王艷云，郭篤發(fā)

(山東師范大學(xué) 地理與環(huán)境學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000)

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黃河三角洲鹽堿地土壤真菌多樣性及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

王艷云，郭篤發(fā)*

(山東師范大學(xué) 地理與環(huán)境學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000)

采用454高通量測序(454high throughput sequencing)分析方法，研究不同覆被(光板地和檉柳群落以及白茅群落)類型下土壤真菌組成、多樣性及與理化性質(zhì)的關(guān)系。該研究共獲得5門174屬真菌，不同土樣中真菌種類和多樣性有所不同，其中，白茅群落真菌的種類較多，尤其是HZ3A(白茅0～20cm)中真菌屬數(shù)量最多，其真菌屬分別是HZ1A(光板地0～20cm)、HZ1B(光板地20～40cm)、HZ2A(檉柳0～20cm)、HZ2B(檉柳20～40cm)、HZ3B(白茅20～40cm)的2.23、1.74、1.24、2.18和1.38倍。此外，白茅群落真菌多樣性高于檉柳群落和光板地。堿解氮對土壤真菌多樣性和分布的影響最大，其與Knufia、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、毛霉屬(Mucor)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)的相對豐度呈負(fù)相關(guān)，與其余真菌屬的相對豐度呈正相關(guān)。

黃河三角洲；454高通量測序；土壤真菌；真菌多樣性；堿解氮

土壤鹽堿化包括土壤的鹽化和堿化[1]，土壤鹽堿化當(dāng)前已經(jīng)成為一個全球性的問題。據(jù)估計，全球的鹽堿土面積以每年100萬～150萬hm2的速度增長[2]。黃河三角洲位于渤海西岸，區(qū)內(nèi)大部分是高度鹽堿化土壤。土壤鹽堿重，自然條件極差，使得黃河三角洲地區(qū)自然分布著種類和數(shù)量極為豐富的耐鹽植物，鹽地檉柳、白茅、旱柳以及堿蓬等植物為優(yōu)勢種[3]。到目前為止，對黃河三角洲耐鹽植被的研究涉及重金屬與鹽生植被[4]、鹽生植物種類與分布[5]、鹽生植物與土壤鹽分的關(guān)系[6]，但對黃河三角洲耐鹽植被下土壤真菌的研究極少，且多集中在對某一特定真菌的研究，尤其是黃河三角洲優(yōu)勢耐鹽植被下土壤真菌的研究鮮有報道。實際上，土壤中的生物種類繁多，而真菌組成了土壤生物量的很大部分。真菌作為重要的微生物，通過分解動植物殘體和排泄物等，對土壤系統(tǒng)的物質(zhì)與能量循環(huán)起著至關(guān)重要的作用。同時，真菌在改善土壤結(jié)構(gòu)方面也發(fā)揮著重要作用。因此，采用通量高、讀長長的454焦磷酸測序技術(shù)研究土壤真菌的多樣性及其與土壤理化因子的關(guān)系具有重要意義。

本研究主要利用454高通量測序技術(shù)分析光板地和耐鹽植被群落(檉柳、白茅)下土壤真菌種類及其數(shù)量，探究真菌與土壤理化因子的關(guān)系，為全面了解鹽堿條件下土壤真菌多樣性和分布特征以及黃河三角洲重度鹽堿退化濱海濕地的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

于2012年5月在黃河三角洲的中心城市——東營市河口區(qū)進(jìn)行采樣。具體方法如下：依據(jù)該區(qū)域植被的演替順序，以空間代替時間，分別在光板地、檉柳地、白茅地各設(shè)置3個200cm×200cm的樣方，在樣方內(nèi)采用對角線5點(diǎn)取樣法，分層(0～20、20～40cm)測定地下生物量，4次重復(fù)。將在多個地點(diǎn)采集的土壤分別進(jìn)行充分混合并除去根系等雜物后，分成2份，每份約200g，編號：HZ1A(光板地0～20cm)、HZ1B(光板地20～40cm)、HZ2A(檉柳0～20cm)、HZ2B(檉柳20～40cm)、HZ3A(白茅0～20cm)和HZ3A(白茅20～40cm)。1份封于滅菌袋中，4℃冷凍干燥保存，用于土壤理化性質(zhì)分析；另1份放入液氮罐帶回實驗室，保存在-80℃，用于分子生物學(xué)研究。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

