劉海珍, 鄒小艷, 郭松長, 李雙, 張湑澤, 馬建濱*, 都玉蓉*

(1.青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青藏高原環(huán)境與資源教育部重點實驗室，西寧810008；2.中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進化重點實驗室，西寧810007；3.青海民族大學(xué)，西寧810001)

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鹵蟲(AC)n和(AG)n微衛(wèi)星文庫構(gòu)建

劉海珍1, 鄒小艷2, 郭松長2, 李雙1, 張湑澤3, 馬建濱1*, 都玉蓉1*

(1.青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青藏高原環(huán)境與資源教育部重點實驗室，西寧810008；2.中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進化重點實驗室，西寧810007；3.青海民族大學(xué)，西寧810001)

鹵蟲Artemia作為重要的基礎(chǔ)實驗材料和經(jīng)濟動物資源，其微衛(wèi)星位點具有重要的研究和應(yīng)用價值。本研究使用磁珠富集法，成功構(gòu)建了鹵蟲的(AC)n和(AG)n微衛(wèi)星富集文庫。通過對文庫進行PCR方法鑒定和測序確認，所構(gòu)建的(AC)n和(AG)n文庫陽性克隆率分別為55.8%和34.5%。依據(jù)得到的微衛(wèi)星序列，設(shè)計并合成了63對微衛(wèi)星引物，隨機以2個地理單元(青海、西藏)共18個鹵蟲基因組DNA為擴增模板，篩選出6對具有多態(tài)性的鹵蟲微衛(wèi)星引物。本研究篩選出的微衛(wèi)星多態(tài)位點可用于鹵蟲種群的遺傳多樣性評估、遺傳圖譜的構(gòu)建和數(shù)量性狀定位等后續(xù)工作。

鹵蟲；微衛(wèi)星；富集文庫

鹵蟲屬Artemia隸屬于甲殼綱Crustasea腮足亞綱Branchiopoda無甲目Anostacea鹵蟲科Arteidae，是一種適應(yīng)性極強的小型甲殼動物，廣泛分布于全世界內(nèi)陸鹽湖/咸水湖及沿海鹽場等高鹽水域中。鹵蟲和鹵蟲卵具有極高的營養(yǎng)價值，是水產(chǎn)動物苗種生產(chǎn)中十分重要的生物餌料，由于價格昂貴，素有“軟黃金”之稱。青藏高原地區(qū)內(nèi)陸鹽湖/咸水湖棋布，蘊含著豐富的鹵蟲資源，也被鄭綿平院士認為是鹵蟲生存的重要遠景區(qū)(鄭綿平，2001)。據(jù)已公開發(fā)表文獻，青藏高原上有鹵蟲分布的鹽湖多達20個以上(馬志珍，1993；鄭綿平，1995；馬志珍等, 1996;印象初等，2001)，如尕海鹽湖、拉果錯鹽湖等；而調(diào)查顯示，僅藏北地區(qū)有鹵蟲繁衍的鹽湖就多達34個(http：//www.cags.ac.cn/top/lab/05.htm)。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)、短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats, STR)，是廣泛分布于真核生物基因組中，以2～6個堿基為核心重復(fù)單元組成的DNA序列。與其他分子標記相比，微衛(wèi)星標記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于保護生物學(xué)和遺傳育種等領(lǐng)域。

青藏高原是鹵蟲資源較為豐富的地區(qū)。但近年來，肆意捕撈造成鹵蟲資源量銳減，因而有必要對青藏高原地區(qū)尤其是鹵蟲主產(chǎn)鹽湖中鹵蟲的遺傳多樣性和遺傳分化狀況進行評估，為該地區(qū)鹵蟲資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)?；诖耍狙芯坎捎么胖楦患?，即FIASCO(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)法(Zaneetal.，2002)構(gòu)建了鹵蟲的(AC)n和(AG)n微衛(wèi)星富集文庫并進行微衛(wèi)星位點的引物篩選，以期為青藏高原鹵蟲資源的遺傳多樣性評估、種質(zhì)資源保護和遺傳選育提供分子標記工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

主要試劑包括：AFLP接頭序列Oligo A和Oligo B，AFLP接頭受體特異引物Oligo Mse Ⅰ，MseⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB)，PCR@2.1載體，磁珠Dynal。

本試驗合成使用的DNA序列主要有：生物素標記的探針：5’-Biotin-(AG)12-3’；5’-Biotin-(AC)12-3’；未經(jīng)生物素標記的探針：5’-(AG)12-3’；5’-(AC)12-3’；Oligo A、Oligo B和Oligo Mse Ⅰ的序列：Oligo A，5’-TACTCAGGACTCAT-3’；Oligo B，5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；Oligo Mse Ⅰ，5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’；M13引物：上游引物，5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’；下游引物，5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。上述DNA序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 實驗樣品信息表

