自身免疫性肝炎患者肝組織程序性細(xì)胞死亡因子1及其配體1的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性

柯坤宇 魏大海 陳麗芳 孔金峰 孫芳 熊克宮

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·論 著·

自身免疫性肝炎患者肝組織程序性細(xì)胞死亡因子1及其配體1的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性

柯坤宇 魏大海 陳麗芳 孔金峰 孫芳 熊克宮

目的 通過檢測(cè)程序性細(xì)胞死亡因子1(PD-1)及其配體1(PD-L1)在自身免疫性肝炎(AIH))患者不同分期肝組織中的表達(dá)情況，探討其在AIH發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 收集43例AIH患者(包括活動(dòng)期31例和緩解期12例)肝組織，并選擇9例健康者為對(duì)照組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像定量分析系統(tǒng)檢測(cè)肝組織內(nèi)PD-1及PD-L1的表達(dá)情況，并比較不同病情分期PD-1及PD-L1表達(dá)的差異。結(jié)果 AIH患者肝組織PD-1為(10.12±5.31)%，高于對(duì)照組(1.74±0.37)%，(P<0.05)，AIH活動(dòng)期肝組織PD-1為(15.68±6.31)%，高于緩解期(6.24±3.25)%，(P<0.05)。AIH患者肝組織PD-L1為(7.45±4.29)%，高于對(duì)照組(1.48±0.32)%，(P<0.05)；AIH活動(dòng)期肝組織PD-L1為(9.47±4.67)%，高于緩解期(4.78±2.43)%(均P<0.05)。結(jié)論 PD-1及其配體PD-L1在AIH患者肝組織中高表達(dá)，提示其可能參與了AIH的發(fā)病機(jī)制。

AIH；PD-1；PD-L1；肝組織；免疫組織化學(xué)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的慢性進(jìn)行性肝臟炎性疾病。多項(xiàng)證據(jù)表明，遺傳易感性、分子模型學(xué)說、自身反應(yīng)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷參與了自身免疫性肝損傷[1]。程序性細(xì)胞死亡因子1 (programmed cell death-l，PD-1)是CD28家族中新發(fā)現(xiàn)的傳導(dǎo)抑制信號(hào)的共刺激分子，與其配體(主要是PD-L1)具有負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，主要功能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化及分化[2]。PD-1/PD-L1通路可以誘導(dǎo)和維持外周組織的免疫耐受，對(duì)防止組織的過度炎性反應(yīng)以及自身免疫性疾病的發(fā)生具有積極作用，但其在AIH中的研究少有報(bào)道，且多局限于外周血PD-1及PD-L1，而肝臟是AIH免疫反應(yīng)的靶器官，因此，本研究通過檢測(cè)AIH患者肝組織中PD-1及PD-L1表達(dá)情況，探討其在AIH發(fā)生、發(fā)展中的作用，為AIH的免疫損傷及發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。

資料和方法

一、一般資料

選取2013年1月至2015年8月在福州市傳染病醫(yī)院就診的AIH患者43例，男4例，女39例，其中12例在免疫抑制劑治療后達(dá)到緩解，其余31例處于發(fā)病期未行免疫抑制劑治療。入選病例均經(jīng)肝臟活組織檢查并經(jīng)臨床確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2008年國(guó)際免疫性肝炎小組(IAIHG)提出的AIH 簡(jiǎn)化診斷積分系統(tǒng)及2010年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)(AASLD)更新的有關(guān)AIH的診斷和治療指南[3-4]。排除肝炎病毒感染、藥物性、酒精性和遺傳代謝性肝病等。激素治療前評(píng)分≥15分明確診斷AIH。緩解是指癥狀消失，血清轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、IgG正常，肝組織正?；驘o活動(dòng)性肝硬化[5]。對(duì)照組取材來自手術(shù)切除肝血管瘤病灶附帶的正常周圍肝組織，均取得患者同意并簽署知情同意書。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、標(biāo)本收集及實(shí)驗(yàn)方法

(一)肝組織標(biāo)本采集和處理 患者均于入院病情穩(wěn)定后在超聲引導(dǎo)下，采用巴德BARD一次性全自動(dòng)活檢槍(購(gòu)自美國(guó)巴德公司，型號(hào)MN1620)。肝組織標(biāo)本長(zhǎng)度2.0 cm左右，匯管區(qū)數(shù)≥8個(gè)，4%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡多視野觀察。肝組織均由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片。PD-1及表達(dá)水平檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)卵白素-生物素-酶復(fù)合物染色法(ABC)，PD-l抗體(購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，為山羊抗人多克隆抗體；PD-L1抗體(購(gòu)自美國(guó)life spanbiosciences公司)，為兔抗人多克隆抗體，按試劑盒說明書進(jìn)行。免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

(二)肝組織PD-1/PD-L1表達(dá)的檢測(cè)和判定 采用ABC法檢測(cè)PD-1及PD-L1，表達(dá)的工作濃度為1∶200，切片厚度4 μm，3%H2O2作用5 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，分別加入兔抗人PD-1多克隆抗體，4 ℃過夜，次晨分別加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：陽性結(jié)果呈棕黃色顆粒，位于肝細(xì)胞胞膜(或)及胞質(zhì)，胞核呈淺藍(lán)色。

