劉 楊，趙向絨，郭春艷，胡 軍，余鵬博

(1. 陜西省人民醫(yī)院中心實驗室，陜西西安 710068；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第三附屬醫(yī)院，陜西西安 710068；3. 陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒所，陜西西安 710054)

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◇技術(shù)方法研究◇

甲型流感病毒純化及病毒生物學(xué)特征分析

劉 楊1,2，趙向絨1,2，郭春艷1,2，胡 軍1,2，余鵬博3

(1. 陜西省人民醫(yī)院中心實驗室，陜西西安 710068；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第三附屬醫(yī)院，陜西西安 710068；3. 陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒所，陜西西安 710054)

目的 評價蔗糖密度梯度離心純化甲型流感病毒的方法，并對純化的病毒顆粒特征和免疫原性進(jìn)行分析。方法 接種雞胚培養(yǎng)病毒，收獲尿囊液，超速離心濃縮，蔗糖密度梯度離心純化病毒，用血凝試驗、蛋白定量、透射電鏡和SDS-PAGE鑒定病毒顆粒。取病毒純化產(chǎn)物以0.03 mg/只和0.005 mg/只分組免疫小鼠，采集小鼠血清，利用血凝抑制試驗測定血清血凝抑制滴度。結(jié)果 成功利用蔗糖密度梯度離心法純化出流感病毒，病毒原液經(jīng)純化后被分離成L、M、H三個病毒帶，其中M病毒帶的吸光度、蛋白濃度及血凝滴度最高，蛋白濃度可達(dá)1.2 mg/mL，血凝滴度高達(dá)1×49。電鏡觀察顯示，L區(qū)帶為具有血凝活性的質(zhì)膜和結(jié)構(gòu)疏松的病毒組成，M區(qū)帶病毒顆粒呈球形、絲狀或棒狀。同時，有大量空心病毒顆粒存在。H區(qū)帶與M區(qū)帶類似，但未發(fā)現(xiàn)空心病毒顆粒。純化的病毒免疫小鼠后可產(chǎn)生具有較高血凝抑制活性的抗體。結(jié)論 蔗糖密度梯度離心技術(shù)可用于流感病毒抗原的制備，且不影響病毒的免疫原性。因此，密度梯度離心法可為流感病毒的基礎(chǔ)研究及疫苗開發(fā)提供技術(shù)支持。

甲型流感病毒；蔗糖密度梯度超速離心；免疫原性

甲型流感病毒屬于正黏病毒科，流感病毒屬，是引起急性呼吸道感染的病原體。疫苗接種是預(yù)防流感的有效途徑[1]。目前在流感病毒抗原或疫苗制備中，主要通過層析與密度梯度離心法制備[2]，近來也有基因重組構(gòu)建病毒樣顆粒獲取抗原[3]。本研究用傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心法純化流感病毒，并對純化的病毒進(jìn)行免疫原性分析，為病毒抗原的快速制備及疫苗研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 A/PR/8/34(H1N1)病毒為本實驗室保存毒株。9日齡SPF雞胚購自北京實驗動物中心。6～8周齡BALB/c小鼠購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。CP90WX超速離心機(jī)購于日本日立公司。

1.2 病毒雞胚培養(yǎng) 取病毒毒種用生理鹽水稀釋，接種9 d齡雞胚尿囊腔作病毒培養(yǎng)組，另取等量生理鹽水接種雞胚作對照組，置35 ℃培養(yǎng)72 h后，取所有雞胚置于4 ℃過夜，分別收獲病毒培養(yǎng)組和對照組尿囊液[4]。用紫外照射法在4 ℃條件下滅活病毒組原液。

