張圣新，劉濟寧，王 蕾①，楊先海，石利利，劉 丹

(1.南京信息工程大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 南京 210044；2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京 210042)

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四溴雙酚A和2，4，6-三溴苯酚對黃顙魚的內(nèi)分泌干擾毒性效應(yīng)

張圣新1,2，劉濟寧2，王 蕾2①，楊先海2，石利利1,2，劉 丹2

(1.南京信息工程大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 南京 210044；2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京 210042)

為研究四溴雙酚A(TBBPA)及其降解產(chǎn)物2,4,6-三溴苯酚(TBP)對黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的內(nèi)分泌干擾毒性效應(yīng)，在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上開展黃顙魚幼體生長毒性試驗，分析黃顙魚的生長率并推導出TBBPA和TBP對黃顙魚28 d最低可觀察效應(yīng)濃度(MORC)和無可觀察效應(yīng)濃度(URC)；利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒分析測定黃顙魚內(nèi)臟促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和卵黃蛋白原(VTG)含量，并進行差異顯著性分析。結(jié)果表明，受試物的濃度和黃顙魚體重增長速率呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，TBBPA對黃顙魚體重增長率的MORC和URC分別為0.32和0.16 mg·L-1，TBP對黃顙魚體重增長率的MORC和URC分別為0.64和0.32 mg·L-1，TBBPA較TBP具有更高的毒性。隨著TBBPA濃度的升高，黃顙魚內(nèi)臟中ACTH和VTG含量與對照相比總體呈上升趨勢。TBP對黃顙魚內(nèi)臟中VTG無顯著影響，但在其質(zhì)量濃度為0.64 mg·L-1時可顯著降低ACTH含量。推測TBBPA和TBP是潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。

四溴雙酚A；2，4，6-三溴苯酚；促腎上腺皮質(zhì)激素；卵黃蛋白原；黃顙魚；內(nèi)分泌干擾

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A,TBBPA)是目前廣泛使用的溴代阻燃劑,三溴苯酚(2,4,6-tribromophenol,TBP)為溴代阻燃劑和消毒防腐藥物等產(chǎn)品的中間體,同時也是TBBPA的主要降解產(chǎn)物之一[1]。這2種物質(zhì)的大量使用對水體、沉積物和土壤等環(huán)境造了嚴重污染[2-4],并在生物體內(nèi)有不同程度檢出[5-8]。有研究表明,TBBPA是一種潛在環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,能夠影響生物的生長、發(fā)育和繁殖[9-11];TBP可以通過競爭結(jié)合蛋白影響甲狀腺激素系統(tǒng),干擾生殖系統(tǒng)[1,8]。

魚類內(nèi)分泌系統(tǒng)通過下丘腦和垂體接受來自腦的神經(jīng)信號,并將其轉(zhuǎn)化成激素作用于腺體(性腺、甲狀腺和腎上腺等)[12]。卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG)是卵生動物雌性卵黃蛋白的前體,主要作為分子載體運輸多種營養(yǎng)物質(zhì)到卵細胞[13]。雄魚及幼魚暴露在含有類雌激素物質(zhì)水環(huán)境中,可誘導魚體產(chǎn)生VTG[14],VTG可作為鑒別環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的生物標志物[15]。促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)是維持腎上腺正常形態(tài)和功能的重要激素,并在腺垂體嗜堿細胞內(nèi)進行合成和分泌[16]。正常生理情況下,下丘腦、垂體和腎上腺3者處于相對的動態(tài)平衡中,若ACTH缺乏,將引起腎上腺皮質(zhì)萎縮、分泌功能減退和免疫功能下降[17]等。ACTH的合成與分泌也和魚類生殖活動密切相關(guān)[18]。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)屬于硬骨魚綱鲇魚目,分布于亞洲,是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類。隨著環(huán)境污染的加劇,黃顙魚野生資源數(shù)量銳減[19]。近年來許多學者對該魚進行了多項研究,包括生物學、性腺發(fā)育、消化道和腦垂體組織學[20]等,但對其內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性效應(yīng)的研究則較少。目前,關(guān)于TBBPA和TBP對黃顙魚的內(nèi)分泌干擾毒性效應(yīng)尚未得到確認。為此,筆者通過VTG和ACTH研究TBBPA和TBP對黃顙魚的內(nèi)分泌干擾毒性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試劑:TBBPA和TBP,純度w>97%,均購自百靈威試劑公司;丙酮為色譜純,購自德國Merck公司;ACTH和VTG的ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

