DNA條形碼及其在生物多樣性研究中的應(yīng)用

陳煉， 吳琳， 王啟菲， 吳軍， 劉燕， 丁暉， 徐海根*

(1. 江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，南京210013； 2. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京210042)

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DNA條形碼及其在生物多樣性研究中的應(yīng)用

陳煉1， 吳琳1， 王啟菲1， 吳軍2， 劉燕2， 丁暉2， 徐海根2*

(1. 江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，南京210013； 2. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京210042)

DNA條形碼是利用生物體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的技術(shù)。自2003年DNA條形碼相關(guān)概念提出以來廣受關(guān)注，國(guó)內(nèi)外相繼開展了DNA條形碼及信息系統(tǒng)建設(shè)研究，為DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)和生物信息學(xué)分析平臺(tái)。DNA條形碼技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)的不足，為生物多樣性研究提供了新的思路和方法。本文介紹了DNA條形碼的產(chǎn)生與發(fā)展過程，國(guó)內(nèi)外DNA條形碼技術(shù)與信息系統(tǒng)建設(shè)研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定、瀕危物種保護(hù)、隱存種發(fā)現(xiàn)、生物多樣性評(píng)估等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。最后結(jié)合DNA條形碼技術(shù)目前存在的問題，對(duì)其在相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

DNA條形碼；生物多樣性；分類學(xué)；物種鑒定

DNA條形碼是利用生物體內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的技術(shù)(Hebertetal.,2003a)。該技術(shù)極大地增強(qiáng)了人類監(jiān)測(cè)、了解和利用生物多樣性資源的能力，其在生命科學(xué)、法醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)，以及醫(yī)藥、食品質(zhì)量控制等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用前景。DNA條形碼技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)的不足，為生物多樣性研究提供了新的思路和方法。本文圍繞DNA條形碼的產(chǎn)生與發(fā)展及其在生物多樣性研究中的應(yīng)用展開論述。

1 DNA條形碼的產(chǎn)生與發(fā)展

1.1 DNA條形碼的定義

生物學(xué)研究以準(zhǔn)確的物種鑒定為基礎(chǔ)，在樣品保存良好的前提下，傳統(tǒng)分類學(xué)家依靠已有的理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)對(duì)物種進(jìn)行鑒定。隨著人們對(duì)物種鑒定要求的逐步提高，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定已不能滿足相關(guān)需要，并且傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定具有一定的局限性，例如：容易忽略類群中普遍存在的隱存分類單元，用作鑒定的特征可能存在表型可塑性及遺傳可變性，這些都會(huì)導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤(Hebertetal.,2003a)。而隨著傳統(tǒng)分類學(xué)專家隊(duì)伍的縮減，能否準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行物種鑒定成為分類學(xué)必須突破的瓶頸。

Hebert等(2003b)對(duì)動(dòng)物界包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物共11門13 320種的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome coxidase Ⅰ，COⅠ)基因序列進(jìn)行比較分析。除刺胞動(dòng)物Cnidaria外，98%的物種種內(nèi)遺傳距離差異小于1%，很少超過2%，而種間平均遺傳距離差異可達(dá)到11.3%。Hebert等(2003a)應(yīng)用線粒體COⅠ基因序列鑒定了鱗翅目Lepidoptera 200個(gè)近似物種，并提出將線粒體COⅠ基因序列作為全球動(dòng)物鑒定系統(tǒng)的核心標(biāo)記基因片段。

同傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比，DNA條形碼技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)不受物種發(fā)育階段的影響：以物種DNA序列為檢測(cè)對(duì)象，同種生物在不同生長(zhǎng)時(shí)期的DNA序列信息一致；(2)操作簡(jiǎn)單：該技術(shù)對(duì)研究人員的分類知識(shí)與經(jīng)驗(yàn)要求不高，經(jīng)過簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可操作，不需要依賴分類學(xué)專家；(3)準(zhǔn)確性高：每個(gè)物種都具有特定的DNA序列信息，利用現(xiàn)有的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，可鑒別出全球范圍內(nèi)已收錄的所有物種；(4)能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定所不易發(fā)現(xiàn)的新種或隱存種(Smithetal.,2006)。目前，DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成為生物分類和物種鑒定強(qiáng)有力的工具，在生物多樣性保護(hù)中得到了廣泛的應(yīng)用(Janzenetal.,2009)。

DNA條形碼技術(shù)雖然發(fā)展前景廣闊，但對(duì)于保存年代久遠(yuǎn)的博物館館藏標(biāo)本，要獲得其標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼序列比較困難，因其DNA大多已降解。DNA微型條形碼(DNA minibarcode)是指長(zhǎng)度為100～200 bp的DNA序列(Meusnieretal.,2008)，而對(duì)于已降解的標(biāo)本，200 bp左右的序列也可以用于擴(kuò)增。如Hajibabaei等(2006b)的研究表明約130 bp的DNA微型條形碼可以有效地被應(yīng)用于蛾類干制標(biāo)本的鑒定。Meusnier等(2008)設(shè)計(jì)了1對(duì)通用引物Uni MinibarF1/Uni MinibarR1用于擴(kuò)增COⅠ基因的一段130 bp的片段，在1 866個(gè)樣本中(包括哺乳類、魚類、鳥類和兩棲類的691種共1 566個(gè)樣本和植物、真菌、藻類的300個(gè)樣本)的擴(kuò)增成功率高達(dá)92%。

