趙君 董穎 張麗娟 閆寬 馬艷華

1北京化工大學(xué)理學(xué)院（北京 100029）2國家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

人尿中6種利尿劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法研究

趙君1董穎2張麗娟1閆寬2馬艷華2

1北京化工大學(xué)理學(xué)院（北京 100029）2國家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

目的：使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，為氯拉扎尼（chlorazanil，I）、氯索?。╟icletanine，II）、西氯他寧（chlorxolone，III）、芐氫氯噻嗪（benzylhydrochlorothiazide，IV）、芬喹唑（fenquizone，V）和美替克侖（meticrane，VI）等6種利尿劑建立在人尿中的檢測方法并進(jìn)行方法驗證。方法：將尿樣用同等體積的5%乙酸鉛水溶液沉淀蛋白質(zhì)并離心后，使用電噴霧電離源的正、負(fù)離子切換模式，以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果：上述利尿劑I-VI的最低檢測限（LOD）分別為1、0.1、0.01、1、2和10 ng/mL；線性范圍（R2＞0.99）分別為3～300 ng/mL、0.3～500 ng/mL、0.03～4000 ng/mL、3～1500 ng/mL、6～600 ng/mL和30～1600 ng/mL；6種藥物在低、中和高三個濃度水平的日內(nèi)變異系數(shù)均小于8%，日間變異系數(shù)均小于12%，檢測的準(zhǔn)確度在80%至120%之間；基質(zhì)效應(yīng)均在83%～115%范圍內(nèi)。結(jié)論：新建方法具有前處理簡單、分析速度快、靈敏度高和重現(xiàn)性好等特點，已應(yīng)用于我們實驗室的興奮劑常規(guī)檢測中。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；利尿劑；方法驗證；興奮劑控制

利尿劑在臨床上是一類用于治療水腫和高血壓的藥物，其作用是增加尿的排泄量，促使積聚在皮下和腹腔中多余的水分在短時間內(nèi)大量排出，因此，在競技體育中利尿劑經(jīng)常被運動員濫用。一方面，利尿劑的促排尿作用可以迅速減輕運動員體重，使之可以參加低體重級別的比賽；另一方面，利尿劑可以加速排泄或稀釋其它禁用物質(zhì)在尿中的濃度，具有掩蔽劑的作用。利尿劑在1988年漢城奧運會上才正式被列為禁用物質(zhì)并納入檢測項目。長期或過量使用利尿劑會導(dǎo)致血量下降，引發(fā)低血壓、休克、腎衰、猝死等，其副作用不容忽視。

張韶虹等[1]對利尿劑的檢測方法進(jìn)行了綜述。利尿劑通常使用色譜分析法、化學(xué)發(fā)光法、熒光分析法、電化學(xué)法、分光光度法、膠束色譜分析[2]、液相色譜[3-5]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測[6]。由于利尿劑種類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)差別較大，使用上述的檢測方法具有很大的局限性。隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，已有大量文獻(xiàn)報道用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)檢測利尿劑[7-14]。秦旸等[15]建立的液相色譜-單四級質(zhì)譜聯(lián)用法可同時篩選人尿中26種利尿劑。馬艷華等[16]用LC-MS/MS技術(shù)可同時檢測120種利尿劑和刺激劑等禁用物質(zhì)。閆寬等[17]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對人尿中3種普坦類興奮劑進(jìn)行了檢測。

Guddat等[18]報道將尿樣稀釋后直接進(jìn)樣的方法可快速篩查多種興奮劑，其中包含氯拉扎尼和美替克侖，檢測限分別為5和20 ng/mL，靈敏度明顯低于本研究的檢測方法。通過查閱文獻(xiàn)得知，到目前為止，本研究包含的其它四個利尿劑還沒有建立LC-MS/MS檢測方法（圖1）。

圖1 6種利尿劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

1290/6460C Triple Quad LC-MS/MS：美國安捷倫公司；氮吹儀：英國Bibby Scientific公司；低速離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；感量0.0001 g的電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；超純水機：美國Millipore公司；GENIE VORTEX-2渦旋混合器：美國Scientific Industries公司。