儀器:AG-285電子天平(瑞士Mettle公司);2-16PK臺式離心機(德國Sigma公司);Avanti J-26XPI高效離心機(美國Beckman Coulter公司);UVmini-1240紫外分光光度計(日本Kyoto公司);Tecan Infinite 200酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃顙魚急性毒性試驗

供試黃顙魚由南京大學模式生物研究所提供,平均體重0.14 g,平均體長24 mm。參照文獻[21-22]的要求進行黃顙魚急性毒性試驗。先按照急性毒性試驗方法進行預(yù)試驗,得到TBBPA和TBP對黃顙魚24 h最小全死亡質(zhì)量濃度(1.6 mg·L-1)及96 h最大無死亡質(zhì)量濃度(0.08 mg·L-1)。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,確定正式試驗的6個濃度梯度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28和2.56 mg·L-1。采用丙酮作為助溶劑配制TBBPA和TBP貯備液,以曝氣24 h自來水作為試驗用水稀釋貯備液后得到受試溶液(助溶劑φ<0.01%),同時設(shè)置溶劑對照以及不含受試物和溶劑的空白對照組。每口試驗魚缸盛5 L水,投入10條魚,每個濃度設(shè)3個平行。試驗周期為96 h,觀察并記錄6～96 h受試魚的死亡率,并及時將死魚取出。試驗用水pH值為6.5～8.5,溶氧量(DO)質(zhì)量濃度為(7.5±0.5) mg·L-1,水質(zhì)硬度(以CaCO3質(zhì)量濃度計)為100～150 mg·L-1。試驗期間水溫為(23.5±0.5) ℃,每天光照16 h。試驗采用72 h更換藥液的半靜態(tài)方法,試驗過程中不喂食,不曝氣。

1.2.2 黃顙魚幼魚生長抑制毒性試驗

參照文獻[21，23]的要求進行黃顙魚幼體生長毒性試驗。黃顙魚幼魚初始體重在0.15～0.18 g之間,體長在23～25 mm之間。根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果將TBBPA和TBP的暴露濃度分別設(shè)置為0.04、0.08、0.16、0.32和0.64 mg·L-1,并設(shè)置不含受試物的溶劑對照組(SK)以及不含受試物和溶劑的空白對照組(CK),處理組助溶劑φ<0.01%。對照組設(shè)置2個平行,處理組不設(shè)平行,每缸5 L水,投入10尾魚。試驗采用72 h更換藥液的半靜態(tài)方法,確保受試物濃度在換水前后變化不超過20%。暴露周期28 d,每天定量喂食2次,試驗過程中不曝氣。試驗結(jié)束后使用麻醉劑MS 222進行麻醉,逐尾稱濕重(吸干水分)并測其體長。魚類“假定”特定生長率計算公式為

(1)

式(1)中,r為“假定”生長率,d-1;w2和w1分別為某尾魚在t2和t1時刻的體重或體長，g或mm。對于死亡率超過10%的處理組不再計算生長率。

1.2.3 VTG和ACTH的測定

暴露結(jié)束后在冰浴中解剖各濃度組存活黃顙魚,取其內(nèi)臟(除腸道外)，將內(nèi)臟樣品放入勻漿器中,低溫勻漿,4 ℃條件下以相對離心力Frc=12 000離心30 min，將上清液貯存于-80 ℃條件下備用。取上清液利用VTG和ACTH試劑盒測定VTG和ACTH含量。黃顙魚內(nèi)臟中VTG和ACTH含量數(shù)據(jù)均以魚組織質(zhì)量進行歸一化處理[24-27]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件中的概率回歸分析法計算黃顙魚急性毒性10%致死濃度(LC10)、半致死濃度(LC50)及95%置信限;黃顙魚幼體生長抑制毒性試驗中,運用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)以及概率回歸分析,確定與溶劑對照組魚類生長情況相比的無觀察效應(yīng)濃度(NOEC)和最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)及引起魚10%的生長率變化的受試物濃度(EC10)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚急性致死毒性效應(yīng)