1.2 DNA條形碼的候選基因

動(dòng)物DNA條形碼研究通常選擇線粒體COⅠ基因?yàn)楹蜻x基因，它是一段長(zhǎng)度約為650 bp的基因片段，具有長(zhǎng)度適宜、進(jìn)化速率適中等特點(diǎn)，序列的種間差異能較好地區(qū)分物種。研究表明，利用COⅠ基因序列能夠?qū)Ρ泵栏缢惯_(dá)黎加地區(qū)1 000多種熱帶鱗翅目昆蟲進(jìn)行有效的區(qū)分(Hajibabaeietal.,2006a)；利用線粒體COⅠ基因序列對(duì)澳大利亞207種海洋魚類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)COⅠ基因在魚類鑒定中具有良好的通用性，能夠?qū)︳~類進(jìn)行有效的物種鑒定(Wardetal.,2005)；在兩棲類的條形碼研究中，16S rRNA基因和COⅠ基因(Vencesetal.,2005a，2005b)曾被提出作為適用于兩棲類的條形碼基因。同COⅠ基因相比，16S rRNA基因高度保守。盡管16S rRNA基因有時(shí)也作為兩棲類的條形碼標(biāo)記，但在鑒定物種方面沒有COⅠ基因有效。Xia等(2012)利用COⅠ基因和16S rRNA基因鑒定來自小鯢科Hynobiidae的54種130個(gè)個(gè)體。盡管16S rRNA序列的擴(kuò)增成功率高于COⅠ基因，但由于其進(jìn)化速率太慢，不能提供足夠的信息從而更有效地鑒定山溪鯢屬Batrachuperus、擬小鯢屬Pseudohynobius和小鯢屬Hynobius的部分物種。Che等(2012)重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化了2對(duì)COⅠ通用兼并引物，在中國(guó)兩棲類的11科36屬82種111個(gè)個(gè)體中進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)新設(shè)計(jì)的2對(duì)引物能夠較廣泛地用于兩棲類DNA條形碼研究。Nagy等(2012)重新設(shè)計(jì)了RepCOⅠ-F/RepCOⅠ-R引物，對(duì)馬達(dá)加斯加地區(qū)的468種爬行類的擴(kuò)增成功率高達(dá)84.6%，可大規(guī)模地應(yīng)用于爬行類的DNA條形碼研究。

植物的DNA條形碼研究一般采取的候選基因有matK、rbcL、trnH-psbA、ITS序列。matK基因具有進(jìn)化速率快、長(zhǎng)度適中、種間差異度較高和堿基轉(zhuǎn)換/顛換頻率較低等特點(diǎn)。rbcL基因易于擴(kuò)增，但進(jìn)化速率較慢，物種間水平變異較小(CBOL Plant Working Group，2009)。trnH-psbA基因長(zhǎng)度適宜，進(jìn)化速率快，且該片段的引物通用性好、擴(kuò)增成功率高，對(duì)蘭科Orchidaceae植物的識(shí)別率高達(dá)90%(Shawetal.,2005； Lahayeetal.,2008)。Kress和Erickson(2007)提出了rbcL+trnH-psbA基因組合片段的建議，以提高物種鑒別率，結(jié)果表明僅采用rbcL基因中的一小段rbcL-a基因在種水平上的識(shí)別率為76.3%，trnH-psbA基因的識(shí)別率為83%，而將二者結(jié)合識(shí)別率高達(dá)95%。復(fù)合序列相較單個(gè)序列具有更高的適用性和鑒別力，因此受到研究者的廣泛關(guān)注。在2007年9月舉行的第二次國(guó)際生命條形碼大會(huì)上，與會(huì)者提出通過擴(kuò)增多種片段組合來彌補(bǔ)單位點(diǎn)序列的不足。Lahaye等(2008)單獨(dú)使用matK基因或結(jié)合trnH-psbA基因作為條形碼對(duì)1 600多種植物的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，識(shí)別物種成功率高達(dá)90%以上。CBOL Plant Working Group(2009)對(duì)7種最常用的單個(gè)基因序列進(jìn)行綜合評(píng)估，以matK+rbcL基因組合作為植物通用條形碼復(fù)合序列，對(duì)397個(gè)不同科屬的樣本進(jìn)行鑒定，成功率達(dá)到72%。Nithaniyal等(2014)使用rbcL和matK基因作為DNA條形碼，研究了印度熱帶干旱常綠闊葉林地區(qū)114個(gè)屬的樹葉，發(fā)現(xiàn)rbcL+matK組合對(duì)物種的識(shí)別率可高達(dá)98%以上。目前植物DNA條形碼中rbcL、matK和ITS為核心條形碼(CBOL Plant Working Group，2009；China Plant BOL Groupetal.,2011)，trnH-psbA為補(bǔ)充條形碼(Pangetal.,2012)。近年來，也有學(xué)者提出將葉綠體全基因組作為“超級(jí)條形碼”(super-barcode)應(yīng)用于植物物種鑒定(Kane & Cronk，2008)。同傳統(tǒng)的DNA條形碼(序列長(zhǎng)度一般為300～700 bp)相比，葉綠體基因組全序列長(zhǎng)達(dá)110～160 kb，包含足夠的變異信息以達(dá)到種下等級(jí)分辨率的優(yōu)勢(shì)，具有更高的分辨率和準(zhǔn)確度(Kaneetal.,2012；楊慧潔等，2014)。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，已有越來越多植物葉綠體全基因組序列的報(bào)道(Lietal.,2015；Curcietal.,2016)。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)也開始應(yīng)用于植物葉綠體基因組測(cè)序中(Lietal.,2014)?；谌~綠體基因組序列的“超級(jí)條形碼”進(jìn)行物種鑒定將受到越來越廣泛的關(guān)注。