在野外采集土樣的同時用TDR100土壤水分探測器測各采樣點(diǎn)0～20和20～40cm的水分。

樣品風(fēng)干后測定土壤理化性質(zhì)，每個理化性質(zhì)設(shè)4次重復(fù)，除去偏差較大的結(jié)果，最后取各自平均值作為理化性質(zhì)最終結(jié)果。速效磷含量測定采用Olsen法(恒溫水浴振蕩浸提)，全氮含量測定采用凱氏定氮法[7]，堿解氮含量測定采用堿解擴(kuò)散法[8]，銨態(tài)氮含量測定采用鈉試劑比色法，硝態(tài)氮含量測定采用紫外雙波長分光光度法，土壤粒徑分析參考Kettler等[9]的方法。

1.3 土壤DNA提取與PCR擴(kuò)增

稱取0.5g土壤，用Omega DNA試劑盒(D5625-01)依據(jù)說明書提取土壤總DNA。

PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 10ng、10×buffer、0.4mmol·L-1dNTP(0.5μL)、5U·μL-1TaqDNA聚合酶(0.5μL)、1μL Bar-PCR primer F (50μmol·L-1)、1μL primer R (50μmol·L-1)。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5min；95℃ 45s，57℃ 30s，72℃ 45s，30個循環(huán)；72℃ 5min，10℃保存PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增采用Roche 454FLX測序平臺的通用引物，即18sF(Bar-PCR primer F)(5’-CGTATCGCCTCCTCGCGCCATCAG+bar+CAGTAGTCATATGCTTGTCT-3’)、18sR(5’-primer R)(5’-CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用羅氏公司454測序儀(Roch GS FLX sequencer)進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

主要利用Excel和Canoco 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。OTU聚類：將多條序列根據(jù)其序列之間的距離對它們進(jìn)行聚類，然后根據(jù)序列之間的相似性(97%)作為域值分成操作分類單元(OTU)。物種分類：直接blast比對數(shù)據(jù)庫將序列進(jìn)行物種分類。相似性分析則是基于Unifrac metric來比較多組樣本之間的差別度量。Unifrac metric是一種基于系統(tǒng)發(fā)育樹的計算值，可較好地用于衡量樣本間物種組成的相似度[12]，值在0～1之間，值越小說明樣本間相似度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃河三角洲土壤真菌種類

利用454高通量測序技術(shù)分析光板地和耐鹽植被群落(檉柳、白茅)下土壤真菌種類，共獲得5門174屬。在門的分類水平上主要包括：子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、毛霉亞門(Mucoromycotina)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，其中，子囊菌門在所有樣本中的豐度為1.1%～42.22%(圖1-A)，為最優(yōu)勢門，遠(yuǎn)高于次優(yōu)勢門——擔(dān)子菌門(0.83%～16.39%)，子囊菌門表現(xiàn)出非常明顯的優(yōu)勢地位。在屬分類水平上，優(yōu)勢類群(相對豐度>0.8%)主要包括Knufia、小脆柄菇屬(Psathyrella)、旋孢腔菌屬(Cohliobolus)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、焦孢殼屬(Diatrype)、亡革菌屬(Thanatephorus)、光柄菇屬(Pluteus)、Lulwoana、肉座菌屬(Hypocrea)、Rhizophydium、毛霉屬(Mucor)、潮間海屬(Pontogneia)、被孢霉屬(Mortierella)、Coniochaeta、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)，其中，最優(yōu)勢屬是Diatrype，它在HZ1A、HZ1B、HZ2A、HZ2B、HZ3A、HZ3B中的相對豐度依次為9.69%、0.24%、0.11%、4.47%、0.58%、0.06%(圖1-B)。