黃顙魚暴露6 h后,1.28和2.56 mg·L-1濃度組出現(xiàn)不同程度的中毒反應(yīng),12 h后0.32和0.64 mg·L-1濃度組出現(xiàn)中毒癥狀,24 h后0.64、1.28和2.56 mg·L-1濃度組出現(xiàn)死亡魚。急性中毒癥狀主要表現(xiàn)為:活動受到抑制,出現(xiàn)肌肉痙攣,身體抽搐,急速游泳失去平衡,翻轉(zhuǎn),腹部翻上,死亡魚身體僵硬。試驗過程中,CK和SK中均未出現(xiàn)致毒致死效應(yīng)。

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果(表1)顯示,TBBPA和TBP概率單位-濃度對數(shù)方程的決定系數(shù)均不低于0.88,表明TBBPA和TBP對黃顙魚的急性致死具有顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。TBBPA對黃顙魚24、96 h的LC50及LC10均低于TBP對應(yīng)的毒性值,表明TBBPA較TBP具有更高的急性毒性。在96 h內(nèi),暴露時間越長,受試物對黃顙魚的毒性就愈加明顯,說明2種受試物對黃顙魚的毒性大小受暴露時間影響,時間越長,毒性越大。

表1 四溴雙酚A(TBBPA)和2，4，6-三溴苯酚(TBP)對黃顙魚成魚的急性毒性效應(yīng)

Table 1 Acute toxicity of TBBPA and TBP toPelteobagrusfulvidraco

物質(zhì)暴露時間/h概率-暴露濃度方程決定系數(shù)R2ρ/(mg·L-1)95%置信區(qū)間/(mg·L-1)LC10LC50LC10LC50TBBPA24y=0.208+4.418x0.88710.460.900.395～0.5190.821～0.98196y=2.644+7.985x0.94470.320.460.287～0.3490.434～0.496TBP24y=-1.204+5.351x0.90950.971.680.838～1.0771.547～1.82996y=0.650+5.550x0.91390.550.930.264～0.7330.689～1.293

y為概率值;x為暴露濃度(mg·L-1)的對數(shù)值。

2.2 黃顙魚幼體生長抑制毒性效應(yīng)

黃顙魚幼體生長抑制試驗的結(jié)果表明,TBBPA對黃顙魚體重的EC10(0.27 mg·L-1)、LOEC(0.32 mg·L-1)和NOEC(0.16 mg·L-1)都低于TBP對黃顙魚體重的EC10(0.45 mg·L-1)、LOEC(0.64 mg·L-1)和NOEC(0.32 mg·L-1)。TBBPA對黃顙魚體長的LOEC 和EC10分別為>0.32和0.29 mg·L-1,TBP對黃顙魚體長的LOEC 和EC10分別為>0.64 和0.69 mg·L-1。可見，2種受試物的體長毒性終點普遍高于體重毒性終點,表明長期的TBBPA和TBP暴露對黃顙魚體重的影響相對更加靈敏一些。綜合體長和體重的毒性測試結(jié)果可知,TBBPA和TBP對黃顙魚幼魚28 d生長抑制的NOEC分別為0.16和0.32 mg·L-1,EC10分別為0.27和0.45 mg·L-1。

暴露28 d后,TBBPA和TBP對黃顙魚“假定”特定生長率(r)的影響見圖1。從圖1可以看出,SK和CK均未出現(xiàn)意外死亡,且差異不顯著(P>0.05),表明助溶劑對整個試驗無影響。

*表示處理組與SK某指標差異顯著(P<0.05)。 0.64 mg·L-1 TBBPA處理組魚死亡率超過10%，故未計算生長率。

圖1表明,ρ(TBBPA)在0.04 mg·L-1條件下,黃顙魚體重“假定”特定生長率(r體重)增長到1.20 d-1,但與SK相比無顯著差異;隨著暴露濃度的增加,與SK相比,r體重顯著下降,0.32 mg·L-1條件下,r體重為負生長。黃顙魚暴露于TBP時,r體重的變化趨勢與TBBPA相似,基本呈現(xiàn)下降趨勢;0.04 mg·L-1條件下,黃顙魚r體重達最高值1.25 d-1,0.64 mg·L-1條件下,r體重呈現(xiàn)負生長。2種物質(zhì)對黃顙魚r體重的影響隨暴露時間的延長呈現(xiàn)一致的毒性效應(yīng)規(guī)律,高濃度時TBBPA對r體重的影響明顯高于TBP。與SK相比,處理組魚體長的“假定”特定生長率(r體長)沒有表現(xiàn)出顯著性差異,所以表2和圖1同樣說明黃顙魚體重對TBBPA和TBP的長期暴露更為敏感。