微生物DNA條形碼研究中，主要采用ITS基因作為真菌候選基因。國(guó)際真菌DNA條形碼工作組通過對(duì)多個(gè)基因序列進(jìn)行篩選評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)了ITS序列可使真菌物種的分辨率達(dá)到72%，是目前真菌物種分辨率最高的單一DNA片段(張宇，郭良棟，2012)。ITS序列是核糖體中的一段DNA片段，包括ITS1、ITS2和5.8S 3個(gè)常用的DNA序列片段，在真菌和可進(jìn)行光合作用的真核生物中廣泛存在，具有很高的種間差異性。ITS的優(yōu)點(diǎn)在于片段長(zhǎng)度適宜、引物通用性強(qiáng)、便于擴(kuò)增(Seifert，2009)。2011年，第四屆國(guó)際生命條形碼大會(huì)建議將ITS基因作為真菌DNA條形碼的首選。而細(xì)菌一般采用擴(kuò)增16S rRNA基因，該基因具有更易擴(kuò)增的特點(diǎn)，在原生生物中表現(xiàn)尤為明顯(Migliettaetal.,2009)。

1.3 DNA條形碼的發(fā)展

1.3.1 DNA條形碼相關(guān)的項(xiàng)目和網(wǎng)站 DNA條形碼概念自2003年由加拿大生物學(xué)家Hebert提出以來發(fā)展迅速，許多國(guó)家和組織建立了項(xiàng)目和網(wǎng)站(表1)。2003年3月，分子生物學(xué)家、生物信息學(xué)家以及分類學(xué)家們?cè)诿绹?guó)召開了“DNA與分類學(xué)”主題研討會(huì),Hebert等提出對(duì)全球所有物種的某個(gè)基因進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，實(shí)現(xiàn)物種鑒定。同年9月，在“以分類學(xué)DNA與生命條形碼”為主題的研討會(huì)上，提出了國(guó)際生命條形碼計(jì)劃(International Barcode of Life，iBOL)。iBOL旨在擴(kuò)大生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(Barcode of Life Database，BOLD)中條形碼的地理分布和物種分類信息，同時(shí)存儲(chǔ)已生成的條形碼，提供條形碼所代表的信息并確保全球可以共享這些信息。2004年，美國(guó)科學(xué)家Schindel和Miller發(fā)起并成立了生命條形碼協(xié)會(huì)(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)，并與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立合作關(guān)系，二者將標(biāo)準(zhǔn)的條形碼序列和相關(guān)信息存檔在GenBank中。2009年，國(guó)際生命條形碼計(jì)劃啟動(dòng)，來自50多個(gè)國(guó)家近200多個(gè)組織加入并同意把他們的條形碼數(shù)據(jù)公布在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.3.2 國(guó)際DNA條形碼研究 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)不僅是存儲(chǔ)樣品信息和DNA條形碼序列的工具，也是DNA條形碼研究和物種鑒定分析的生物信息學(xué)平臺(tái)，對(duì)促進(jìn)和推動(dòng)DNA條形碼研究發(fā)展具有重要意義。2007年5月10日，世界上第一個(gè)DNA barcoding鑒定中心——安大略生物多樣性研究所(Biodiversity Institute of Ontario)在加拿大圭爾夫大學(xué)成立。第一個(gè)國(guó)際DNA條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)由CBOL于2007年建立。該系統(tǒng)是生命條形碼領(lǐng)域最全面和最有效的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，主要功能包括收集、保存、分析和利用世界范圍內(nèi)產(chǎn)生的DNA條形碼數(shù)據(jù)。迄今為止已經(jīng)有252 961個(gè)物種，5 002 427條DNA條形碼序列(2016年6月)的相關(guān)記錄。BOLD中不但收集DNA條形碼序列數(shù)據(jù)，還規(guī)范了有關(guān)物種分類、樣品采集、標(biāo)本保存、標(biāo)本圖片和測(cè)序質(zhì)量文件等要求。iBOL得到很多國(guó)家和地區(qū)的支持，共建立了3種不同類型的節(jié)點(diǎn)，包括國(guó)家、地區(qū)和中心節(jié)點(diǎn)。亞太地區(qū)共7個(gè)國(guó)家參與構(gòu)建(中國(guó)、澳大利亞、印度、韓國(guó)、俄羅斯、新西蘭和巴布亞新幾內(nèi)亞)，其中，中國(guó)為中心節(jié)點(diǎn)；俄羅斯為地區(qū)節(jié)點(diǎn)；巴布亞新幾內(nèi)亞為國(guó)家節(jié)點(diǎn)。2010年1月在日本名古屋召開的《生物多樣性公約》第十次締約方會(huì)議(The 10th Conference of the Parties to the Convention on Biological Diversity，CBD-COP10)上，iBOL與CBD正式締結(jié)合作關(guān)系。全球分類計(jì)劃(Global Taxonomic Initiative，GTI)提出將DNA條形碼作為一項(xiàng)完善分類學(xué)的工具(http：//www.cbd.int/decision/cop/?id=12305)。此外，國(guó)際上還有多個(gè)針對(duì)特定動(dòng)物類群的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，例如：哺乳動(dòng)物生命條形碼行動(dòng)(Mammalia Barcode of Life Campaign；http：//www.mammali-abol.org)，該行動(dòng)旨在構(gòu)建一個(gè)面向全球哺乳動(dòng)物的綜合性DNA參考文庫(kù)；鱗翅目生命條形碼(Lepidoptera Barcode of Life；http：//lepbarcoding.org)旨在構(gòu)建全部蚜蟲和蝶類物種的COⅠ條形碼文庫(kù)；魚類生命條形碼行動(dòng)(Fish Barcode of Life Campaign；http：//www.fishbol.org)旨在收集30 000種以上世界范圍內(nèi)魚類的條形碼，且每個(gè)物種至少包括5個(gè)標(biāo)本；歐盟檢疫性有害生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)Q-bankife，是由荷蘭植病專家Peter Bonants發(fā)起并聯(lián)合歐盟成員國(guó)科研人員，針對(duì)歐盟檢疫性有害生物建立的DNA條形碼信息系統(tǒng)，能對(duì)昆蟲、入侵植物、細(xì)菌、真菌等有害生物進(jìn)行檢疫。

