馮 超,田登梅,劉麗輝,施 兵,張永清#

1)河北北方學院 張家口 075000 2)解放軍第309醫(yī)院移植血液科 北京 100091

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慢性髓性白血病患者骨髓中Notch信號通路的表達*

馮 超1),田登梅2),劉麗輝2),施 兵2),張永清2)#

1)河北北方學院 張家口 075000 2)解放軍第309醫(yī)院移植血液科 北京 100091

#通信作者，男，1965年7月生，博士，副教授，研究方向：造血干細胞移植，E-mail:zhangyongqing0725@163.com

Notch信號通路；慢性髓性白血?。籅CR-ABL 融合基因

目的：探討慢性髓性白血病(CML)患者骨髓中Notch信號通路的表達水平及臨床意義。方法：采用實時熒光定量PCR檢測24例CML患者(慢性期12例、急變期12例)和9例正常對照骨髓中Notch1、Notch2、 Delta-like1、Jagged1及Hes1 mRNA的表達。結(jié)果：急變期CML患者骨髓中Notch1和Notch2 mRNA表達水平高于正常對照組及慢性期患者(P<0.05)，Delta-like1 mRNA表達水平低于正常對照組及慢性期患者(P<0.05)。慢性期及急變期患者骨髓中Jagged1、Hes1 mRNA表達水平高于正常對照組(P<0.05)。Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1 mRNA表達水平與CML患者臨床特征無關(guān)(P>0.05)，僅染色體異常的CML患者Delta-like1 mRNA表達水平較染色體正常者升高(P<0.05)。結(jié)論：Notch信號通路可能參與了CML的發(fā)病和急性變。

慢性髓性白血病(chronic myeliod leukaemia，CML)是造血干細胞惡性克隆性疾病，95%以上患者的骨髓中可以找到特征性的Ph染色體和(或)BCR-ABL 融合基因[1]。CML患者的中位生存期為3～5 a，自然病程可分為慢性期、加速期/急變期，慢性期病情較為隱匿，而進入加速期/急變期，患者往往對治療反應(yīng)差，病情進展迅速。有研究[2-8]證實：血液系統(tǒng)腫瘤中存在Notch信號通路的異?；罨?，其可能與血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；Notch信號通路在血細胞發(fā)育過程中調(diào)控干細胞的增殖、分化，可以促進臍血造血干細胞的植入。目前在CML中也發(fā)現(xiàn)了Notch信號的激活，但關(guān)于Notch信號通路在CML中的研究主要集中在細胞系及小鼠模型上。研究[9-11]證實，K562細胞系存在Notch1～4和Jagged2的表達,Notch受體及配體基因轉(zhuǎn)染可抑制K562細胞的生長，誘導凋亡。Notch1活化和 BCR-ABL融合基因的表達縮短了轉(zhuǎn)基因CML小鼠的急淋變周期[12]。在小鼠的骨髓移植模型中，Hes1與BCR-ABL融合基因促進了CML的轉(zhuǎn)變[13]。該研究著重對CML患者Notch信號通路相關(guān)基因mRNA的表達水平及臨床意義進行了研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年4月至2015 年8月解放軍第309醫(yī)院血液科收治的CML患者，慢性期12例，男8例，女4例，中位年齡34歲；急變期12例，男10例，女2例，中位年齡45歲。診斷標準參照《慢性髓性白血病治療專家共識(2010版)》[12]。以9例血常規(guī)1系或多系異常、骨髓穿刺報告為正常者作為正常對照，男3例，女6 例，中位年齡44歲。

1.2 主要試劑和儀器 紅細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen 公司，PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYRB Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自大連寶生物有限公司，Prism Real Time 7500 PCR 擴增儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 染色體核型分析 收集患者骨髓細胞，培養(yǎng)24 h后常規(guī)制片，R顯帶，每份標本至少分析20 個分裂相，根據(jù)《細胞遺傳學國際命名體制( ISCN1995)》判定核型。

1.4 脊髓中Notch1、Notch2、 Delta-like1、Jagged1及Hes1 mRNA檢測

1.4.1 RNA提取及cDNA合成 無菌條件下采集骨髓標本3～4 mL，EDTA 抗凝，加入紅細胞裂解液，離心去上清后，提取單個核細胞。以Trizol提取細胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄體系包括: 5×PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μL，RNA濃度最大為500 mg/L，雙蒸水補至10 μL。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ ∞。合成的cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計與合成 引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,序列見表1。

