牛副流感病毒3型抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

楊建樂(lè)，趙貴民，侯佩莉，王洪梅，李 杰，何洪彬*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，山東濟(jì)南 250100)

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牛副流感病毒3型抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

楊建樂(lè)1,2，趙貴民2，侯佩莉2，王洪梅2，李 杰1*，何洪彬2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，山東濟(jì)南 250100)

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗體間接ELISA檢測(cè)方法?？寺P-HN截短串聯(lián)基因并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a(+)-NP-HN，誘導(dǎo)純化NP-HN重組蛋白作為包被抗原，優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立BPIV3抗體間接ELISA檢測(cè)方法，進(jìn)一步與病毒中和試驗(yàn)和進(jìn)口ELISA試劑盒進(jìn)行比較，應(yīng)用本方法對(duì)270份臨床血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，表達(dá)的NP-HN重組蛋白大小為44 ku，具有良好的反應(yīng)原性，建立的ELISA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，與牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于8%，與病毒中和試驗(yàn)和進(jìn)口商品化ELISA試劑盒的總符合率分別為96.67%和98.89%。對(duì)采自山東、遼寧和天津的270份臨床血清樣本檢測(cè)后總的陽(yáng)性率為82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗體間接ELISA方法具有較好的特異性和敏感性，可應(yīng)用于BPIV3的流行病學(xué)調(diào)查和抗體檢測(cè)研究。

牛副流感病毒3型；NP-HN基因；原核表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；抗體檢測(cè)

牛流行性感冒是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)引起的一種急性接觸性傳染病，常發(fā)生在飼舍牛群或牛的運(yùn)輸中，故又稱(chēng)“運(yùn)輸熱”，以支氣管炎、肺炎等呼吸道癥狀為主要特征。Reisinger等在1959年首次從牛體內(nèi)分離到BPIV3，目前該病毒已經(jīng)在很多國(guó)家和地區(qū)被分離到[1]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，以及國(guó)內(nèi)外活牛運(yùn)輸?shù)娜找骖l繁，我國(guó)規(guī)模化牛場(chǎng)呼吸道綜合征造成的經(jīng)濟(jì)損失越來(lái)越嚴(yán)重[2]。在我國(guó)有些省份的牛群中BPIV3血清抗體陽(yáng)性率甚至高達(dá)95.15%[3]。2015年，羅玉江等[4]對(duì)新疆北部4個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)的162份流產(chǎn)死胎與鼻拭子等樣本進(jìn)行了BPIV3的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，核酸陽(yáng)性率為9.26%，這提示BPIV3在我國(guó)已經(jīng)流行。當(dāng)前，針對(duì)BPIV3的診斷與防控，國(guó)外主要使用疫苗免疫預(yù)防并有商品化的抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，我國(guó)目前尚無(wú)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)診斷試劑。因此，亟需建立快速檢測(cè)方法，用于BPIV3的流行病學(xué)調(diào)查與研究。