1.3.3 我國(guó)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)與項(xiàng)目研究 中國(guó)生命條形碼信息管理系統(tǒng)由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所自主開發(fā)，迄今收錄了47 914個(gè)樣本，總計(jì)55 225條序列。該系統(tǒng)收錄來源于BOLD的所有公開數(shù)據(jù)，可以便捷地獲取來源于BOLD的公開數(shù)據(jù)，并管理自己的DNA條形碼數(shù)據(jù)，為DNA條形碼數(shù)據(jù)在世界范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)共享做出了貢獻(xiàn)(陳巖等，2014)。中國(guó)檢疫性有害生物DNA條形碼信息系統(tǒng)于2012年正式對(duì)外開放，由憑證標(biāo)本庫(kù)、數(shù)字標(biāo)本庫(kù)和DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)組成。DNA條形碼系統(tǒng)架構(gòu)在Linux+TomcaLinux+Tomcat+PostgreSQL的平臺(tái)上，平臺(tái)服務(wù)器的操作系統(tǒng)是Linux，網(wǎng)站服務(wù)平臺(tái)是Tomcat，數(shù)據(jù)庫(kù)服務(wù)平臺(tái)是PostgreSQL。系統(tǒng)是基于JAVA語(yǔ)言的SSH(Struts+Spring+Hibernate)框架開發(fā)的。2013年12月，由中國(guó)科學(xué)院植物研究所構(gòu)建的“中國(guó)珍稀瀕危植物DNA條形碼鑒定平臺(tái)”(http：//www.brep.ac.cn)正式啟用，這是一個(gè)社會(huì)公益性平臺(tái)，目的是讓全社會(huì)能利用科學(xué)研究成果。該平臺(tái)提供多種DNA條形碼鑒定途徑，達(dá)到準(zhǔn)確鑒別未知珍稀瀕危植物的目的。2015年11月5日，由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所開發(fā)的“中國(guó)兩棲類信息系統(tǒng)”正式上線，標(biāo)志著中國(guó)兩棲類物種有了屬于自己的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，該信息系統(tǒng)共收錄中國(guó)兩棲類物種3目12科61屬429種，對(duì)每一個(gè)物種都進(jìn)行了專業(yè)介紹。該系統(tǒng)還可進(jìn)行“在線物種鑒定”，后臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)已包含2 048條COⅠ基因序列，覆蓋302個(gè)物種。