2.3 TBBPA和TBP對黃顙魚VTG與ACTH含量的影響

TBBPA對存活黃顙魚內(nèi)臟中ACTH與VTG的影響見圖2。隨著TBBPA濃度的升高,與SK和CK相比,黃顙魚內(nèi)臟中VTG含量總體呈上升趨勢;當ρ(TBBPA)為0.32 mg·L-1時,VTG含量最高,達1 205.26 mg·kg-1,與SK差異顯著。ρ(TBBPA)為0.32 mg·L-1時,內(nèi)臟中ACTH含量高達38.98 μg·kg-1;ρ(TBBPA)為0.16和0.32 mg·L-1時,內(nèi)臟中ACTH含量均與SK差異顯著。黃顙魚內(nèi)臟中VTG與ACTH含量在ρ(TBBPA)為0.04 mg·L-1時降至最低值,在0.32 mg·L-1時升到最高值。

CK—空白對照組;SK—溶劑對照組。

TBP對存活黃顙魚內(nèi)臟中ACTH以及VTG的影響結(jié)果見圖3。TBP在低濃度(0.04～0.16 mg·L-1)時,內(nèi)臟中ACTH含量與SK相比無顯著性差異;在0.64 mg·L-1條件下,ACTH含量與SK相比顯著降低。VTG含量在不同濃度TBP暴露下都未與SK表現(xiàn)出顯著性差異。

CK—空白對照組;SK—溶劑對照組。

3 討論

魚類在水生生態(tài)系統(tǒng)中處于食物鏈的頂端,當化學品進入水體后可能會在其組織臟器和脂肪中富集,從而影響其發(fā)育生長、繁殖,甚至導致死亡[12]。在內(nèi)分泌干擾物的生態(tài)風險研究中,長期低水平暴露后對生物的毒性效應(yīng)尤為重要。

筆者基于TBBPA和TBP對黃顙魚的急性毒性測試結(jié)果,重點考察了其對黃顙魚幼魚生長的長期毒性。在生長發(fā)育方面,低濃度TBBPA(0.32 mg·L-1)和TBP(0.64 mg·L-1)28 d暴露可顯著抑制黃顙魚幼魚體重增長,更高濃度TBBPA(0.64 mg·L-1)28 d暴露甚至引起幼魚死亡。這與TBBPA低劑量暴露引起斑馬魚肌肉損傷[10]和肝損傷[11],TBP長期暴露干擾斑馬魚類固醇合成進而影響生長發(fā)育的結(jié)果[28]一致。在分子生物標志物方面,在低濃度TBBPA(0.16～0.32 mg·L-1)的長期作用下,TBBPA可顯著誘導黃顙魚內(nèi)臟中VTG和ACTH生成,而0.64 mg·L-1TBP僅表現(xiàn)出對ACTH的顯著抑制。這表明TBBPA和TBP都對黃顙魚內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生影響,但作用路徑可能不同。已有的細胞離體試驗也已檢測出TBBPA和TBP對內(nèi)分泌作用通路上關(guān)鍵基因和肝臟雌激素代謝酶表達具有顯著影響[6-8,28-30],該研究則從活體試驗水平上證實了TBBPA和TBP的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。

