逐漸增強的變化趨勢。以往的實驗顯示，膽堿酯酶（AChE）主要分布于matrix間區(qū)[8]。因此這一染色結果表明，在靠近嘴側的紋狀體，patch間區(qū)所占比例較大，尤其是在前囟2.2 mm~1.6 mm的冠狀切片上，patch的面積占切片總面積的近50%；在靠近尾側的紋狀體，特別是在前囟0.2 mm~－1.0 mm的冠狀切片上，主要是matrix間區(qū)為主，所占比例大于80%，patch間區(qū)所占比例很小。

2.2 patch和matrix間區(qū)的形態(tài)觀察

取位置為前囟－0.1 mm的冠狀腦片，觀察patch和matrix間區(qū)的分布特點以及陽性神經元的形態(tài)特征。染色結果顯示，在膽堿酯酶標記的整個紋狀體內，存在邊界較清楚、大小不等的斑塊狀淡染色區(qū)以及淡染區(qū)周圍的色區(qū)，分別為patch（淡染）間區(qū)和matrix（深染）間區(qū)。如圖2B所示，膽堿酯酶染色淡的patch間區(qū)呈不規(guī)則狀鑲嵌于染色深的matrix內。而陽性神經元在紋狀體內散在分布，且數(shù)量較少，主要分布在膽堿酯酶深染的區(qū)域，即matrix區(qū)域。神經元胞體較大，呈橢圓形

或梭形，細胞核不著色（圖2C）。

圖1 從嘴側到尾側冠狀切片中紋狀體膽堿酯酶染色結果

圖2 光鏡下觀察紋狀體patch和matrix間區(qū)分布及陽性神經元

3 討論

膽堿酯酶陽性染色的神經元主要是膽堿能中間神經元。在新紋狀體，膽堿能中間神經元是紋狀體內最大的無棘突神經元，其胞體直徑超過40 μm，數(shù)量少于神經元總數(shù)的5%[9]。該神經元的興奮性傳入來自于皮層和丘腦，同時也接受紋狀體中等有棘神經元（MSNs）的GABA能抑制性傳入以及來自黑質的多巴胺能傳入[10，11]。膽堿能中間神經元主要分布于matrix，其作用靶點主要是MSNs，對MSNs的放電模式及突觸傳遞過程都具有重要的調制作用[4]。盡管這類中間神經元數(shù)量很少，但與其它類型神經元相比，它具有大且十分密集的軸突樹，因而具有較為廣泛的靶區(qū)，對MSNs的信息傳出具有較強的調制作用。由于該神經元的軸突分布特征，致使紋狀體成為在整個大腦內含乙酰膽堿和膽堿能受體濃度很高的腦區(qū)[12，13]。膽堿能中間神經元通過其分布廣泛的軸突釋放乙酰膽堿，作用于靶細胞的膽堿能受體而發(fā)揮其生物學效應。研究顯示，紋狀體內的膽堿能受體包括煙堿型（N）受體及毒蕈堿型（M）受體。煙堿型受體主要位于紋狀體內的多巴胺能神經末梢[14]（突觸前）；M1-like乙酰膽堿受體主要表達在有棘神經元上（突觸后），而M2-like受體（和可能的M3-like受體）位于皮層—紋狀體谷氨酸能末梢及GABA能中間神經元的紋狀體—膽堿能纖維末梢上（突觸前）[15，16]。因此，乙酰膽堿在紋狀體內對突觸前神經遞質的釋放以及突觸后的信息傳遞均發(fā)揮了重要的調制作用[17]。紋狀體功能的正常還有賴于多種神經遞質與受體功能的協(xié)調與平衡，如乙酰膽堿與多巴胺的平衡是維持正常軀體運動所必須的。