BPIV3為副黏病毒科副黏病毒亞科呼吸道病毒屬的成員，有囊膜，是不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。基因組排列次序?yàn)?′-leader-NP-P/C/V-M-F-HN-L-trailer-5′，病毒基因組全長(zhǎng)至少編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，大致為兩類(lèi)，一類(lèi)為內(nèi)部蛋白，包括NP(核衣殼蛋白)、P(磷蛋白)、L(大分子蛋白)；另一類(lèi)為外部蛋白，包括M(囊膜蛋白)，F(xiàn)(融合蛋白)，HN(血凝素和神經(jīng)氨酸酶)。NP是核衣殼抗原，HN是表面抗原，其中NP蛋白單體呈現(xiàn)螺旋狀結(jié)構(gòu)，NP蛋白C端結(jié)構(gòu)域分布在核衣殼表面，含有抗原決定位點(diǎn)，能用于檢測(cè)病毒自然感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體。近年來(lái)研究證實(shí)了BPIV3 NP蛋白上存在3個(gè)主要抗原表位區(qū)，有2個(gè)分布在C端[5]。HN基因在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，是病毒中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白。本研究通過(guò)分析NP蛋白和HN蛋白主要抗原表位區(qū)并對(duì)其串聯(lián)后原核表達(dá)，以純化的重組蛋白為包被抗原建立了BPIV3抗體間接ELISA檢測(cè)方法，為我國(guó)牛群中BPIV3的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組菌、病毒、血清及臨床樣本 pET28a(+)原核表達(dá)載體，BPIV3 SD2014分離株(CGMCC 9992)，BPIV3抗體陽(yáng)性血清和陰性血清、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BcoV)、牛流行熱病毒(Bovine ephemeral fever vrus)、牛支原體(Mycoplasma bovis，Mb)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)陽(yáng)性血清均通過(guò)病毒中和試驗(yàn)(VNT)或進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)驗(yàn)證，為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛中心疾病研究實(shí)驗(yàn)室保存。90份BPIV3陰陽(yáng)性血清為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛中心疾病研究實(shí)驗(yàn)室保存，270份臨床血清樣本分別采自山東省、遼寧省和天津市的3個(gè)奶牛場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 大腸埃希菌DH5α和BL21(DE3)、Blue plus Ⅱ protein Marker(14 ku～100 ku)為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)為Qiagen公司產(chǎn)品；馬血清為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗牛IgG為Sigma公司產(chǎn)品；Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒為T(mén)hermo Scientific公司產(chǎn)品；Parainfluenza-3 Virus (PI3) Antibody Test Kit(P00652-2，批號(hào)4148)為美國(guó)愛(ài)德士公司產(chǎn)品；分子生物學(xué)常規(guī)試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位區(qū)域的篩選 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序的BPIV3 SD2014分離株NP基因和HN基因序列，運(yùn)用Lasergene 7.1軟件中的Protean程序分別對(duì)NP蛋白和HN蛋白氨基酸序列進(jìn)行主要抗原表位分析。

1.2.2 原核表達(dá)載體pET28a(+)-NP-HN的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)BPIV3 SD2014分離株NP和HN基因序列，同時(shí)參考SD0835株(登錄號(hào)HQ530153)，針對(duì)分析獲得的抗原表位區(qū)域，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增NP、HN基因抗原表位的截短片段，中間用G4S多肽序列連接，最后通過(guò)重疊延伸PCR方法串聯(lián)，引物序列見(jiàn)表1。以BPIV3 cDNA為模板用NP-BamH I-F和NP-G4S-R為引物擴(kuò)增NP片段，以HN-G4S-F和HN-Hind III-R為引物擴(kuò)增HN片段。經(jīng)電泳檢測(cè)和凝膠純化后，再以擴(kuò)增得到的NP、HN截短片段為模板，用NP-BamH I-F和HN-Hind Ⅲ-R為引物，PCR擴(kuò)增NP-HN基因。最后將純化產(chǎn)物連接pET28a(+)原核表達(dá)載體，挑菌提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒送華大基因測(cè)序，并命名為pET28a(+)-NP-HN。

表1 引物序列

注：小寫(xiě)字母為限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，斜體為45 nt的G4S多肽核苷酸序列。

Note:The small letters are the sites for restriction enzyme digestion,and the italic letters were 45 nt nucleotide sequences of G4S peptides.

1.2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析、純化與鑒定 按照本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法[6]，利用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)-NP-HN，依照Ni-NTA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化NP-HN融合蛋白。以BPIV3標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為一抗，1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗牛HRP為二抗，Western blot檢測(cè)純化蛋白的特異性和反應(yīng)原性。