1.2 主要材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：氯拉扎尼（Chlorazanil）：哥倫比亞Matrix Scientific公司；鹽酸西氯他寧（Cicletanine Hydrochloride）、氯索?。–hlorexolone）、芐氫氯噻嗪（Benzylhydrochlorothiazide）和芬喹唑（Fenquizone）：加拿大Toronto Research Chemicals公司；美替克侖（Meticrane）和內(nèi)標(biāo)倍可降（Mefruside）：美國Sigma-Aldrich公司；色譜純乙腈和甲醇：美國DIKMA公司；色譜純甲酸銨：Fluka公司；分析純乙酸鉛：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儲備溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控樣品溶液的制備

儲備溶液：準(zhǔn)確稱量一定量（1 mg左右）的標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇溶液溶解制備成濃度為1 mg/mL的溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：將儲備液用甲醇倍比稀釋至100 μg/ mL、10 μg/mL；1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用液相色譜的初始流動相（V水∶V乙腈=85∶15）稀釋制備。

質(zhì)控樣品溶液：在空白尿中用標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋制備低、中和高3個濃度的質(zhì)控樣品溶液。

1.4 液相色譜條件

Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫40℃，流動相采用pH 3.5的10 mM甲酸銨緩沖液（A）和乙腈（B）；梯度洗脫程序：1～5 min：90%A；5～10 min：50%A；10～15 min：10%A；15～16 min：10%A；柱平衡時間：4 min；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10

μL。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正、負(fù)離子切換檢測模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描，電噴霧毛細(xì)管電壓4000 V，離子源溫度330℃，干燥器流速10 L/min，霧化氣壓力35 psi。

1.6 樣品前處理

用移液槍量取1 ml尿液，加入1 ml濃度為5%的乙酸鉛水溶液（其中含有內(nèi)標(biāo)倍可降，濃度為200 ng/ ml），渦旋震蕩30秒，離心10分鐘（4000 rpm），倒出上清液，取10 μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的前處理

興奮劑控制樣品的前處理通常采取液液萃取或固相萃取的方式純化和富集尿中的待測組分，但這些方法耗時較長，成本較高，如果回收率低，還會影響有效成分的檢出。為簡化樣品的前處理程序，實現(xiàn)高通量、快速的檢測目標(biāo)，本研究采取直接進(jìn)樣的方式簡化樣品的前處理程序，將尿樣中的蛋白質(zhì)用等體積的5%乙酸鉛水溶液沉淀后直接上機進(jìn)行檢測[19]。

2.2 質(zhì)譜分析

因有些利尿劑的酸性較強，不易質(zhì)子化，因此本方法使用電噴霧離子源并采取正、負(fù)離子切換模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。首先通過全掃描方式優(yōu)化加速電壓，得到每個利尿劑的子離子，再通過優(yōu)化碰撞能量得到豐度較高的診斷離子，表1中包含了質(zhì)譜參數(shù)和每個利尿劑的3對診斷離子。

表1 6種利尿劑的質(zhì)譜參數(shù)和診斷離子對

2.3 方法驗證

根據(jù)WADA實驗室國際標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)技術(shù)文件的要求，我們對所建立的方法進(jìn)行了全面考察和驗證，包括每種利尿劑的檢測限、定量限、線性范圍、日間和日內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和方法特異性等。

2.3.1 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

檢測限和定量限分別顯示信噪比為3和10時所對應(yīng)的藥物濃度。在6份不同的空白尿中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述1.6描述的方法進(jìn)行前處理，并上機檢測，得到6種藥物的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）（表2）。與WADA技術(shù)文件[20]中規(guī)定的利尿劑檢測能力最低要求（200 ng/mL）相比，本方法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出對興奮劑樣品的檢測要求。

表2 6種利尿劑色譜保留時間、檢測限、定量限和線性范圍

2.3.2 線性范圍

取10份空白尿，自LOQ開始向上配制系列濃度

的樣品，根據(jù)上述1.6的描述進(jìn)行前處理并上機檢測，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，測量直至曲線出現(xiàn)彎曲時的濃度，此時相關(guān)系數(shù)r2應(yīng)大于0.99（表2）。

2.3.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度

本驗證實驗是在低、中和高3個濃度下進(jìn)行的。在6份空白尿中，分別添加上述3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)1.6的描述進(jìn)行前處理并上機檢測，得出日內(nèi)精密度。按照日內(nèi)精密度的操作方法，每天操作一次，共做至少3次，計算得出日間精密度（表3）。