A，門；B，屬A，phylum; B，genus

2.2 不同深度土壤真菌的分布

土壤真菌種類及其數(shù)量在不同樣地中均存在差異。如光板地中，焦孢殼屬(Diatrype)相對豐度較高；檉柳群落中，被孢霉屬(Mortierella)、Cochliobolus相對豐度較高；而白茅群落中，馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)相對豐度較高。此外，HZ1A、HZ1B、HZ2A、HZ2B、HZ3A和HZ3B中依次獲得39屬、50屬、70屬、40屬、87屬、63屬真菌，說明HZ3A中真菌屬的數(shù)量最多，HZ2A中次之，HZ1A最少。因此，從整體上看，真菌種類從高到低依次為白茅群落、檉柳群落、光板地，說明真菌種類隨著鹽生植被正向演替有不斷增多的趨勢。光板地土壤中，0～20cm土壤真菌種類少于20～40cm土壤；在檉柳群落和白茅群落中，0～20cm土壤真菌種類多于20～40cm。土壤真菌相對豐度的變化規(guī)律與種類上的變化規(guī)律基本一致，除光板地外，同一真菌，其在0～20cm的相對豐度普遍大于20～40cm的相對豐度。因此，隨土壤深度的增加，光板地中真菌種類和相對豐度呈現(xiàn)出增多的趨勢，而在檉柳和白茅群落中隨土壤深度增加，真菌種類和相對豐度有不斷減少的趨勢。

2.3 土壤真菌多樣性

由表1可知，6個土樣中土壤真菌覆蓋率均高于89%，表明本次實驗測序深度較合理，基本能代表各樣本土壤真菌的真實情況。在各樣地中，OTUs數(shù)以及Chao1依次為白茅群落>光板地>檉柳群落；Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)依次為白茅群落>檉柳群落>光板地，表明白茅群落真菌種類最為豐富，與前文分析結(jié)果一致。6個土樣中OTUs數(shù)依次為HZ3A>HZ1A>HZ2A>HZ3B>HZ1B>HZ2B；Shannon指數(shù)平均值依次為HZ3A>HZ2A>HZ1A>HZ2B>HZ1B>HZ3B；ACE指數(shù)以及Chao1指數(shù)平均值均為HZ3A>HZ2A>HZ1A>HZ1B>HZ3B>HZ2B，其中，HZ3A的OTUs數(shù)是HZ2B的2.37倍，HZ3A的Shannon指數(shù)平均值是HZ3B的1.36倍，HZ3A的ACE指數(shù)以及Chao1指數(shù)平均值分別是HZ2B的3.08和2.71倍。由此可知，白茅群落真菌種類較多，尤其是0～20cm土壤中真菌種類最為豐富，多樣性最高。

表1 土壤真菌群落多樣性
Table 1 Community diversity of soil fungi

樣地Samples有效序列數(shù)Seq可操作分類單元OTUs多樣性指數(shù)ShannonACEChao1覆蓋率Coverage/%HZ1A66268744.851775.921437.6493.93HZ2A44688585.532340.181670.9189.66HZ3A662713076.242476.632036.7591.38HZ1B41676894.681597.971179.4191.72HZ2B49215514.73804.94750.8195.67HZ3B56526904.591077.381042.5694.78

2.4 土壤真菌的相似性

從表2可知，HZ1B與HZ2B真菌群落間的Unifrac metric值最小，為0.2355；HZ1A與HZ1B以及HZ1B與HZ3B真菌群落間的Unifrac metric值較小(0.2671、0.2822)；HZ2B與HZ3A真菌群落間的Unifrac metric值最大，為0.7197，說明HZ1B與HZ2B間真菌群落間的相似性最大，HZ1A與HZ1B間以及HZ1B與HZ3B間真菌群落間的相似性較大，而HZ2B與HZ3A間真菌群落間相似性最小。