1.2.4 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用方陣滴定法用包被液將NP-HN融合蛋白分別稀釋至0.5 μg/mL～16 μg/mL后包被96孔ELISA板，每孔100 μL，確定最佳抗原包被濃度；以1∶20～1∶200稀釋BPIV3標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性與陰性血清確定最佳一抗?jié)舛龋辉O(shè)置4℃過(guò)夜、37℃包被2 h、37℃包被1 h加4℃過(guò)夜和37℃包被2 h加4℃過(guò)夜4種包被條件，確定最佳包被條件；分別用50 g/L脫脂奶粉、100 mL/L馬血清、200 mL/L馬血清作為封閉液，37℃分別封閉1 h、1.5 h、2 h進(jìn)行最佳封閉液及封閉時(shí)間的確定。將山羊抗牛IgG-HRP分別稀釋2 000倍、4 000倍、8 000倍、16 000倍，確定最佳二抗稀釋濃度。以陽(yáng)性血清和陰性血清分別測(cè)量的OD450 nm的P/N值最大值作為ELISA最佳條件。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 用優(yōu)化好的間接ELISA方法分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的BVDV、IBRV、BRSV、BcoV、BEFV、Mb和Pm陽(yáng)性血清各10份進(jìn)行檢測(cè)(已經(jīng)用VNT檢測(cè)BPIV3抗體陰性)，以BPIV3標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性血清以及空白孔作為對(duì)照。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 選取已經(jīng)應(yīng)用VNT檢測(cè)BPIV3抗體陽(yáng)性血清8份，分別按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280的比例稀釋?zhuān)凑諆?yōu)化好的間接ELISA方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 首先進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，用同一批次制備的抗原包被ELISA板，隨機(jī)抽取應(yīng)用VNT檢測(cè)的BPIV3血清抗體效價(jià)不同的6份樣本，每個(gè)樣本3次重復(fù)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。用同樣的方法以不同時(shí)間制備的3批抗原包被ELISA板，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，分別計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)估本方法的重復(fù)性。

1.2.9 符合率試驗(yàn) 隨機(jī)選取本實(shí)驗(yàn)室保存的BPIV3陰陽(yáng)性血清樣本90份，分別運(yùn)用本研究建立的BPIV3間接ELISA方法、進(jìn)口商品化間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和VNT進(jìn)行比較檢測(cè)，血清中和試驗(yàn)具體步驟參考文獻(xiàn)[7]，血清抗體效價(jià)≥2時(shí)判定為陽(yáng)性，并分別計(jì)算兩種間接ELISA方法與VNT的符合率。

1.2.10 臨床樣品檢測(cè) 運(yùn)用本研究建立的BPIV3間接ELISA方法對(duì)2015年9～11月分別采自山東省、遼寧省及天津市3個(gè)奶牛場(chǎng)的270份臨床血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)分析BPIV3抗體陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 抗原表位區(qū)的篩選

以BPIV3SD2014株NP蛋白和HN蛋白的氨基酸序列為研究對(duì)象，用軟件分別對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，最終確定NP蛋白的C端388aa-515aa，HN蛋白的C端355aa-572aa為優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)。

2.2 NP-HN基因截短串聯(lián)擴(kuò)增與重組原核表達(dá)載體的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得截短的NP和HN片段大小與預(yù)期的一致，分別為390bp和657bp，重疊延伸PCR擴(kuò)增NP-HN片段，電泳檢測(cè)得到與目的片段大小一致的1 092bp的條帶。將重組質(zhì)粒pET28a(+)-NP-HN經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳檢測(cè)在1 092bp與5 369bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與NP-HN截短串聯(lián)基因和pET28a(+)大小一致(圖1)。

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000，M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL10 000 ；1.NP基因截短擴(kuò)增；2.HN基因截短擴(kuò)增；3.NP-HN串聯(lián)擴(kuò)增；4.重組表達(dá)載體pET28a(+)-NP-HN雙酶切產(chǎn)物

M1.DNAMarkerDL2 000；M2.DNAMarkerDL10 000; 1.TheamplificationoftruncatedNPgene; 2.TheamplificationoftruncatedHNgene; 3.TheoverlapextensionamplificationofNP-HNgene; 4.DoubleenzymedigestionproductsofrecombinantexpressionvectorpET28a(+)-NP-HN

圖1NP-HN基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定

Fig.1PCRamplificationofNP-HNgeneandidentificationofrecombinantplasmid

2.3 融合蛋白的可溶性分析、純化與鑒定

陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET28a(+)-NP-HN轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)表達(dá)菌株，終濃度1mmol/LIPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h后，與未誘導(dǎo)組相比NP-HN融合蛋白大量表達(dá)?？扇苄苑治霰砻?，該融合蛋白可以以包涵體和可溶性蛋白兩種形式表達(dá)，但是因?yàn)榘w蛋白沒(méi)有活性，故采用Ni-NTA非變性條件下純化具有天然空間構(gòu)象的可溶性蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，在44ku處獲得特異性條帶，經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度為900μg/mL。經(jīng)Westernblot特異檢測(cè)，融合蛋白在約44ku左右出現(xiàn)條帶(圖2)，說(shuō)明該重組蛋白具有一定的特異性和反應(yīng)原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.重組蛋白的可溶性分析(1.超聲波破碎后上清，2.超聲波破碎后沉淀)；3～6.融合蛋白NP-HN的純化產(chǎn)物，7.重組蛋白表達(dá)的Westernblot鑒定