表36 種利尿劑的方法學(xué)驗證結(jié)果

在6份空白尿中，分別添加低、中和高3個濃度級別的標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)1.6的描述進(jìn)行前處理并上機檢測，通過工作曲線計算測量值，與真實值進(jìn)行比較再乘以百分比，即為準(zhǔn)確度（表3）。

實驗結(jié)果顯示6種利尿劑在3個濃度水平下日內(nèi)變異系數(shù)均小于8.0%，日間變異系數(shù)均小于12.1%，檢測的準(zhǔn)確度在80%～120%之間，符合興奮劑檢測實驗室常規(guī)檢測的要求。

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

在6份不同的空白尿中分別添加低、中和高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。將1 mL空白尿按照上述1.6的描述進(jìn)行前處理后，在上清液中加入一定濃度的待測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)，上機檢測得到峰面積B。同時，將1 mL純水經(jīng)過前處理后，在上清液中加入相同濃度的待測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)，上機檢測得到峰面積A?；|(zhì)效應(yīng)可用下述公式計算：

基質(zhì)效應(yīng)=待測物峰面積B/內(nèi)標(biāo)峰面積B÷待測物峰面積A/內(nèi)標(biāo)峰面積A×100%

實驗結(jié)果表明6種利尿劑在低、中和高3個濃度下的基質(zhì)效應(yīng)均在84%～115%之間（表3），說明該檢測方法的基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。

2.3.5 方法特異性

特異性是指在樣品介質(zhì)中有其它組分共存時，檢測方法對待測物準(zhǔn)確而專屬的測定能力。當(dāng)樣品中含

有被分析物時呈陽性反應(yīng)，不含被分析物時呈陰性反應(yīng)。必要時，要證明與被分析物結(jié)構(gòu)相似或相近的物質(zhì)不呈陽性反應(yīng)。本研究選擇50份空白尿樣，經(jīng)前處理并上機檢測后，發(fā)現(xiàn)尿樣中基質(zhì)對待測離子窗口無影響。

3 總結(jié)

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測6種利尿劑的方法。該方法具有前處理簡單、靈敏度高、線性范圍寬、精密度好、特異性強和基質(zhì)干擾小等特點，能夠滿足興奮劑常規(guī)樣品的檢測要求。該方法已經(jīng)應(yīng)用于我們實驗室的日常檢測中。

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[20]World Anti-Doping Agency：WADA Technical Document. http：//www.wada-ama.org.

Development and Validation of a LC-MS/MS Method for the Detection of Six Diuretics in Human Urine

Zhao Jun1，Dong Ying2，Zhang Lijuan1，Yan Kuan2，Ma Yanhua2
1 Faculty of Sciences，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China 2 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China Corresponding Author：Dong Ying，Email：dongying@chinada.cn Zhang Lijuan，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn

ObjectiveTo develop and validate a LC-MS/MS method for the detection of 6 diuretics including chlorazanil（I），cicletanine（II），chlorxolone（III），benzylhydrochlorothiazide（IV），fenquizone（V）and meticrane（VI）.Method An equivalent volume of 5%PbAc2aqueous solution was applied to precipitate the proteins in urine samples.The supernatant was directly introduced into the LC-MS/MS system using electrospray ionization in negative-to-positive switch mode.Results The limit of detections（LODs）for the above described diuretics I-VI were 1，0.1，0.01，1，2 and 10 ng/mL respectively.The assays were linear over the concentration ranges of 3-300 ng/mL（I），0.03-4000 ng/mL（II），0.03-500 ng/mL（III），3-1500 ng/mL（V），6-600 ng/mL（V）and 30-1600 ng/mL（VI）in human urine respectively.The intra-and inter-day variation coefficients of the method at three concentration levels（low，medium and high）were less than 12%. The method also afforded satisfactory results in terms of specificity，accuracy（80-120%）and matrix effect（83-115%）.ConclusionsThe established method is precise，sensitive and accurate with minimum sample preparation.It is a fit-for-purpose approach and has been applied in our laboratory for doping-control sample analysis.

LC-MS/MS，diuretics，method validation，doping-control

2016.04.17

董穎，Email：dongying@chinada.cn；張麗娟，Email：dazlj@mail.buct.edu.cn