1.3 蔗糖密度梯度離心純化病毒顆粒 收集原液，3 000 r/min(離心半徑=10 cm)離心10 min，收集上清30 000 r/min(離心半徑=9.21 cm)超速離心4 h，加入PBS(100 mmol/L，pH 7.2)重懸沉淀。將濃縮液鋪入預(yù)先制備的50～600 mg/mL蔗糖密度梯度液上，用水平轉(zhuǎn)頭(P40ST)20 000 r/min(離心半徑=15.88 cm)離心6 h。分布分層收集超速離心純化產(chǎn)物，紫外可見分光光度計(NanoDrop 2 000，Thermo fisher)分別檢測每層的吸光度，用BCA微量蛋白定量試劑盒(購于Thermo Fisher)對每層總蛋白濃度進(jìn)行定量,具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。收集的病毒層置-80 ℃保存。

1.4 透射電鏡觀察病毒 取病毒純化產(chǎn)物滴加到銅網(wǎng)上，室溫靜置10 min，用濾紙吸干多余樣品，滴加20 g/L磷鎢酸負(fù)染5 min，燈下烤干銅網(wǎng)后置電鏡下觀察(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部電鏡室Hitachi H-600)。

1.5 動物免疫 選取6周齡BALB/c小鼠9只，分成高劑量組(0.03 mg/只)、低劑量組(0.005 mg/只)和對照組(PBS)，每組3只，經(jīng)純化的病毒抗原用PBS按不同免疫劑量稀釋。常規(guī)方法免疫，采集小鼠血清并保存至4 ℃。

1.6 血凝試驗和血凝抑制試驗 血凝試驗和血凝抑制試驗具體方法參照《WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance》。

1.7 SDS-PAGE分析 分布分層收集的純化產(chǎn)物按照《分子克隆實驗指南(第2版)》進(jìn)行蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.8 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均錄入SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組均數(shù)間的比較用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分層分析密度梯度離心純化產(chǎn)物 蔗糖密度梯度離心后，病毒原液被分成L、M、H三個病毒帶(圖1)，每層以0.5 mL分布收集并檢測每層的吸光度、蛋白濃度和血凝活性，共分布收集21層，其中第8層血凝滴度為1×44，但在吸光度和蛋白測定時無顯著峰值(此即為L區(qū)帶)。第14層(浮密度=1.181 4)的吸光度、蛋白濃度和血凝滴度均最高(圖2A、2B、2C)。這也是M區(qū)帶所在位置，該區(qū)帶蛋白質(zhì)量濃度最高可達(dá)1.2 mg/mL，血凝滴度為1×49。另外，病毒層在波長為215 nm處的吸光度較260 nm和280 nm處有更顯著的峰。第16層(H區(qū)帶)的血凝滴度也為1×49，但吸光度和蛋白濃度均較14層主峰低。正常雞胚尿囊液也以同樣純化方法處理，但未見蛋白區(qū)帶出現(xiàn)(圖1～4)。

圖1 分層分析蔗糖密度梯度離心純化的流感病毒Fig.1 Analysis of fractions of the purified influenza virus by sucrose density gradient

圖2 密度梯度純化后分布收集并分層檢測Fig.2 The production of sucrose density gradient centrifugation was collected and separated into fractions for test

2.2 病毒顆粒的形態(tài)學(xué)觀察 用透射電鏡分別觀察L、M、H區(qū)帶發(fā)現(xiàn)(圖3)，L區(qū)帶為具有血凝活性的質(zhì)膜和結(jié)構(gòu)疏松的病毒組成(圖3A)。M區(qū)帶病毒顆粒大部分呈球形結(jié)構(gòu)，直徑在50～100 nm，同時有大量空心病毒顆粒存在(圖3B)。另外，也有長度在200～400 nm的絲狀或棒狀病毒顆粒(圖3C)。病毒外層可見到清晰的血凝素或神經(jīng)氨酸酶蛋白棘突(圖3D)。H區(qū)帶與M區(qū)帶觀察結(jié)果類似，但未發(fā)現(xiàn)空心病毒顆粒。

圖3 流感病毒的電鏡觀察Fig.3 Photographs of viral particles revealed by transmission electron microscopy