2.5 土壤真菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

對黃河三角洲土壤中的優(yōu)勢真菌屬和多樣性指數(shù)及土壤理化性質(zhì)進(jìn)行RDA分析，第1軸可以解釋所有信息的67.06%，第2軸可解釋17.58%(圖2)。由RDA排序圖可知，土壤堿解氮、速效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮對土壤真菌屬及其多樣性的分布作用較大。其中，土壤堿解氮最大，它與Knufia、Cochliobolus、毛霉屬(Mucor)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、Shannon、ACE、Chao1呈負(fù)相關(guān)，與其余真菌屬呈正相關(guān)。土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及電導(dǎo)率與土壤真菌屬及其多樣性的相關(guān)規(guī)律與土壤堿解氮基本一致。而土壤速效磷、全氮與土壤真菌屬和其多樣性的相關(guān)規(guī)律與土壤堿解氮完全相反。土壤含水率僅與馬拉色氏霉菌屬、Shannon、ACE、Chao1成正相關(guān)，與其余真菌屬成正相關(guān)。

表2 土壤真菌群落間Unifrac metric值
Table 2 Unifrac metric in soil fungi community

樣地SamplesHZ1AHZ1BHZ2AHZ2BHZ3AHZ3BHZ1A1.0000HZ1B0.26711.0000HZ2A0.65460.68641.0000HZ2B0.37750.23550.69011.0000HZ3A0.58610.63700.58000.71971.0000HZ3B0.33650.28220.65070.32100.57951.0000

a、b、c、d、e、f、g、h、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s分別代表Knufia、小脆柄菇屬、旋孢腔菌屬、莖點(diǎn)霉屬、焦孢殼屬、亡革菌屬、光柄菇屬、Lulwoana、肉座菌屬、Rhizophydium、毛霉屬、潮間海屬、被孢霉屬、Coniochaeta、馬拉色氏霉菌屬、以及Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)a，b，c，d，e，f，g，h，j，k，l，m，n，o，p，q，r and s represent Knufia，Psathyrella，Cochliobolus，Phoma，Diatrype，Thanatephorus，Pluteus，Lulwoana，Hypocrea，Rhizophydium，Mucor，Pontogeneia，Mortierella，Coniochaeta，Malassezia，Shannon，ACE，Chao1，respectively

3 結(jié)論與討論

由于土壤真菌數(shù)量巨大，種類繁多[10-11]，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法遺漏了土壤中的一部分真菌，難以反映真菌群落多樣性全貌[12]，雖然變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)和末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)法具有高通量的優(yōu)勢，能指示不同群落結(jié)構(gòu)的差別，但其對微生物的認(rèn)識有限[13]，常用的克隆文庫分析則存在耗時耗力、通量低、文庫小以及分辨率低等缺點(diǎn)[14]。454高通量測序相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、DGGE、T-RFLP以及克隆文庫等常規(guī)的分子生態(tài)學(xué)研究方法，擁有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、獲得信息豐富、快捷和讀長長等優(yōu)點(diǎn)[15]，能夠研究高度復(fù)雜的真菌群落和稀有的微生物類群[16-18]。借鑒前人經(jīng)驗[15，19-22]，本研究在土樣采集時已經(jīng)將多點(diǎn)混勻，因此未對同一樣品設(shè)置重復(fù)，若實驗條件允許，可在此方面進(jìn)行后續(xù)研究。

在門以及屬分類水平上，黃河三角洲檉柳和白茅群落的真菌種類以及相對豐度普遍高于光板地，推測植物能影響并增加土壤真菌種類及相對豐度，可能與植物體釋放的根系分泌物有關(guān)[23]。通過Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)分析可知，白茅群落和檉柳群落土壤真菌多樣性也普遍高于光板地，表明植物種類的多樣性也會影響土壤真菌的多樣性，同Rovira[24]的研究結(jié)果一致。