M.ProteinmolecularweightMarker; 1-2.Solubleanalysisofrecombinantproteins(1.Supernatantafterultrasonicbreaking; 2.Precipitateafterultrasonicbreaking); 3-6.PurifiedproductoffusionproteinNP-HN;7.Westernblotanalysisofrecombinantprotein

圖2 融合蛋白的可溶性分析與鑒定

Fig.2Thesolubilityanalysisandidentificationoffusionprotein

2.4 BPIV3間接ELISA的建立及反應(yīng)條件的確定

通過(guò)方陣滴定法，對(duì)BPIV3間接ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 BPIV3間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)

表2 間接ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化

圖3 陰性血清樣本OD450nm值正態(tài)分布圖

2.6 特異性試驗(yàn)

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的BVDV、IBRV、BRSV、BcoV、BEFV、Mb和Pm陽(yáng)性血清用所建立的BPIV3間接ELISA方法檢測(cè)，測(cè)得其OD450 nm值均小于0.266 2，結(jié)果BPIV3抗體均為陰性，說(shuō)明本研究建立的間接ELISA方法特異性較好。

2.7 敏感性試驗(yàn)

將此8份血清按所建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，按照評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)血清稀釋為1∶1 280時(shí)，8份血清依然呈陽(yáng)性，說(shuō)明本方法靈敏度高。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

通過(guò)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)在1.89%～5.48%，批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)在3.25%～7.38%，均小于8%，證明了該間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表3 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)

2.9 符合率試驗(yàn)

分別用三種方法對(duì)保存的90份BPIV3陰陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。建立的BPIV3 iELISA方法與VNT總符合率為96.67%(87/90)，進(jìn)口BPIV3 iELISA試劑盒與VNT總符合率為97.78%(88/90)，進(jìn)口iELISA試劑盒和研究建立的iELISA方法兩者總符合率為98.89%(89/90)。說(shuō)明建立的ELISA方法與進(jìn)口試劑盒有較高的符合率。

表4 不同檢測(cè)方法的結(jié)果比較

2.10 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)采自山東省、遼寧省和天津市的270份血清進(jìn)行了BPIV3間接ELISA檢測(cè)，共有BPIV3陽(yáng)性血清223份，血清抗體總的陽(yáng)性率為82.59%(223/270)，結(jié)果見(jiàn)表5，說(shuō)明我國(guó)北方的這3個(gè)省份的奶牛場(chǎng)BPIV3已經(jīng)普遍流行。

表5 臨床血清BPIV3抗體的間接ELISA檢測(cè)

3 討論

我國(guó)自2008年首次從黑龍江和山東分別分離到BPIV3，2009年又在內(nèi)蒙古[8]報(bào)道分離到BPIV3，目前報(bào)道我國(guó)12個(gè)省份總的抗體陽(yáng)性率為77.6%[7]，說(shuō)明該病毒已經(jīng)在我國(guó)部分地區(qū)流行，國(guó)外報(bào)道BPIV3流行率最高可以達(dá)到90%[9]。由于牛的許多呼吸道疾病都可以表現(xiàn)出與BPIV3相似的臨床癥狀，而且常常引發(fā)混合感染和繼發(fā)感染，所以臨床上不易做出確診，一般需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷。目前實(shí)驗(yàn)室常用的本病診斷方法主要包括病毒分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。由于病毒的分離培養(yǎng)檢出率低，并且對(duì)試驗(yàn)條件和操作人員的技能要求較高。分子生物學(xué)方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性，同時(shí)對(duì)試驗(yàn)的儀器設(shè)備依賴(lài)程度高。此外，免疫學(xué)方法中的血凝與血凝抑制試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)以及免疫熒光與免疫組化試驗(yàn)更傾向于BPIV3的科學(xué)研究方面，這些方法在規(guī)?；翀?chǎng)大批量流調(diào)篩查中均受到限制，而ELISA方法目前在臨床大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中愈來(lái)愈受到青睞。因此，研發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的BPIV3 ELISA診斷方法迫在眉睫。