此外，我國(guó)還大力開展了許多DNA條形碼項(xiàng)目研究，例如2012年啟動(dòng)的“十二五”“863”計(jì)劃、“基于DNA條形碼的快速檢測(cè)與分類關(guān)鍵技術(shù)”，通過選擇我國(guó)珍稀藥用物種資源、野生物種資源、主要農(nóng)作物資源和環(huán)境指示型生物等，來研制DNA條形碼檢測(cè)技術(shù)和相關(guān)試劑產(chǎn)品，并構(gòu)建上述生物物種的基因條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，建立我國(guó)重要生物遺傳資源的DNA條形碼網(wǎng)絡(luò)服務(wù)體系及基于DNA條形碼技術(shù)的快速檢測(cè)方法和分類平臺(tái)。中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)——“我國(guó)重要漁業(yè)生物DNA條形碼信息采集及其數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建”重點(diǎn)項(xiàng)目于2013年6月啟動(dòng)，旨在拓展DNA條形碼技術(shù)在漁業(yè)新資源開發(fā)、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、水產(chǎn)育種、水產(chǎn)品質(zhì)量安全和有害入侵物種控制等方面的應(yīng)用。迄今為止已經(jīng)建立了具有漁業(yè)生物特色的DNA條形碼技術(shù)；采集并保存了漁業(yè)生物標(biāo)本11 067份，獲得漁業(yè)生物DNA條形碼2 447條，建立了初具規(guī)模的漁業(yè)生物憑證標(biāo)本庫(kù)和DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)；工作專項(xiàng)——“《中國(guó)植物志》的數(shù)字化和DNA條形碼”于2013年11月啟動(dòng)，以《中國(guó)植物志》、FloraofChina和中國(guó)高等植物物種信息等研究成果為核心，將植物分類學(xué)以及相關(guān)學(xué)科的最新研究成果整合，利用計(jì)算機(jī)和現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)集成傳統(tǒng)分類、分子系統(tǒng)學(xué)和DNA條形碼等信息，更新和提升數(shù)字化的《中國(guó)植物志》，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)協(xié)同工作平臺(tái)，初步實(shí)現(xiàn)我國(guó)維管植物科屬級(jí)水平鑒定信息系統(tǒng)，構(gòu)建新一代智能植物志(iFlora)；2014年啟動(dòng)的工作專項(xiàng)——“我國(guó)近海海洋生物DNA條形碼資源庫(kù)構(gòu)建”由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所承擔(dān)，根據(jù)不同類群的特點(diǎn)，選擇有代表性的重要海洋生物類群，如原核生物、植物、浮游動(dòng)物、大型底棲無脊椎動(dòng)物及魚類等，在形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)并規(guī)模化地獲取DNA條形碼序列。國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)重大項(xiàng)目——“DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的進(jìn)化和隱存生物多樣性研究”，基于DNA條形碼序列探索新種和隱存種的理論和方法，通過篩選新的動(dòng)物DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因，研究標(biāo)準(zhǔn)基因的變異規(guī)律，為不同動(dòng)物類群標(biāo)記基因的選取及設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

表1 部分DNA條形碼相關(guān)項(xiàng)目及簡(jiǎn)介

2 DNA條形碼在生物多樣性研究中的應(yīng)用

2.1 生物多樣性保護(hù)

2.1.1 物種鑒定 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，珍稀瀕危物種棲息地日益遭到破壞，對(duì)生物多樣性的保護(hù)刻不容緩。開展瀕危物種的保護(hù)研究首要任務(wù)就是對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。DNA條形碼技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定更為準(zhǔn)確客觀(Hajibabaeietal.,2006a；郭銳等，2012)。Li等(2015)對(duì)中國(guó)境內(nèi)分布的嚙齒目Rodentia鼠亞科Murinae和田鼠亞科Arvicolinae部分物種進(jìn)行首次大規(guī)模系統(tǒng)的DNA條形碼鑒定研究。該研究分析了四川地區(qū)鼠亞科31個(gè)種和田鼠亞科23個(gè)種的線粒體COⅠ基因片段，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼可以準(zhǔn)確識(shí)別物種并可以完善系統(tǒng)的嚙齒目物種鑒定工作。但是其中一種BLOG數(shù)據(jù)分析方法需要建立在正確的形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)物種的鑒定成功率才能達(dá)到100%，這表明在DNA條形碼研究中對(duì)物種進(jìn)行完全的分類和準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定同樣重要。形態(tài)學(xué)鑒定粉虱(Hemiptera：Aleyrodidae)成蟲很困難。Ovalle等(2014)分析了9種若蟲階段和成蟲階段的粉虱COⅠ基因序列(約709 bp)，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)粉虱的快速鑒定，當(dāng)結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)時(shí)可以節(jié)省測(cè)序費(fèi)用并充分區(qū)分不同粉虱之間的變異，更有效地監(jiān)控粉虱的傳播。