ACTH屬于腺垂體分泌的微量多肽激素,是由魚的垂體前葉嗜堿細胞合成分泌,受下丘腦組皮質(zhì)素釋放激素(CRH)的調(diào)節(jié)[31],在應(yīng)激狀態(tài)下可能會激活自身的“下丘腦-垂體-腎上腺軸”(HPA axis),導致皮質(zhì)醇的分泌量增大,機體內(nèi)的皮質(zhì)醇含量可能上升[32]。VTG是與魚類“下丘腦-垂體-性腺軸”激素調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白,通常只有成熟雌魚可產(chǎn)生足夠雌二醇誘導VTG合成,從而為卵子發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。由于雄性黃顙魚體內(nèi)的內(nèi)源性雌激素水平較低,因此,雄魚體內(nèi)VTG含量和魚類ACTH變化能夠直接反映外源性雌激素物質(zhì)對HPG軸和HPA軸的干擾作用[12],是研究環(huán)境雌激素的重要生物標志物。筆者對TBBPA低劑量長期暴露下黃顙魚幼體內(nèi)ACTH和VTG顯著變化與陳瑪麗[10]和瞿璟琰等[33]的研究結(jié)果較為一致。但HALDéN等[1]在TBP同樣方法暴露6周的雌性斑馬魚肝臟中測到VTG含量顯著升高,推測這可能是由于TBP相對較弱的HPG軸干擾性難以引起VTG本底含量較低的雄魚中內(nèi)臟VTG含量顯著變化,或者雄魚VTG本底含量低而導致這一變化的相對誤差較大,從而產(chǎn)生假陰性測試結(jié)果。因此,以VTG作為魚類內(nèi)分泌干擾標志物時,應(yīng)綜合考慮外源性物質(zhì)對雄魚和雌魚的影響,特別是對于內(nèi)分泌干擾性相對較弱的化合物。

4 結(jié)論

TBBPA和TBP對黃顙魚幼魚急性毒性較高,其96 h的LC50分別為0.46和0.93 mg·L-1。在經(jīng)過TBBPA和TBP 28 d的長期暴露后,在0.04～0.64 mg·L-1條件下,黃顙魚r體重和受試物濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系;TBBPA對黃顙魚r體重的LOEC和NOEC分別為0.32和0.16 mg·L-1,TBP對r體重的LOEC和NOEC分別為0.64和0.32 mg·L-1。相較于體長的增長,黃顙魚體重增長的毒性指標更為敏感。急慢性試驗結(jié)果證實,TBBPA較其降解產(chǎn)物TBP具有更高的毒性。TBBPA暴露導致黃顙魚內(nèi)臟中ACTH與VTG含量呈上升趨勢,而TBP只在0.64 mg·L-1時對ACTH含量有影響。研究表明,TBBPA和TBP是潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,筆者尚未深入研究其內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的作用機理,還需從毒性作用方面開展進一步的研究。

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(責任編輯： 許 素)

Endocrine Disrupting Effects of TBBPA and TBP on Pelteobagrus fulvidraco.

ZHANG Sheng-xin1,2, LIU Ji-ning2, WANG Lei2, YANG Xian-hai2, SHI Li-li1,2, LIU Dan2

(1.School of Environmental Science and Engineering， Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China; 2.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)

Based on an acute toxicity test on fish, an experiment was conducted on toxicity of tetrabromobisphenol A (TBBPA) and its degradation product of 2,4,6-tribromophenol (TBP) to growing youngPelteobagrusfulvidraco, especially their endocrine-disrupting effects. During the experiment, growth rate of the juveniles was measured and the minimum observable response concentration (MORC) and unobservable response concentration (URC) of TBBPA and TBP in the juveniles exposed to the chemicals for 28 days. Contents of vitellogenin (VTG) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) content in viscera of the fish were also measured using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits for significant difference analysis. Results show that concentrations of TBBPA and TBP and growth rate of the fish in weight displayed an obvious does-effect relationship with MORC and URC of TBBPA being 0.32 and 0.16 mg·L-1and MORC and URC of TBP being 0.64 and 0.32 mg·L-1, respectively, which indicates that TBBPA was more toxic than TBP. With rising TBBPA concentration, VTG and ACTH in the fish significantly increased in content, but VTG did not show any significant response to change in concentration of TBP and ACTH declined by a large margin in content when TBP reached 0.64 mg·L-1in concentration. It is, therefore, presumed that TBBPA and TBP are potential environmental endocrine disruptors.

tetrabromobisphenol A (TBBPA); 2,4,6-tribromophenol (TBP); adrenocorticotropic hormone (ACTH); vitellogenin (VTG);Pelteobagrusfulvidraco; endocrine disrupting

2016-03-21

江蘇省自然科學基金(BK20151100)；普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃(KYLX15_0798)

X592

A

1673-4831(2016)06-1012-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2016.06.023

張圣新(1992—),女,江蘇鎮(zhèn)江人,碩士生,主要從事化學品生態(tài)毒理學研究。E-mail: 15195811701@163.com

① 通信作者E-mail: wanglei@nies.org