以神經化學解剖學為依據，紋狀體可以分為patch和matrix兩類邊界較清楚的間區(qū)，紋狀體的神經元依此又被分為紋狀體－patch和紋狀體－matrix神經元。patch和matrix的神經元具有很多相似的特點，包括電學特性及軸突、樹突分布形[6]等。形態(tài)學研究證實紋狀體的patch和matrix間區(qū)神經元通過不同的神經通路執(zhí)行不同的機能。前者接受中間額葉皮層、邊緣皮層、黑質致密部和腹側黑質網狀部的傳入神經纖維；而后者的傳入纖維主要來自感覺運動皮層、聯(lián)合皮層、大腦皮層輔助運動區(qū)、背側黑質致密部、邊緣皮層、腹側被蓋區(qū)和丘腦髓板內核群[6]。patch和matrix還有許多方面的不同，包括含有的神經遞質與受體、神經元的發(fā)育過程與組織結構以及參與的功能等。例如，patch的組織化學特征表現(xiàn)為鈣結合蛋白染色缺失，μ-阿片受體分布密集以及小清蛋白的染色缺失等，另外，patch還富含p物質和腦啡肽。而matrix的組織化學特征主要是相對富含AChE、鈣結合蛋白、乙酰膽堿轉運體

（ChAT）以及酪氨酸羥化酶[18]。由于patch和matrix間區(qū)在很多方面存在著差異，它們對紋狀體生理功能可能發(fā)揮了不同的作用，因此對這兩個間區(qū)的研究必然成為探索紋狀體功能的關注點。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論從嘴側到尾側或是從內側到外側，紋狀體均呈現(xiàn)膽堿酯酶染色強度逐漸增強的變化趨勢，即matrix所占面積逐漸增大；在前囟2.2 mm~1.6 mm區(qū)域內，patch間區(qū)占接近50%的紋狀體面積；從前囟0.2 mm到紋狀體尾側主要是matrix間區(qū)為主，所占比例大于80%。該結果表明patch在matrix中的鑲嵌并不是均一的，而是存在部位差異，此結果補充并深化了對紋狀體內部細胞構筑特點的認識。研究結果也提示，紋狀體內部的功能差異可能是由其內部結構的不均一性決定的，即靠嘴側的紋狀體可能較多地參與了習慣行為的調制和記憶，而靠尾側的紋狀體則主要參與對機體隨意運動的調制。

4 總結

本實驗使用膽堿酯酶組織化學染色方法，觀察紋狀體從嘴側到尾側不同部位冠狀切片的形態(tài)結構以及膽堿酯酶的染色特點。結果顯示，紋狀體內部結構呈現(xiàn)patch和matrix間區(qū)的鑲嵌分布特點，以及從嘴側到尾側、從內側到外側matrix所占面積比例逐漸增大的不均一性分布，研究結果為進一步研究patch和matrix功能提供了形態(tài)學基礎。這種patch及matrix不均一分布特點的發(fā)現(xiàn)為進一步探討紋狀體在運動控制及調節(jié)中的作用提供了重要參考資料，為深入探討紋狀體內部不同區(qū)域在運動技巧學習以及認知中的作用提供了新思路。

[1]Kreitzer AC，Malenka RC.Striatal plasticity and basal ganglia circuit function.Neuron，2008，60（4）：543-554.

[2]Balleine BW，Delgado MR，Hikosaka O.The role of the dorsal striatum in reward and decision-making.J Neurosci，2007，27（31）：8161-8165.

[3]Liljeholm M，O'Doherty JP.Contributions of the striatum to learning，motivation，and performance：an associative account. Trends Cogn Sci，2012，16（9）：467-475.

[4]Perez-Rosello T，F(xiàn)igueroa A，Salgado H，et al.Cholinergic controloffiringpatternandneurotransmissioninrat neostriatal projection neurons：role of CaV2.1 and CaV2.2 Ca2+channels.J Neurophysiol，2005，93（5）：2507-2519.

[5]MiuraM，MasudaM，AosakiT.Rolesofmicro-opioid receptorsinGABAergicsynaptictransmissioninthe striosome and matrix compartments of the striatum.Mol Neurobiol，2008，37（2-3）：104-115.

[6]Tajima K，F(xiàn)ukuda T.Region-specific diversity of striosomes inthemousestriatumrevealedbythedifferential immunoreactivities for mu-opioid receptor，substance P，and enkephalin.Neuroscience，2013，241（0）：215-228.