DNA條形碼不僅被成功應(yīng)用于動(dòng)物物種鑒定，在植物鑒定中也發(fā)揮較大作用(Sassetal.,2007)。Pei等(2011)和裴男才(2012)利用DNA條形碼從熱帶雨林或亞熱帶常綠闊葉林中一些林冠層物種的葉片或樹皮中提取DNA，能夠?qū)ο嚓P(guān)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。Xie等(2014)將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于中國(guó)74種有毒植物，使用生物信息學(xué)分析方法評(píng)估m(xù)atK、rbcL和ITS序列對(duì)植物的辨識(shí)度，證明DNA條形碼技術(shù)是一種可以快速鑒定有毒植物的方法，并建議matK、rbcL和ITS 3種基因結(jié)合作為DNA條形碼技術(shù)鑒定有毒植物的條形碼基因。Naeem等(2014)通過棕櫚科中10個(gè)物種的葉片樣本評(píng)估m(xù)atK和rbcL基因?qū)ψ貦翱浦参锏蔫b別，結(jié)果表明這2種條形碼基因均顯示出較高的擴(kuò)增成功率，基于matK基因?qū)ψ貦翱浦参锏蔫b別力高達(dá)90%，比rbcL基因(66.6%)更適合作為棕櫚科植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼。

2.1.2 瀕危物種的保護(hù) DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)使其能夠有效地被應(yīng)用于瀕危物種的保護(hù)。Holmes等(2009)對(duì)澳大利亞附近海域非法捕撈的不明來源的211個(gè)魚鰭樣品進(jìn)行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)多數(shù)鯊魚屬于被列為世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄的鼬鯊屬Galeocerdo、真鯊屬Carcharhinus、檸檬鯊屬Negaprion，還發(fā)現(xiàn)樣品中包括極度瀕危物種——鈍鋸鰩Anoxypristiscuspidata。DNA 條形碼作為一種快速簡(jiǎn)便的識(shí)別鑒定方法在瀕危植物的保護(hù)中也得到較好的應(yīng)用。Zuo等(2011)為了鑒別瀕危物種人參屬Panax的物種，使用DNA條形碼技術(shù)對(duì)人參屬8種的95個(gè)樣本進(jìn)行研究：基于11個(gè)候選基因(atpF-atpH、trnH-psbA、psbK-psbI、psbM-trnD、matK、rps16、rpoB、rpoC1、rbcL、nad1、ITS)片段的序列分析，發(fā)現(xiàn)trnH-psbA和ITS基因組合足以鑒別人參屬的所有物種。Sosa等(2013)評(píng)價(jià)不同條形碼基因?qū)δ鞲?0種瀕危蘭科和36種竹亞科Bambusoideae植物的鑒別力，結(jié)果表明僅使用matK基因即可對(duì)墨西哥瀕危蘭科植物鑒定到種，而使用psbI-K基因結(jié)合matK基因可對(duì)竹亞科植物鑒別到屬。

2.1.3 發(fā)現(xiàn)隱存種 傳統(tǒng)的分類鑒定方法并不能夠準(zhǔn)確地揭示種群之間的遺傳分化(Saitohetal.,2015)，而DNA條形碼不受主觀判斷影響的限制，不僅可以揭示物種之間的遺傳分化，還能發(fā)現(xiàn)新種與隱存種，有利于生物多樣性的保護(hù)。Saitoh等(2015)基于線粒體COⅠ基因序列分析了日本列島的234種鳥和歐亞大陸的142種鳥，發(fā)現(xiàn)日本列島及其周邊的24種鳥類可能是隱存種，這與日本列島周圍的海洋和海峽的基因阻隔作用有關(guān)。該研究表明傳統(tǒng)的鳥類分類方法在對(duì)東亞鳥類進(jìn)行鑒別時(shí)不能完全反映其中的差異性，而COⅠ基因在鑒定鳥類時(shí)具有很高的分辨率，可以成為鑒別鳥類物種的有效工具。Efe等(2009)用線粒體COⅠ、Cytb等基因?qū)l危物種——白嘴端燕鷗Thalasseussandvicensis進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了該種鳥類的2個(gè)隱存種，為保護(hù)該珍稀鳥類提供了新方向。Liu等(2011)基于植物DNA條形碼的5個(gè)候選基因(rbcL、matK、trnH-psbA、trnL-F、ITS)對(duì)分布于歐亞的11種紅豆杉屬Taxus植物進(jìn)行了研究，研究表明單獨(dú)使用ITS、trnL-F基因或組合可以作為鑒定最可靠的條形碼，同時(shí)確定了歐亞的紅豆杉屬植物可能存在隱存種。這一結(jié)論也得到了居群遺傳學(xué)(Liuetal.,2013)和形態(tài)學(xué)(M?lleretal.,2013)的支持。Lahaye等(2008)在使用8種條形碼對(duì)中美洲和南美洲的1 600多種植物進(jìn)行分析時(shí)不僅證明了DNA條形碼在生物多樣性中的適用性，而且在使用matK基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)其中一種捧心蘭Lycastecf.tricolor可能存在隱存種。