2.3 病毒顆粒免疫原性評價 免疫小鼠血清經(jīng)血凝抑制試驗檢測，高劑量組血凝抑制效價為6 654.0±1.5，低劑量組為630.3±2.8，PBS對照組為26.0±1.5。3組血凝抑制效價間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.44，P<0.01)。3組間兩兩比較顯示，高劑量組和低劑量組血凝抑制效價均較對照組高(P<0.001)，其中高劑量組高于低劑量組(P<0.001)。

3 討 論

目前在流感病毒純化方面，由于層析技術(shù)的迅速發(fā)展，現(xiàn)在大多利用該技術(shù)制備流感病毒[5]，其中BLOM等[6]建立了流感病毒凝膠色譜純化法，KALBFUSS等[7]先利用凝膠色譜柱粗純?nèi)缓笥秒x子交換色譜法進(jìn)一步純化而獲得病毒顆粒。也有報道用中空纖維柱超濾結(jié)合分子篩色譜法純化流感病毒[8]。而很少使用傳統(tǒng)的密度梯度超速離心技術(shù)制備流感病毒顆粒，以往也有對傳統(tǒng)密度梯度離心方法與層析方法的比較研究，層析法的病毒蛋白純度略高密度梯度離心法，但是蔗糖密度梯度離心法的病毒回收率更優(yōu)于層析法[9]。與此同時，在流感病毒抗原制備中，利用基因工程技術(shù)重組表達(dá)流感病毒蛋白[10-12]，尤其是用于高致病性禽流感蛋白表達(dá)[13-14]，這也為亞單位疫苗的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。而此研究利用蔗糖密度梯度離心技術(shù)大量制備完整流感病毒顆粒，并分析病毒的免疫原性。

密度梯度離心純化病毒方法簡單，操作易于掌握，并可獲得完整病毒顆粒，病毒區(qū)帶較為明顯利于回收。因此，本研究通過蔗糖密度梯度純化流感病毒顆粒，分布收集后發(fā)現(xiàn)，M區(qū)帶為主要病毒層，浮密度為1.181 4，與早期利用密度梯度離心法制備流感病毒結(jié)果相同[15]，病毒純化過程中不影響病毒血凝活性。前期也利用氯化銫作為密度梯度離心介質(zhì)純化流感病毒，但由于氯化銫高鹽成分對血凝活性有較大影響而此次純化未被采用。病毒顆粒在波長為215 nm處較為敏感，所以不管采用層析技術(shù)還是密度梯度離心技術(shù)均可用215 nm波長監(jiān)測病毒峰。完整的病毒顆粒大小不均勻，有球形、絲狀和棒狀等，并在M區(qū)帶存在空心病毒顆粒。在病毒純化技術(shù)優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，用超離濃縮病毒時會產(chǎn)生許多不規(guī)則型病毒顆粒，而用超濾或切向流過濾濃縮可保持病毒顆粒呈圓形或橢圓形形狀，這與SUGITA等[16]的報道相似，但是超濾和切向流濃縮較超離濃縮耗時長、病毒易結(jié)合到濾膜上降低回收率、操作復(fù)雜等。因此，在病毒形態(tài)學(xué)研究中盡量用超濾或切向流濃縮病毒，如果僅需要制備病毒抗原可選擇超離快速濃縮或在濃縮前對病毒進(jìn)行固定也可行超離濃縮并保持病毒正常形態(tài)。另外，L區(qū)帶在電鏡下觀察到與病毒連接的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，同時具有血凝活性，推斷是病毒分泌出細(xì)胞時攜帶的宿主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[17-18]。此次純化產(chǎn)物分層收集后也進(jìn)行了SDS-PAGE分析，大于72 ku的雜蛋白被低密度蔗糖阻留在1～10層，病毒蛋白主要在13～15層(圖4)。利用14層病毒抗原免疫小鼠后，與空白對照組相比，病毒抗原可以刺激小鼠產(chǎn)生具有很高血凝抑制活性的抗體。這也表明，通過該方法純化病毒時不會影響病毒的免疫原性。