1.2 基因組DNA提取

選取不同湖泊的鹵蟲提取基因組DNA(表1)。單只鹵蟲洗凈后剪碎，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，總DNA提取參照《分子克隆實驗指南》(Sambrook & Russell，2001)并略作改動。DNA溶液以紫外分光光度計進行濃度與純度測定，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建

參照FIASCO法構(gòu)建(AC)n和(AG)n富集文庫(Zaneetal.，2002)。取4個鹵蟲基因組DNA等量混合，按照MseⅠ內(nèi)切酶使用說明構(gòu)建20 μL酶切體系以獲得酶切產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的酶切產(chǎn)物與Oligo A、Oligo B形成的接頭在T4連接酶作用下，于16 ℃水浴中連接5 h或4.0 ℃過夜連接。對連接成功的產(chǎn)物以O(shè)ligo Mse Ⅰ為引物進行PCR并回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物與生物素標記的微衛(wèi)星探針進行2輪雜交，第一輪雜交溫度為60 ℃，第二輪雜交溫度為62 ℃，以提高單鏈微衛(wèi)星DNA片段的富集效率。富集的單鏈DNA經(jīng)PCR擴增恢復(fù)為雙鏈并純化后，將其連接到PCR@2.1載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細胞中，采用藍白斑實驗篩選陽性克隆。

1.4 陽性克隆篩選和測序

挑取白色菌落擴大培養(yǎng)，并以M13 引物和未經(jīng)生物素標記的探針序列作為混合引物進行菌落PCR，PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，篩選含有2條或2條以上亮帶的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司，以M13引物進行雙向測序。

1.5 序列校對與引物設(shè)計

測序結(jié)果經(jīng)DNAstar(DNAStar Inc.，USA)去除載體序列后，以SSRHunter(李強，萬建民，2005)篩選出重復(fù)次數(shù)大于5的序列，采用Primer Premier 5.0(Premier Biosoft，USA)設(shè)計引物并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳顯示，提取的鹵蟲基因組DNA無明顯降解，且分子量大，條帶較整齊(圖1)，可用于后續(xù)實驗?；蚪MDNA經(jīng)酶切、連接接頭、探針雜交后，對雜交片段進行PCR擴增(圖2)，圖2顯示富集成功。然后將富集產(chǎn)物連接到PCR@2.1載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)過藍白斑篩選，對白斑進行PCR鑒定，如PCR產(chǎn)物顯示出2條以上的電泳條帶產(chǎn)物(圖3)，即表明該菌落為陽性克隆，其中，1、4、5、6、8、9、12條帶均擴增出2條DNA產(chǎn)物，初步表明成功構(gòu)建了青藏高原鹵蟲的(AC)n和(AG)n微衛(wèi)星富集文庫。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA

M.DNA marker, 1～10.基因組DNA。

M.DNA marker, 1～10.Genomic DNA.

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測富集片段PCR產(chǎn)物

M.DNA marker, 1.富集片段PCR產(chǎn)物。

M.DNA marker, 1.PCR products of putative microsatellite-containing DNA fragments.

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測菌落PCR

M.DNA marker, 1～12.菌落PCR產(chǎn)物。

M.DNA marker, 1～12.PCR products of monoclone.

2.2 陽性克隆的測序與引物設(shè)計

分別從(AC)n、(AG)n文庫中挑取120個和200個白斑菌落進行菌落PCR，分別得到80和120個可能含有微衛(wèi)星序列的陽性克隆。對上述陽性克隆進行測序，在(AC)n和(AG)n文庫中各獲得67條和69條含有微衛(wèi)星的序列，陽性率分別為55.8%和34.5%。圖4為含AC和AG重復(fù)序列的代表性克隆的測序結(jié)果。根據(jù)Weber(1990)提出的標準，微衛(wèi)星的重復(fù)類型可分為單一型、間斷型和復(fù)合型。本研究構(gòu)建的2個微衛(wèi)星文庫各類型微衛(wèi)星數(shù)目與比例如下：(AC)n文庫中，單一型25個，占37.3%；間斷型36個，占53.7%；復(fù)合型6個，占9.0%；(AG)n文庫中，單一型54個，占78.3%；間斷型12個，占17.4%；復(fù)合型3個，占4.3%。部分微衛(wèi)星位點的類型、核心序列與側(cè)翼序列如表2所示。

表2 鹵蟲部分微衛(wèi)星位點的類型、核心序列及其側(cè)翼序列

注： “…”表示間隔≥3堿基; 下表同。

Note： “…” represents an interval with 3 or more nucleotides; the same below.