2.2 生物多樣性評(píng)估

DNA條形碼技術(shù)也是開展生物多樣性評(píng)估和物種鑒定研究有效的工具(Yanetal.,2015)。傳統(tǒng)的蝙蝠生物多樣性野外調(diào)查主要依賴于形態(tài)學(xué)上的鑒定和蝙蝠探測(cè)器裝置的使用，但傳統(tǒng)的鑒定方法耗時(shí)耗力，而且蝙蝠探測(cè)器無法對(duì)特定物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)造成資源浪費(fèi)。Wilson等(2014)在缺乏物種信息的情況下，基于線粒體COⅠ基因序列對(duì)翼手目4屬(Rhinolophus、Hipposideros、Murina、Phoniscus)的13個(gè)個(gè)體進(jìn)行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼可以完全區(qū)分這13種翼手目動(dòng)物，更加準(zhǔn)確地評(píng)估ɑ多樣性和β多樣性。Chen等(2015)收集怒江流域46種形態(tài)不同的1 139個(gè)魚類個(gè)體，通過NJ樹、條形碼指數(shù)(Barcode Index Numbers，BINs)、間隙條形碼發(fā)現(xiàn)(Automatic Barcode Gap Discovery，ABGD)等方法鑒定出43個(gè)物種，并且發(fā)現(xiàn)在棒花魚Abbottinarivularis、高體鳑鲏Rhodeusocellatus、大鱗副泥鰍Paramisgurnusdabryanus這3個(gè)入侵物種的種內(nèi)可能存在隱存種。

DNA條形碼技術(shù)不僅可以對(duì)當(dāng)前的生物多樣性進(jìn)行分析，也可以對(duì)過去的生物多樣性進(jìn)行分析。Willerslev等(2007)對(duì)從格蘭陵島冰帽底部收集到距今約45萬年的粉末狀樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)格蘭陵島南部在那時(shí)有森林覆蓋，植被主要由云杉屬Picea、榿木屬Alnus、松屬Pinus組成。此外，DNA條形碼技術(shù)還能作為了解生物體之間營(yíng)養(yǎng)相互作用的工具，尤其是難以進(jìn)入的棲息地，如森林根冠及地下區(qū)域。Jones等(2011)對(duì)巴拿馬巴羅科羅拉多島熱帶雨林的土樣進(jìn)行收集，利用DNA條形碼鑒定根的種類，通過將在DNA條形碼基礎(chǔ)上對(duì)根的鑒定和樹木個(gè)體空間的記錄結(jié)合起來，得出的結(jié)論反映了植被之間的關(guān)系，并能夠據(jù)此重建植物群落的地上與地下關(guān)系。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于DNA條形碼技術(shù)水平上的生物多樣性分析更為經(jīng)濟(jì)方便。整合了DNA高通量測(cè)序和DNA條形碼技術(shù)的DNA metabarcoding技術(shù)，通過提取環(huán)境樣品中的DNA，并使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后得到的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)進(jìn)行物種鑒定。該技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、成本低、對(duì)所取樣品量要求低等優(yōu)點(diǎn)，在食性分析、物種監(jiān)測(cè)、外來入侵物種的監(jiān)測(cè)方面得到了較廣泛的應(yīng)用，也為生物多樣性評(píng)估提供了高效有力的分析方法。Thomsen等(2012)利用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究海洋魚類生物多樣性，在獲得的環(huán)境DNA中發(fā)現(xiàn)了15種不同的魚類以及4種鳥類，其中包括一些用傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法很難發(fā)現(xiàn)的稀有物種。與9種傳統(tǒng)的海洋魚類調(diào)查方法比較，環(huán)境DNA檢測(cè)出的魚類多樣性與其他傳統(tǒng)方法相當(dāng)，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。Evans等(2016)使用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)對(duì)模擬條件下的水體生態(tài)群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)物種豐富度和測(cè)序讀長(zhǎng)豐富度存在正相關(guān)關(guān)系，表明環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)在量化自然環(huán)境水體中的物種多樣性上有很大潛力，并且該技術(shù)可作為衡量大型底棲動(dòng)物豐富度的指數(shù)。最近，Crampton-Platt等(2015)基于第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)來自婆羅洲雨林的500個(gè)甲蟲標(biāo)本的混合樣品進(jìn)行測(cè)序，獲得175個(gè)物種的全部或部分線粒體基因組。利用這些樣本分析獲得的系統(tǒng)進(jìn)化樹與基于全球鞘翅目Coleoptera主要支系現(xiàn)有的線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹高度相似。結(jié)果表明線粒體宏基因組可作為新的DNA“超級(jí)條形碼”用于研究節(jié)肢動(dòng)物及其他生物多樣性的全球模式。

3 展望

鑒于單基因在類群中通用性不高的因素，多基因片段聯(lián)合的DNA條形碼鑒定系統(tǒng)已經(jīng)成為一個(gè)探索的趨勢(shì)。隨著DNA metabarcoding、DNA微型條形碼、宏條形碼等的發(fā)展，以及DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，DNA條形碼技術(shù)將在生物多樣性研究領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