圖4 密度梯度離心分層收集純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 The production of sucrose density gradient centrifugation separated into fractions for SDS-PAGE

綜上，雖然現(xiàn)在科技不斷進(jìn)步，層析技術(shù)日新月異，但是在病毒純化中，密度梯度離心法也具有其用武之地和獨(dú)到之處，由于超離是通過物理方法分離病毒，所以操作過程中不會添加其他化學(xué)試劑，對病毒活性影響較小。密度梯度離心條件優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，離心2 h后病毒層位置偏上且較疏松，4～6 h后病毒顆粒形成清晰致密病毒層，回收蛋白濃度高，而層析時洗脫體積較大，病毒蛋白濃度低且層析填料對病毒損耗較大導(dǎo)致回收率下降。如果適量延長超離時間，使病毒達(dá)到其等密度梯度，也可進(jìn)一步分離空心病毒與完整病毒，層析無法對這兩種病毒進(jìn)行分離。如果病毒含量低時可在梯度液上層加入結(jié)晶紫，在離心過程中病毒顆粒被染成藍(lán)色形成藍(lán)色致密病毒層，利于回收。本研究對蔗糖密度梯度純化流感病毒做了優(yōu)化和評價，并鑒定了病毒顆粒的免疫原性，為下一步天然病毒血凝素提純提供原材料，為流感疫苗開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯 韓維棟)

Purification and biological characterization of influenza virus type A

LIU Yang1,2, ZHAO Xiang-rong1,2, GUO Chun-yan1,2, HU Jun1,2, YU Peng-bo3

(1. Central Laboratory of Shaanxi Province People’s Hospital, Xi’an 710068;2. the Third Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710068;3. Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, Xi’an 710054, China)

Objective To evaluate the purification method of sucrose density gradient for influenza A virus and analyze the characterization and immunogenicity of influenza A virus. Methods Influenza virus was produced with allantoic fluid from fertilized eggs. Harvested allantoic fluid was concentrated by ultracentrifugation and the viral particles were purified utilizing sucrose density gradient ultracentrifugation. The purification of viral particles was analyzed by hemagglutination test, micro-BCA protein assay, transmission electron microscopy and SDS-PAGE. The mice were immunized with the purification of inactivated virus. The serum of the titer of hemagglutination inhibition was determined by hemagglutination inhibition test. Results Influenza viral particles were successfully purified utilizing sucrose gradient ultracentrifugation. The virus was found to be separated into three zones (zones L, M and H). The optional density, protein concentration and HA titer of M zone were the highest. The protein concentration and HA titer were 1.2 mg/mL and 1×49, respectively. TEM revealed that zone L contained viral particles and plasma membrane with HA activity. Viral particles of zone M were spherical or extended threadlike, with some hollow viral particles. H and M were the same; however, hollow viral particles were not found in zone H. The high HAI activity antibody responses were induced by the purified virus in mouse immunogenicity studies. Conclusion Sucrose density gradient ultracentrifugation is an effective method for preparation of influenza virus, which can ensure the immunogenicity of the virus. Therefore, the method of density gradient ultracentrifugation can provide technical support for viral fundamental study and the development of influenza vaccine.

influenza virus type A; sucrose density gradient ultracentrifugation; immunogenicity

2015-11-17

2016-04-25

國家科技重大專項傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺項目(No.2013ZX10004202)；國家科技重大專項(No.2014ZX10004002-002-005)

Supported by the National Major Project of Infectious Diseases of Science and Technology Monitoring Platform (No.2013ZX10004202) and National Major Projects (No.2014ZX10004002-002-005)

胡軍. E-mail: hjj6562@163.com；余鵬博. E-mail: sxcdcy@126.com

R373.1+3

A

10.7652/jdyxb201606025

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161012.0948.004.html(2016-10-12)