利用EMS篩選豆科模式植物百脈根的根瘤突變體及突變部位

車成來，金龍哲，林 花，王 霞，王欣宇，李永一

(延邊朝鮮族自治州農業(yè)科學院，吉林 龍井 133400)

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利用EMS篩選豆科模式植物百脈根的根瘤突變體及突變部位

車成來，金龍哲，林 花，王 霞，王欣宇，李永一*

(延邊朝鮮族自治州農業(yè)科學院，吉林 龍井 133400)

豆科植物百脈根是研究共生固氮體系的模式植物之一，被根瘤菌感染后形成根瘤，根瘤菌固定氮素變換成銨態(tài)氮，植物利用銨態(tài)氮進行營養(yǎng)生長，而根瘤菌利用植物供給的碳酸同化產物為能源。為獲得根瘤的成熟、維持的基因，本研究利用化學誘變試劑EMS處理百脈根MG-20得到多種突變體，篩選根瘤成熟、維持有異常的突變植株，利用SSR標記和dCAPS標記進行基因定位。結果表明：約10萬M2百脈根植株中獲得nup85突變體 2株，nup133突變體 4株，pollux突變體 6株，ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突變體各1株等不結瘤突變體(Nod-)18株；結無效根瘤突變體(Fix-)6株并確定了突變體的突變部位。

豆科植物；百脈根；突變體；根瘤；突變基因

目前，很多科學家解讀微生物的根瘤菌基因序列，利用豆科植物研究根瘤形成有關基因分離、鑒定及確定基因的功能。為了闡明有關植物結瘤過程的基因網絡，從豌豆、大豆、百脈根、三葉草等植物中分離很多共生突變體。影響形成根瘤過程的突變表型分為不結瘤突變體(Nod-)、結無效結瘤突變體(Fix-)和超結瘤突變體(Nod++)等3種突變體。最近，利用豆科模式植物百脈根共生突變體的分子遺傳學的分析逐漸確定根瘤共生信號因子Nod factor收容因子等宿住豆科植物的根瘤形成早期反應有關的植物基因的功能。

百脈根(Lotus japonicas)基因長度比較短(約4億5千萬堿基對，染色體為二倍體2 n=12)，可以安定轉型，生育周期短，易栽培，可以共生根瘤菌Mesorhizobium loti以及叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi)，被稱為豆科植物中的模式植物利用于研究。很多研究人員利用百脈根在結瘤過程中表達改變的基因分析鑒定根瘤突變的原因基因。根瘤突變體的分子遺傳學分析有EMS(ethyl methane sulfonate)處理法、T-DNA插入法、離子束輻射誘變法、轉座子介導誘變法、啟動子誘變法、轉基因法等多種篩選方法。百脈根突變體中最初被克隆和確定的基因是與結瘤初期過程有關的基因Nin(nodule inception)[1]。這些年2類微生物與宿主植物共生關系研究中很多有關結瘤過程的基因被分離、鑒定，還確定了根瘤菌和叢枝菌根真菌享有相同的共生途徑，這共生途徑被稱為Common Sym Pathway。

克隆是指生物體通過體細胞進行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群。研究者們利用RT-PCR方法克隆小麥[2]、大豆[3]等植物中的基因，并對其進行生物信息學分析。NIN是形成感染絲和結瘤原基必需的，被認為是結瘤初期階段發(fā)揮功能的轉錄因子。之后分離Nfr1[4]和Nfr5[5]，克隆SYMRK[5-6]、Castor[7]、Pollux[7]等基因。

本研究通過EMS誘變百脈根MG-20獲得多種表型突變體，并對這些突變體進行基因定位，不僅提供更多篩選根瘤的成熟、維持的基因方法，也為突變體的基因功能研究提供重要材料。

1 材料與方法

1.1 材料

百脈根MG-20、Gifu B-129，東京大學農學生命科學研究科植物功能研究室提供。

1.2 誘變處理

百脈根MG-20種子用0.4% EMS處理8 h。5 000株M1植物中獲得約10萬M2種子。

1.3 播種與篩選

M2種子用含少量氮源的土壤(含50 mg/kg銨態(tài)氮和10 mg/kg硝酸態(tài)氮)栽培1周后，接Mesorhizobium lotiMAFF303099的根瘤菌。接菌3～4周后，篩選不結瘤突變體或異常根瘤的突變體。篩選的突變體用含大量氮源的土壤栽培7周后再次篩選。利用M3植物和MG-20回交獲得同樣表型的F2植物。篩選過程中除掉結少量根瘤或生長不良的突變體。