在上述序列中，舍棄因側(cè)翼序列過短不宜設(shè)計引物以及引物評分過低的微衛(wèi)星位點，共設(shè)計并合成63對微衛(wèi)星引物。各引物經(jīng)溫度梯度PCR確定最適退火溫度后，隨機以不同采集地鹵蟲的基因組DNA為模板進行PCR擴增，篩選出6對多態(tài)引物，引物信息見表3。位點L050和L051的擴增產(chǎn)物電泳圖譜見圖5。

表3 6個多態(tài)微衛(wèi)星位點的引物信息

圖4 含有鹵蟲微衛(wèi)星序列的陽性克隆

A.AC重復(fù)序列, B.AG重復(fù)序列。

A.AC repeats, B.AG repeats.

圖5 2個微衛(wèi)星位點的擴增產(chǎn)物多態(tài)性檢測

A.位點L050, B.位點L051。

A.Locus L050, B.Locus L051.

3 討論

青藏高原鹵蟲資源豐富，但其遺傳多樣性研究較為滯后。微衛(wèi)星是評估遺傳多樣性常用的分子標記，本研究采用FIASCO法進行鹵蟲(AC)n和(AG)n探針微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建與鑒定，以期為評估鹵蟲的遺傳多樣性、資源保護與選育提供理想標記。

微衛(wèi)星標記是一種應(yīng)用廣泛的分子標記，但開發(fā)具有高效多態(tài)性的微衛(wèi)星引物是一件耗時繁瑣的工作。采用傳統(tǒng)的微衛(wèi)星分離方法時，陽性克隆率很低，一般在0.04%～12%，效果較差；使用FIASCO法構(gòu)建巖原鯉Procypisrabaudi的微衛(wèi)星富集文庫，(AC)n文庫的陽性克隆率為7%，(GATA)n陽性克隆率為30%(袁慧等，2008)，效果欠佳。因此，有必要選擇一種高效的微衛(wèi)星分離方法。本研究參照FIASCO法構(gòu)建了青藏高原鹵蟲(AC)n、(AG)n富集文庫，稍作改動的部分是進行了2次雜交和2次富集，且第二次雜交溫度比第一次高2 ℃，從而大大提高了陽性克隆率。經(jīng)載體連接和克隆轉(zhuǎn)化，本實驗獲得了較高的陽性克隆率，分別為55.8%和34.5%，也在一定程度說明鹵蟲的基因組中兩堿基的微衛(wèi)星重復(fù)序列較豐富。與構(gòu)建的藏羚羊Pantholopshodgsoni微衛(wèi)星富集文庫相比(都玉蓉等，2014)，本實驗陽性克隆率相對較高，這可能與鹵蟲基因組中(AC)n和(AG)n微衛(wèi)星的分布頻度有關(guān)，也可能緣于實驗操作者的熟練程度、操作技能所造成磁珠富集、洗脫效率的差異，進而影響陽性克隆率(Carletonetal.，2002)。

本研究構(gòu)建了鹵蟲的(AC)n和(AG)n微衛(wèi)星富集文庫，但僅選取部分菌落進行測序與后續(xù)引物設(shè)計、擴增驗證及多態(tài)檢測，獲得的6對鹵蟲微衛(wèi)星引物對鹵蟲后續(xù)的遺傳多樣性、遺傳分化評估及鹵蟲的遺傳選育研究具有一定促進作用。

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Construction of (AC)nand (AG)nMicrosatellite DNA Libraries in Brine ShrimpArtemia

LIU Haizhen1, ZOU Xiaoyan2, GUO Songchang2, LI Shuang1, ZHANG Xuze3, MA Jianbin1*, DU Yurong1*

(1.School of Life and Geography Sciences, Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Environment and Resources, Ministry of Education,Qinghai Normal University, Xining 810008, China; 2.Key Laboratory of Evolution and Adaptation of Plateau Biota,Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810007, China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering, Qinghai University for Nationalities, Xining 810001, China)

Brine shrimpArtemiais an important model organism and economic animal resource.The microsatellite loci of this species have a significant research and application value.In this study, theArtemiamicrosatellite enriched DNA libraries of (AC)nand (AG)nwere conducted successfully using the method of FIASCO (fast isolation by AFLP sequence containing repeats).In the (AC)nlibrary, 67 colonies (total no.120) were picked out and sequenced, with a positive clone rate of 55.8%.In the (AG)nlibrary, 69 colonies out of 200 colonies were sequenced, with a positive clone rate of 34.5%.Among all the sequences containing microsatellites, 63 pairs of primers were designed and synthesized for further primer screening.By using 18ArtemiaDNA samples from Qinghai and Tibetan, 6 pairs of primers with polymorphic microsatellite loci ofArtemiawere identified.These polymorphic loci may facilitate further study on the detection of genetic diversity, genetic linkage mapping and the location of quantitative traits ofArtemia.

Artemia; microsatellite; enriched library

2015-10-13 接受日期：2016-03-24 基金項目：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2013-Z-750; 2013-Z-751)

劉海珍(1989—), 女, 碩士研究生

*通信作者Corresponding author，E-mail：mjb_117@163.com; xndyr@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20150317

Q959.223; Q78

A

1000-7083(2016)03-0356-05