在出入境檢驗(yàn)檢疫以及鑒定外來入侵物種等方面，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定需要花費(fèi)大量時(shí)間，很難進(jìn)行快速檢疫，DNA條形碼技術(shù)為檢驗(yàn)檢疫及鑒定外來入侵物種提供了新的工具。2011年，“基于DNA條形碼的快速檢測(cè)與分類關(guān)鍵技術(shù)”被納入中國(guó)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)。其次，DNA條形碼技術(shù)在中藥材鑒定中也有著廣闊的應(yīng)用前景，能夠?qū)λ幉恼鎮(zhèn)芜M(jìn)行鑒定(陳士林等，2013)，在生物監(jiān)管領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用空間。使用DNA條形碼技術(shù)不但能在棲息地喪失之前創(chuàng)建生物多樣性的庫(kù)存，而且有助于生物多樣性的保護(hù)。DNA條形碼鑒定具有快速、簡(jiǎn)便、不受外界環(huán)境變化而改變等優(yōu)勢(shì)，隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，鑒定成本不斷下降，相信在未來將會(huì)具有更廣泛的應(yīng)用。

DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展給生物學(xué)研究帶來了許多機(jī)遇，但尚未解決自身局限性所帶來的問題，比如核內(nèi)假基因的存在會(huì)導(dǎo)致DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤，使用通用引物對(duì)DNA進(jìn)行條形碼擴(kuò)增時(shí)，這些假基因會(huì)協(xié)同擴(kuò)增進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)物種數(shù)量估計(jì)過高(Songetal.,2008)。Song等(2008)利用蝗蟲和小龍蝦研究了假基因?qū)NA條形碼鑒定產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)假基因?qū)е聴l形碼過高估計(jì)了物種數(shù)目。此外，近緣物種間的雜交或基因滲入及某些新近形成物種序列差異極小等問題會(huì)導(dǎo)致線粒體基因沒有積累足夠的變異來區(qū)分物種(戴傳銀等，2010)。Ermakov等(2015)發(fā)現(xiàn)歐亞大陸地區(qū)的4種黃鼠(Spermophilusfulvus、S.major、S.pygmaeus和S.erythrogenys)存在線粒體DNA基因滲入，例如在S.fulvus中發(fā)現(xiàn)有16.6%個(gè)體有S.major的單倍型，5%的S.pygmaeus個(gè)體有S.fulvus的單倍型，COⅠ基因的單倍型有不同程度的重疊，無法正確鑒定這4個(gè)物種。Feng等(2013)應(yīng)用DNA條形碼鑒別中國(guó)西部的楊屬PopulusL.物種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA條形碼對(duì)那些分布區(qū)重疊或是相鄰區(qū)域的物種無法鑒別，這可能是由于種間雜交或基因滲入、不完全譜系分選(incomplete lineage sorting)導(dǎo)致。

DNA條形碼技術(shù)同樣面臨著取樣問題，研究表明地理分布較遠(yuǎn)的同種生物因共生體的不同會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA序列的差異變大，出現(xiàn)一個(gè)物種具有多個(gè)不同的條形碼(Inglebyetal.,2013)。研究過程中取樣的數(shù)量也會(huì)對(duì)鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響(李超等，2014)。此外，存在足夠大小的條形碼間隙(barcoding gap)是DNA條形碼準(zhǔn)確鑒定物種的前提之一。而隨著技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，已發(fā)現(xiàn)條形碼間隙在有些類群中并不明顯，甚至出現(xiàn)了種內(nèi)差異和種間差異重疊的現(xiàn)象(趙廣宇等，2014)。同時(shí)，在DNA條形碼研究過程中應(yīng)嚴(yán)格遵循綜合分類學(xué)(integrated taxonomy)的理念(Willetal.,2005)。

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Application of DNA Barcoding in Biodiversity

CHEN Lian1， WU Lin1， WANG Qifei1， WU Jun2， LIU Yan2， DING Hui2， XU Haigen2*

(1. College of Life Sciences， Chemistry and Chemical Engineering， Jiangsu Second Normal University， Nanjing 210013， China;2. Nanjing Institute of Environmental Sciences， Ministry of Environmental Protection， Nanjing 210042， China)

DNA barcoding is a technology for accurate and rapid identification of species by analyzing standard short DNA sequences with enough variation in the organism. The concept of DNA barcoding has attracted widespread attention since 2003. More and more projects focused on DNA barcoding and information system construction have been carried worldwide， and provide a solid foundation and bioinformatics analysis platform for the development of DNA barcoding. DNA barcoding makes up for the shortcomings of traditional taxonomy and provides new ideas and methods for biodiversity research. Here we provided a brief introduction for the research progress of DNA barcoding， and reviewed its applications and advances in species identification， endangered species protection， cryptic species， and biodiversity assessment. We also discussed the problems of DNA barcoding and gave a prospect for its application in biodiversity.

DNA barcoding; biodiversity; taxonomy; species identification

2016-05-12 接受日期：2016-08-05

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20131087)； 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目(2013)； 江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201514436007Z)

陳煉(1982—)， 女， 博士， 副研究員， 主要從事分子生態(tài)學(xué)研究， E-mail：chenlian_2004@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：xhg@nies.org

10.11984/j.issn.1000-7083.20160123

Q523

A

1000-7083(2016)06-0942-08