1.4 叢枝菌根真菌感染

用直徑2～0.5 mm篩子篩出的砂子滅菌1 h。砂子里叢枝菌根真菌Glomus intraradicesDAOM1862孢子(200個/株)結菌的洋蔥栽培1周，洋蔥周圍移栽突變體2周后，利用Trypan blue染色，用光學顯微鏡觀察菌根真菌的感染。

1.5 提取DNA和突變基因定位

獲得的突變體植株和Gifu B-129雜交獲得F2植物。F2植物的葉片利用CTAB法提取DNA。提取的DNA用SSR標記(http://www.kazusa.or.jp)和dCAPS標記PCR，電泳后利用凝膠成像儀觀察擴增結果，確定突變基因的位置。

1.6 解讀基因序列

設計各基因的解讀基因序列用引物，進行PCR，利用這些引物Direct sequencing法解讀基因分析。

2 結果與分析

2.1 篩選突變體

利用化學誘變試劑EMS處理的百脈根M2約10萬株中篩選根瘤突變體24株(表1)，其中包括不結瘤突變體(Nod-)18株，結無效根瘤突變體(Fix-)6株，并獲得多數同樣基因突變體。如圖1所示，Nod-突變體完全不結根瘤，Fix-突變體結瘤，根瘤顏色為白色或綠色，無固氮能力或固氮能力很低。一般野生株百脈根的正常根瘤顏色為紅色。

表1 百脈根的根瘤突變體及突變植株編號

MG-20：野生植株；Nod-：不結瘤突變體；Fix-：結無效根瘤突變體；1：正常(紅色)根瘤；2：白色根瘤；3：粉色根瘤；4：綠色根瘤；Bar 1cm

圖1 脈根的根瘤突變體的表型

Fig.1 The phenotype ofLotusjaponicusmutants

2.2 叢枝菌根真菌感染

為了找出根瘤菌和叢枝菌根真菌共生路徑上的突變體及基因，做叢枝菌根真菌感染試驗。百脈根野生植株(MG-20)中可以觀察到叢枝菌根真菌的內生菌絲和叢枝狀(圖2)。No.193、No.1674、No.1690突變體中只觀察到外生菌絲，而其他的突變體中都觀察到內生菌絲和叢枝狀。結果表明：No.193、No.1674、No.1690突變體未感染叢枝菌根真菌，而其他突變體感染叢枝菌根真菌(表2)。

圖2 接菌(叢枝菌根真菌)2周后光學顯微鏡觀察

表2 Nod-突變體及突變部位

注:Amy+：叢枝菌根真菌感染；Amy-：叢枝菌根真菌未感染；Vesicle：泡囊狀；Arbuscule：叢枝狀。

2.3 Nod-突變體的突變部位

本研究利用SSR分子標記和dCAPS標記確定各突變體基因在百脈根染色體中的突變部位及氨基酸的變化部位。結果表明，No.145突變體是CCaMK基因突變；No.187、No.1950突變體是NUP85基因突變；No.193突變體是NIN基因突變；No.601突變體是Castor基因突變；No.1383突變體是SymRK基因突變；No.1674突變體是Nfr1基因突變；No.1690突變體是Nfr5基因突變；No.1466、No.1967. No.1969、No.2094、No.2226、No.3124突變體是均Pollux基因突變；No.1566、No.1942、No.2494、No.3142突變體是均NUP133基因突變。各突變體的基因都發(fā)生點突變，而且突變基因堿基和突變部位都各不相同或有的失去堿基。

2.4 根瘤菌和叢枝菌根真菌的共生基因

根瘤菌產生的Nod factor因子和叢枝菌根真菌產生的Myc factor因子受到一些基因的影響，而這些基因在信號傳達途徑Common Sym Pathway上。根瘤菌結瘤因子受體激酶NFR1和NFR5(LysM-type serine/threonine receptor kinase)提示Nod factor信號都能感知結瘤因子，在根系中介導植物對根瘤菌感染的早期反應，認為是Nod factor的收容因子。symRK(symbiosis receptor-like kinase)認為是具有構成富含信號肽、亮氨酸重復序列的細胞外域、跨膜細胞內蛋白質域的受體激酶NFR1和NFR5的下游Calcium spiking之間傳遞信號的蛋白質，但它的詳細功能尚未確定。symRK基因可能是識別叢枝菌根真菌和固氮細菌產生的特異分子并與之結合的受體。SYMRK下游被離子通道蛋白CASTOR和POLLUX細胞內的Ca短周期地出現鈣振蕩，CCaMK[8]利用某些機制把這信號傳達，轉錄因子CYCLOPS[9]誘導基因表達。由CYCLOPS的作用，一些機制積累細胞分裂素(cytokinin)，介導這些分子的受體(LHK1)進行之后的結瘤過程(圖3)。結果表明，本研究中獲得目前為止已知的根瘤菌與叢枝菌根真菌的共生途徑上作用的幾乎全部基因。