[7]Unzai T，F(xiàn)ujiyama F，Kuramoto E，et al.Quantitative analysis of single cell projectionfrommidlineandintralaminar thalamic nuclei to patch and matrix compartments of rat striatum.NeuroscienceResearch，2009，65，Supplement1（0）：S177.

[8]HymanSE，MalenkaRC.Addictionandthebrain：the neurobiology of compulsion and its persistence.Nat Rev Neurosci，2001，2（10）：695-703.

[9]Rymar VV，Sasseville R，Luk KC，et al.Neurogenesis and stereologicalmorphometryofcalretinin-immunoreactive GABAergic interneurons of the neostriatum.J Comp Neurol，2004，469（3）：325-339.

[10]Lapper SR，Bolam JP.Input from the frontal cortex and the parafascicular nucleus to cholinergic interneurons in the dorsal striatum of the rat.Neuroscience，1992，51（3）：533-545.

[11]Reynolds JN，Wickens JR.The corticostriatal input to giant aspiny interneurons in the rat：a candidate pathway for synchronising the response to reward-related cues.Brain Res，2004，1011（1）：115-128.

[12]Volpicelli LA，Levey AI.Muscarinic acetylcholine receptor subtypes in cerebral cortex and hippocampus.Prog Brain Res，2004，145：59-66.

[13]Vilaro MT，Wiederhold KH，Palacios JM，et al.Muscarinic cholinergicreceptors in the ratcaudate-putamenand olfactory tubercle belong predominantly to the m4 class：in situ hybridization and receptor autoradiography evidence. Neuroscience，1991，40（1）：159-167.

[14]Clarke PB，Pert A.Autoradiographic evidence for nicotine receptors on nigrostriatal and mesolimbic dopaminergic neurons.Brain Res，1985，348（2）：355-358.

[15]Calabresi P，Centonze D，Bernardi G.Electrophysiology of dopamine in normal and denervated striatal neurons.Trends Neurosci，2000，23（10 Suppl）：S57-63.

[16]Zhang W，Basile AS，Gomeza J，et al.Characterization of central inhibitory muscarinic autoreceptors by the use of muscarinic acetylcholine receptor knock-outmice.J Neurosci，2002，22（5）：1709-1717.

[17]CalabresiP，CentonzeD，GubelliniP，etal.Synaptic transmission in the striatum：fromplasticityto neurodegeneration.Prog Neurobiol，2000，61（3）：231-265.

[18]Roberts RC，Roche JK，Conley RR.Synaptic differences in the patchmatrix compartments of subjects with schizophrenia：Apostmortemul trastructural study of the striatum.Neurobiol Dis，2005，20（2）：324-335.

Research on Internal Structure Characteristics of Rats’Striatum

Li Ping1，Li Yanhai2
1 Department of Sports Medicine，Xi’an Physical Education University，Xi’an 710068，China 2 The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，and Research Center of Rehabilitation Science and Technology，School of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，China Corresponding Author：Li Yanhai，Email：liyanhai@mail.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the internal structure characteristics of rats’striatum.MethodsThe morphological characteristics of the rostral-caudal striatum of rats were studied using the histochemical staining method of acetylcholinesterase（AChE）.ResultsIn the striatal coronal slices stained using AChE，there were many weakly labelled speckles（named patch）with different shape and size，and clear boundary surrounded by strongly labelled subregions（named matrix）.Moreover，the number of the matrix increased gradually from the rostral to the caudal striatum，and from the medial to lateral striatum.The AChE-positive neurons in oval or spindle shapemainly concentrated in the matrix.Conclusion Patches embedded in the matrix are very numerous in rostral striatum.In contrast，caudal striatum exhibits many matrixes.The cholinergic interneuron mainly distributes in matrix.These complicated and uneven characteristics of cytoarchitecture may be the structural basis for the striatum to have many physiologic functions including learning and memorizing ability.This study provides meaningful foundation for further exploring the role of patch and matrix in the movements.

striatum，patch，matrix

2016.03.31

國家自然科學基金項目（No.31000480）和西安體育學院重點學科建設經費共同資助

李延海，Email：liyanhai@mail.xjtu.edu.cn