表1 引物序列

1.4.3 實時熒光定量PCR 采用SYBR Green Ⅰ熒光染料法檢測。反應(yīng)體系包括2×SYRB Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 2 μL，加無RNase水至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，42個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照。每份標本均設(shè)3個復孔，每次擴增均設(shè)立內(nèi)參照和無模板陰性對照。結(jié)果采用2-ΔΔCt法表示，ΔΔCt =(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)實驗組-(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)對照組。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。正常對照，CML慢性期、急變期患者間各mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不同臨床特征CML患者各mRNA表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CML慢性期、急變期患者及正常對照骨髓中Notch1、Notch2、Jagged1、Delta-like1、Hes1 mRNA表達水平的比較 見表2。與正常對照比較，慢性期CML患者骨髓中Jagged1、Hes1 mRNA表達水平升高(P<0.05)；急變期CML患者骨髓中Notch1、Notch2、Jagged1、Hes1 mRNA表達水平升高， Delta-like1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與慢性期組比較，急變期CML患者骨髓中Notch1、Notch2表達水平升高， Delta-like1 mRNA表達水平降低(P<0.05)。

表2 CML慢性期、急變期患者及正常對照骨髓中Notch1、Notch2、Jagged1、Delta-like1、Hes1 mRNA表達水平的比較

*：與正常對照比較，P<0.05;#:與慢性期比較，P<0.05。

2.2 不同臨床特征CML患者Notch1、Notch2、Jagged1、Delta-like1、Hes1 mRNA表達水平的比較

見表3。Notch相關(guān)基因mRNA的表達與CML患者性別、白細胞計數(shù)、BCR-ABL1/ABL1陽性與否無關(guān)(P>0.05)，僅Delta-like1在染色體異常患者中表達升高(P<0.05)。

表3 不同臨床特征CML患者Notch1、Notch2、Jagged1、Delta-like1、Hes1 mRNA表達水平的比較

續(xù)表3

3 討論

Notch信號通路廣泛存在于動物體內(nèi)并高度保守，在細胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用。Notch信號通路是由受體、配體、細胞內(nèi)效應(yīng)分子CSL蛋白(CBF-1,suppressor of hairless,Lag1，3者的合稱)以及多種下游靶基因組成。在哺乳動物中存在4個Notch受體(Notch1～4)和5個配體(Jagged1、2及Delta-like1、3、4)。Notch受體主要表達于造血干/祖細胞，其配體主要表達于基質(zhì)細胞，二者結(jié)合后釋放Notch受體胞內(nèi)段(intracellular domain of Notch，ICN)，ICN 與CSL DNA 結(jié)合蛋白相互作用，形成活化因子，進而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達，從而調(diào)控機體的正常造血功能，當其異?；罨瘯r則可導致惡性血液增殖性疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的惡性血液系統(tǒng)腫瘤與Notch 信號通路的活化關(guān)系密切[14]。急性T淋巴細胞白血病患者幾乎全部高表達Notch受體，約50%的患者存在Notch1基因突變[3-4]。慢性B淋巴細胞白血病患者存在Notch1、Notch2及Jagged1、Jagged2的活化，而正常B細胞中未見該現(xiàn)象，表明Notch信號參與慢性B淋巴細胞白血病細胞的存活及抗凋亡作用[5-6]。在經(jīng)典的霍奇金淋巴瘤中，Notch1及Jagged1高表達，Notch信號通路參與了體外霍奇金淋巴瘤細胞的增殖及存活[7]。