★為至今被克隆的基因；*為至今獲得的突變體，但未克隆的基因；Common Sym Pathway：根瘤菌與叢枝菌根真菌的共生途徑

圖3 經過結瘤因子Nod factor后的信號傳達途徑和共生初期有影響的宿主基因群

Fig.3 Nod factor signaling pathway and early symbiotic influential group of host genes

2.5 百脈根突變體的突變基因初步定位

SSR(Simple Sequence Repeats)標記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物RCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，是一類由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。為了探索百脈根Nod-突變體在染色體上的位置和突變基因的突變部位，利用日本かずさDNA研究所網站記載的SSR分子標記和dCAPS標記進行突變基因初步定位，對候補基因進一步確定突變部位進行基因測序。結果表明，nin、nfr1、nup133、castor突變體在第1染色體的上端和下端部位；symrk、nfr5在第2染色體的中下端和下端部位；ccamk在第3染色體的中上端部位；pollux在第6染色體的下端部位突變(圖4)。

★為本研究中獲得的百脈根突變體的基因在染色體上的位置

3 討論

3.1 百脈根栽培方法

目前很多研究室利用蛭石栽培百脈根種子的方法進行篩選百脈根突變體[10]，本研究利用赤玉土和kureha培養(yǎng)土14∶1混合的富含氮源的土壤(約含50 mg/kg的銨態(tài)氮及10 mg/kg的硝態(tài)氮)栽培百脈根進行篩選。篩選過程中對生長受到抑制或結瘤極少的突變體排除研究對象外，只篩選在富含氮源培養(yǎng)土中跟野生株一樣生長良好的突變體為研究對象。篩選結果，獲得至今為止已報告的幾乎所有功能的基因，并獲得多數部分突變體。因此，利用含少量氮源土壤的栽培方法篩選獲得更大數量突變群體的可能性高。

3.2 EMS誘變以及篩選突變體

EMS化學誘變法具有操作簡便、受外界因素影響較少、突變頻率高、易形成點突變、突變范圍廣等特點，是最常用誘變劑。本研究利用EMS誘變百脈根獲得不結瘤突變體18株和結無效根瘤突變體6株。

3.3 無效結瘤突變體

無效結瘤突變體(Fix-)是百脈根結根瘤但有少量或無固氮能力的根瘤。首先被克隆的無效結瘤突變體的基因是Sst1(symbiotic sulfate transpoter)[11]，其次Ign1(ineffective greenish nodules)[12]基因被克隆。IGN1被認知具有跨膜域和7個針錨蛋白重復的蛋白質，但它的功能還沒闡明。其他還有未確定基因的突變體sen1(stationary endosymbiont nodule)[13]比野生株結2～3倍的根瘤，幾乎無固氮能力，結白色根瘤，利用Microarray進行基因表達分析。Lot1(low nodulation and trichome distortion)[14]是抑制根瘤數量的突變體；Alb1(aberrant localization of bacteria inside nodule)[15]是影響維管束分化的突變體；Fen1(fail in enlargement of infected cells)[16]是破壞感染細胞的突變體；Ljsym105[17]結粉色的小根瘤，固氮能力約為野生株的50%，形成小的感染細胞的突變體。本研究獲得的無效根瘤突變體有2株ign1突變體、3株sen1突變體、1株sym7突變體。結果表明：Kumagai獲得的ign1突變體結白色根瘤，而本研究獲得的ign1突變體結粉色(圖1相片中看不清，但的確是粉色根瘤)和白色根瘤；Suganuma獲得的sen1突變體結白色根瘤，而本研究獲得的sen1突變體結綠色根瘤。從而看出，同樣基因的不同核苷酸改變而根瘤顏色表型也不同。

4 結論

本研究確定少量含氮源土壤栽培百脈根的方法比蛭石栽培方法較全面且多量篩選突變體。該方法獲得了9種不結瘤突變體(Nod-)和3種無效結瘤突變體(Fix-)，并獲得了pollux突變體 6株、nup133突變體 4株、nup85突變體 2株、sen1突變體3株、ign1突變體2株等多數同樣突變體。無效結瘤突變體中還獲得了粉色、白色、綠色等3種不同顏色根瘤表型的突變體。這些突變體將為豆科植物根瘤形成機理的研究提供重要材料和理論依據。

[1] Schauser L,Roussis A.A plant regulator controlling development of symbiotic root nodules[J].Nature，1999，402(6758):191-195.