呼吸道病毒屬的仙臺(tái)病毒NP蛋白免疫試驗(yàn)研究表明，NP蛋白比HN和F蛋白可誘導(dǎo)更高的IgG抗體，特別是在病毒感染后期可以誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫反應(yīng)。呂闖等[10]以NP蛋白制備的單抗，通過(guò)間接ELISA、Western blot、IFA試驗(yàn)表明該單抗具有良好的反應(yīng)性和特異性。周玉龍等[11]以6 μg/mL的HN蛋白為包被抗原建立了ELISA方法，這些報(bào)道證明了NP蛋白和HN蛋白均具有良好的反應(yīng)原性，可以作為建立診斷方法的抗原蛋白。本研究分別選取NP蛋白的C端388 aa-515 aa和HN蛋白的C端355 aa-572 aa為優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)，為了不影響兩個(gè)蛋白的空間表位，我們通過(guò)G4S多肽Link將他們串聯(lián)表達(dá)，通過(guò)優(yōu)化蛋白純化的誘導(dǎo)時(shí)間和溫度，發(fā)現(xiàn)在37℃，誘導(dǎo)6 h能產(chǎn)生大量可溶性的融合蛋白NP-HN，通過(guò)優(yōu)化ELISA條件，選擇抗原的包被濃度是4 μg/mL，并通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清具有很好的反應(yīng)原性。同時(shí)建立的ELISA方法與病毒中和試驗(yàn)和國(guó)外進(jìn)口試劑盒有很高的符合率(96.67%和98.89%)，表明本方法可用于BPIV3抗體的定性檢測(cè)。

目前，我國(guó)尚無(wú)BPIV3商品化檢測(cè)試劑盒，本研究建立的BPIV3抗體間接ELISA診斷方法可用于BPIV3的流行病學(xué)調(diào)查研究和抗體檢測(cè)，為本病的防控奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment and Preliminary Application of an Indirect ELISA for Detecting Antibodies against Bovine Parainfluenza Virus Type 3

YANG Jian-le1,2，ZHAO Gui-min2，HOU Pei-li2，WANG Hong-mei2，LI Jie1，HE Hong-bin2

(1.CollegeofLifeScience，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin，Heinongjiang,150030，China； 2.DairyCattleResearchCenter，ShandongAcademyofAgriculturalScience，Jinan，Shandong,250100，China)

In order to establish an indirect ELISA (iELISA) for detecting antibodies against bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3),the truncated NP-HN gene was cloned and pET28a(+)-NP-HN vector of prokaryotic expression was constructed.We optimized the ELISA reaction conditions using the NP-HN recombinant protein as coating antigen,and established an iELISA method to specifically detect the positive serum of BPIV3.Further the iELISA method was compared with virus neutralization test and imported ELISA kits,respectively.Finally,270 clinical serum samples were tested.The results showed that the recombinant 44 ku protein could highly expressed in the form of soluble and inclusion bodies inE.coli,which had good antigenic specificity and reactionogenicity,and had no cross reaction with positive serum of bovine viral diarrhea virus,infectious bovine rhinotracheitis virus and other respiratory pathogens.The coefficients of variation for intra and inter-assay were lower than 8%.The total coincidence rate with virus neutralization test and imported ELISA kit were 96.67% and 98.89%.The total positive rate of 270 clinical serum samples from Shandong,Liaoning,and Tianjin was 82.59% (223/270).These results demonstrated that BPIV3 indirect ELISA method was specific and sensitive,and can be used for epidemiological investigation and antibody detection for BPIV3.

Bovine parainfluenza virus type 3；NP-HN；prokaryotic expression；ELISA；antibody detection

2016-04-06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系科學(xué)家崗位項(xiàng)目(Cars-37)；山東省自然科學(xué)基金培育項(xiàng)目(ZR2015PC007)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(2014CXZ08)子課題(2014CXZ08-3)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大成果培育項(xiàng)目(2015CGPY02)

楊建樂(lè)(1991-)，男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病研究。*通訊作者

S852.653

A

1007-5038(2016)11-0019-06