在同一樣地中，光板地中上層和下層真菌群落間的相似度最高，土壤深度對其真菌種類的影響最小，而檉柳和白茅群落中上層和下層真菌群落間相似度較低，可能是植物的出現(xiàn)加速了真菌的改變，使得真菌種類增多。在0～20cm土層中，光板地與檉柳群落間的Unifrac metric值為0.6546，與白茅群落間的Unifrac metric值為0.5861，檉柳與白茅群落間的Unifrac metric值為0.5800，表明在0～20cm土層中，檉柳與白茅群落的真菌相似度最高，光板地與白茅群落的真菌相似度次之，光板地與檉柳群落的真菌相似度最低。在20～40cm土層中，光板地與檉柳群落間的Unifrac metric值為0.2355，與白茅群落間的Unifrac metric值為0.2822，檉柳與白茅群落間的Unifrac metric值為0.3210，表明在20～40cm土層中，光板地與檉柳群落的真菌相似度最高，光板地與白茅群落的真菌相似度次之，檉柳與白茅群落的真菌相似度最低，與0～20cm土層的真菌相似度順序相反。另外，0～20cm土層中，真菌群落間的相似度明顯大于20～40cm土層，表明后者真菌種類較前者少，真菌群落變化速率慢，豐富度低，可能與植物、土壤透氣性以及營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。

用454高通量測序方法研究光板地、檉柳群落和白茅群落土壤真菌組成及多樣性及其與土壤真菌與理化因子的關(guān)系，結(jié)果表明，(1)從整體上看，真菌種類及其多樣性隨著正向演替有不斷增多的趨勢，白茅20～40cm真菌屬種類最多，檉柳20～40cm次之，光板地0～20cm最少；同時，OTUs數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)平均值均是白茅群落>光板地>檉柳群落。(2)隨土壤深度的增加，光板地真菌種類和相對豐度呈現(xiàn)出增多的趨勢，而檉柳和白茅群落則與之相反；此外，0～20cm土層中菌群落間的相似度明顯大于20～40cm土層，表明隨土壤深度的增加，真菌種類減少。(3)土壤堿解氮對土壤真菌屬和其多樣性的分布影響最大，與Knufia、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、毛霉屬(Mucor)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與其余真菌屬呈正相關(guān)。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

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Soil fungal diversity and its relationship with soil physical and chemical properties in saline alkali soil of Yellow River Delta

WANG Yan-yun，GUO Du-fa*

(CollegeofGeographyandEnvironment，ShandongNormalUniversity，Ji’nan250000，China)

Soil fungal diversity and the relationship between physical and chemical properties were studied using 454high-throughput sequencing under bare land，Tamarixchinensiscommunity andApocynumvenetumcommunity.Total of 174genera and 5phyla were obtained in this study.The species and diversity of these fungi in different soil samples were different.Many kinds of fungi were obtained inA.venetumcommunity，and HZ3A had the most fungi species.The genus of HZ3A was 2.23times as much as HZ1A，1.74times as much as HZ1B，1.24times as much as HZ2A，2.18times as much as HZ2B，1.38times as much as HZ3B.In addition，soil fungal diversity ofA.venetumcommunity was higher than those of bare land andT.chinensiscommunity.Alkali-hydrolyzable nitrogen (AN) had the greatest impact on distribution and diversity of soil fungal genera.AN was negatively correlated with the relative abundances ofKnufia，Cochliobolus，Mucor，Malasseziaand was positively correlated with the other fungi.

Yellow River Delta； 454high throughput sequencing； soil fungi，fungal diversity; alkali-hydrolyzable nitrogen

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.15

2016-03-22

山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2012DM013)

王艷云(1990—)，女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事土壤真菌研究。E-mail: 1786582634@qq.com

S287；Q939.5

A

1004-1524(2016)11-1901-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1901-1907

http://www.zjnyxb.cn

王艷云，郭篤發(fā).黃河三角洲鹽堿地土壤真菌多樣性及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(11): 1901-1907.

*通信作者，郭篤發(fā)，E-mial: guodufa@163.com