[2] Radutoiu S,Madsen L H.Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases[J].Nature，2003，425(6958):585-592.

[3] 張蕾，于永昂，楊天佑.小麥TaxRCC1基因的克隆及生物信息學分析[J].河南科技學院學報，2015，43(06)：1-7.

[4] 蓋江濤，趙團結，李艷，等.大豆腺苷酸激酶基因GmADK的克隆與表達分析[J].作物學報，2013，39(10)：1739-1745.

[5] Madsen E B,Madsen L H.A receptor kinase gene of the LysM type is involved in legume perception of rhizobial signals[J].Nature，2003，425(6958):637-640.

[6] Stracke S,Kistner C.A plant receptor-like kinase required for both bacterial and fungal symbiosis[J].Nature，2002，417(6892):959-962.

[7] Imaizumi-Anraku H,Takeda N.Plastid proteins crucial for symbiotic fungal and bacterial entry into plant roots[J].Nature，2005，433(7025):527-531.

[8] Tirichine L,Imaizumi-Anraku H.Deregulation of a Ca2+/calmodulin-dependent kinase leads to spontaneous nodule development[J].Nature，2006，441 (7097):1153-1156.

[9] Yano K,Yoshida S.From the Cover:CYCLOPS,a mediator of symbiotic intracellular accommodation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(51):20540-20545.

[10] 今泉(安楽) 溫子.ミヤコグサ(Lotus japonicum)の基本実験マニュアル[D]. 1999.

[11] Krusell L,Krause K.The sulfate transporter SST1 is crucial for symbiotic nitrogen fixation in Lotus japonicus root nodules[J].Plant Cell，2005， 17(05): 1625-1636.

[12] Kumagai H,Hakoyama T.A novel ankyrin-repeat membrane protein,IGN1,is required for persistence of nitrogen-fixing symbiosis in root nodules of Lotus japonicus[J].Plant Physiol，2007，143(03):1293-1305.

[13] Suganuma N,Yamamoto A.cDNA macroarray analysis of gene expression in ineffective nodules induced on the Lotus japonicus sen1 mutant[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，2004,17(11):1223-1233.

[14] Ooki Y,Banba M.Characterization of the Lotus japonicus symbiotic mutant lot1 that shows a reduced nodule number and distorted trichomes[J].Plant Physiol，2005，137(04):1261-1271.

[15] Imaizumi-Anraku H,Kouchi H.Analysis of ENOD40 expression in alb1,a symbiotic mutant of Lotus japonicus that forms empty nodules with incompletely developed nodule vascular bundles[J].Molecular and General Genetics，2000， 264(04):402-410.

[16] Kawaguchi M,Imaizumi-Anraku H.Root,root hair,and symbiotic mutants of the model legume Lotus japonicus[J].Mol.Plant-Microbe Interact，2002，15(01): 17-26.

[17] Hossain M S,Umehara Y.A novel Fix(-) symbiotic mutant of Lotus japonicus, Ljsym105, shows impaired development and premature deterioration of nodule infected cells and symbiosomes[J].Mol.Plant-Microbe Interact，2006，19(07):780-788.

Selection of root nodule mutant and mutation portion of model legume Lotus japonicus by virtue of EMS

CHE Chenglai, JIN Longzhe, LIN Hua, WANG Xia, WANG Xinyu, LI Yongyi*

(YanbianAcademyofAgriculturalSciences,LongjingJilin133400，China)

LegumeLotusjaponicusis one of the model plants for studying the symbiotic nitrogen fixation system. In order to exploring the genes related with root nodule maturing and maintaining, divergent mutants fromLotusjaponicusMG-20 were induced with chemical mutagenesis reagent EMS, subsequently, from which mutant plants characterized by mature and abnormally maintained root nodule were screened and, the candidate genes were mapped with SSR and dCAPS markers. The results showed that among 100 000 M2 mutants induced fromLotusjaponicus, 18 plants were non-nodulation (Nod-) mutants, including twonup85 mutants, fournup133 mutants, sixpolluxmutants, oneccamkmutant, onesymrkmutant, onecastormutant, oneninmutant, 1nfr1 mutant, 1nfr5 mutant and six unavailable nodulation (Fix-) mutants. Additionally, these mutations were positioned successfully.

Leguminous plant；Lotusjaponicus；mutant；nodule；mutant gene

2016-08-22

車成來(1971—)，男(朝鮮族)，吉林龍井人，助理研究員,研究方向為分子育種學。李永一為通信作者,

E-mail:Lyygood79@163.com

1004-7999(2016)03-0235-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.010

S541.6

A