CML是起源于造血干細胞的克隆增殖性疾病，其疾病的進展被認為是多步驟、時間依賴性的，并需要基因的突變或失調(diào)參與[15]。在CML中發(fā)現(xiàn)也存在Notch信號通路的激活[9-13,16]。該研究對CML患者體內(nèi)Notch信號通路的表達進行了分析。結(jié)果顯示，慢性期患者骨髓中Jagged1和Hes1 mRNA的表達高于正常對照，與急變期患者比較差異無統(tǒng)計學意義；與正常對照、慢性期患者相比，CML急變期患者骨髓中Notch1、Notch2 mRNA的表達顯著增高，Delta-like1 mRNA的表達降低；CML患者Notch基因的表達水平與患者性別、白細胞計數(shù)、BCR-ABL1/ABL1陽性與否無關(guān)，僅染色體異常患者骨髓中Delta-like1 mRNA表達水平升高。研究結(jié)果提示，Notch信號通路的配體Jagged1和下游靶基因Hes1可能參與了慢性期CML的發(fā)生和發(fā)展，但沒有參與慢性期向急變期的轉(zhuǎn)變；而Notch1、Notch2、Delta-like1可能參與了CML的進展。

Aljedai等[17]對4例慢性期CML患者和3例正常對照的骨髓進行了測定，但結(jié)果顯示，CD34+Thy+細胞中Notch1 mRNA表達上調(diào)，CD34+Thy+、CD34+Thy-細胞中Notch2 mRNA表達上調(diào)。Aljedai等的研究結(jié)果與此次結(jié)果不同，原因可能有：①所采用的骨髓標本不一致，骨髓的單個核細胞是混合細胞，既包括CML細胞，也包括正常的造血干細胞。②標本取自原代細胞，而患者之間存在著明顯的個體差異。③病例數(shù)較少。

Nakahara等[18]對20例急變期CML患者的樣本(11例外周血，1例腦脊液，8例骨髓)進行分析，發(fā)現(xiàn)Hes1 mRNA表達水平明顯高于正常，而19例慢性期CML患者的骨髓樣本中Hes1 mRNA表達水平則低于正常。但是，Aljedai等[17]研究發(fā)現(xiàn)在慢性期CD34+CML患者的骨髓樣本中，Hes1的表達水平增加。Sengupta等[19]發(fā)現(xiàn)在急變期CD34+CML患者體內(nèi)Hes1表達水平顯著降低,下調(diào)的Hes1促進了CML的急變。造成上述研究結(jié)果差異較大的原因可能為：①標本不一致，外周血、腦脊液、骨髓均有。②研究的分子水平不一致，既在單個核細胞水平上，又在CD34水平上。③多種信號通路(如Sonic Hedgehog通路)調(diào)控或參與Hes1的表達，其他信號通路的激活或失活也可影響Hes1的表達。

綜上所述，CML慢性期、急變期存在Notch信號通路的異常表達，其可能參與了CML的發(fā)病及急性變轉(zhuǎn)化，但Notch信號通路異常表達的原因及其在CML發(fā)病及進展中的具體作用機制尚不是很清晰，需要進一步研究。

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(2016-01-13收稿 責任編輯王 曼)

Expression of Notch signal pathway in bone marrow from patients with chronic myeliod leukaemia

FENGChao1),TIANDengmei2),LIULihui2),SHIBing2),ZHANGYongqing2)

1)HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000 2)DepartmentofHematology,the309thHospitalofPLA，Beijing100091

Notch signal pathway；chronic myeliod leukaemia；BCR-ABL fusion gene

Aim: To explore the expression of Notch signal pathway in bone marrow from patients with chronic myeliod leukaemia(CML)．Methods: Bone marrow from 24 cases of CML(including 12 cases of chronic phase，12 cases of blast crisis) and 9 subjects as control were collected to detect mRNA expression of Notch1,Notch2,Delta-like1,Jagged1,and Hes1 using RT-qPCR．Results: The expression levels of Notch1 and Notch2 mRNA in blast crisis patients were both significantly higher than those in chronic phase patients and the control group(P<0.05),while the expression level of Delta-like1 mRNA was lower(P<0.05).The expression level of Jagged1 and Hes1 mRNA in chronic phase and blast crisis patients were significantly higher than those in the control group(P<0.05).The expression levels of Notch1,Notch2,Jagged1,and Hes1 mRNA in CML patients did not related to clinical parameters(P>0.05),but Delta-like1 mRNA expressed highly in patients with abnormal karyotype(P<0.05).Conclusion: Notch signal pathway may play roles in the pathogenesis and blast crisis of CML.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.012

*國家自然科學基金項目 81400075；解放軍第309醫(yī)院重點課題 2014ZD-002

R733.72