(三)圖像分析及定量方法 每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，應(yīng)用HPIAS 1000圖像分析儀，檢測(cè)肝組織PD-1/PD-L1蛋白表達(dá)的平均吸光度值(MOD)與積分吸光度值(IOD)，以每例5個(gè)視野的平均值作為測(cè)量值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布的兩組組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的兩組組間比較采用秩和檢驗(yàn)；方差齊則對(duì)多樣本資料采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)比較組間差異，方差不齊則采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的一般情況

43例AIH患者，其中31例為活動(dòng)期患者，男性3例，女性28例，平均年齡(47.2±12.4) 歲；12例為免疫抑制劑治療后緩解期患者，男1例、女11例，平均年齡(48.6±11.8) 歲?；顒?dòng)期患者表現(xiàn)為肝功能不同程度異常、IgG水平增高，外周血出現(xiàn)多種自身抗體陽性，緩解期AIH患者肝功能及IgG水平均恢復(fù)正常，但外周血中自身抗體陽性比例與活動(dòng)期相似，且滴度較活動(dòng)期無明顯變化(見表1、表2)。

表1 AIH患者肝功能及免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果

TBil：總膽紅素；DBil：直接膽紅素；ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；GGT：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；ALP：堿性磷酸酶；GLO：球蛋白；IgG：免疫球蛋白G；IgA：免疫球蛋白A；IgM：免疫球蛋白M

表2 AIH患者自身免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

ANA：抗核抗體；AMA：抗線粒體抗體；SMA：抗平滑肌抗體；抗SLA/LP：抗可溶肝抗原/肝胰抗體

二、AIH患者肝臟組織病理學(xué)改變

AIH以肝實(shí)質(zhì)損傷為主要表現(xiàn)，31例活動(dòng)期AIH患者以界面性肝炎和匯管區(qū)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，且大部分肝小葉內(nèi)可見點(diǎn)狀或碎屑樣壞死，多數(shù)不累及膽管。界面性肝炎29例(93.5% )，淋巴、漿細(xì)胞浸潤(rùn)27例(87.1% )，膽管破壞性炎癥2例(6.45% )(見圖1)。12例緩解期患者匯管區(qū)及小葉間隔周圍肝細(xì)胞均無明顯壞死，無或僅有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無界面性炎，亦未見橋接壞死。此外，幾乎所有AIH都存在不同程度的纖維化，嚴(yán)重病例可出現(xiàn)肝硬化。

三、PD-1在肝組織中的表達(dá)情況

肝組織切片中PD-1主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞(包括T細(xì)胞、少量漿細(xì)胞)及一些庫(kù)普弗細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，不同炎癥及纖維化程度的肝組織中PD-1陽性表達(dá)細(xì)胞的分布較一致，主要分布在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的匯管區(qū)及壞死區(qū)，以匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較多處較為顯著，肝細(xì)胞中未見表達(dá)。PD-1在對(duì)照組中無表達(dá)或極弱陽性表達(dá)(見圖2～4)。定量圖像分析結(jié)果顯示AIH患者肝組織PD-1為(10.12±5.31)%，高于對(duì)照組(1.74±0.37)%(P<0.05)；AIH活動(dòng)期肝組織PD-1為(15.68±6.31)%，高于緩解期(6.24±3.25)%，(P<0.05)。

四、PD-L1在肝組織中的表達(dá)情況

所有43例AIH患者的PD-L1在肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯的區(qū)域部分肝細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)均有著色。AIH活動(dòng)期患者在肝組織匯管區(qū)、小葉肝竇內(nèi)沿肝細(xì)胞竇側(cè)及炎性壞死區(qū)可見到較明顯PD-L1表達(dá)，常伴有淋巴細(xì)胞包繞及密切接觸，并沿肝板在肝竇壁、壞死灶呈放射狀分布，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯的區(qū)域部分肝細(xì)胞胞質(zhì)亦有著色，陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加；治療后緩解組肝組織可見少量PD-L1表達(dá)，陽性細(xì)胞散在分布，可表達(dá)于匯管區(qū)，同時(shí)在小葉肝竇內(nèi)沿肝細(xì)胞竇側(cè)及炎性壞死區(qū)有少量表達(dá)。PD-L1在對(duì)照組中無表達(dá)或極弱陽性表達(dá)(見圖5～7)。定量圖像分析結(jié)果顯示AIH患者肝組織PD-L1為(7.45±4.29)%，高于對(duì)照組(1.48±0.32)%，(P<0.05)；AIH活動(dòng)期肝組織PD-L1為(9.47±4.67)%，高于緩解期(4.78±2.43)%(均P<0.05)。

注：圖1為HE染色，×100；圖2～7均為ABC法，×400。圖1 活動(dòng)期AIH患者肝組織，圖2 PD-1在活動(dòng)期AIH患者肝組織中的表達(dá)，圖3 PD-1在靜止期AIH患者肝組織中的表達(dá)，圖4 PD-1在對(duì)照組肝組織中的表達(dá)，圖5 PD-L1在活動(dòng)期AIH患者肝組織中的表達(dá)，圖6 PD-L1在靜止期AIH患者肝組織中的表達(dá)，圖7 PD-L1在對(duì)照組肝組織中的表達(dá)

討 論

AIH是一種免疫介導(dǎo)的肝損傷，以肝組織內(nèi)T細(xì)胞浸潤(rùn)、高γ球蛋白血癥、血清自身抗體陽性、具有人類白細(xì)胞抗原遺傳背景、常伴發(fā)其他自身免疫性疾病和對(duì)免疫抑制治療有效為特征[6]。目前盡管AIH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已明確自身免疫異常是AIH發(fā)病的主要原因。自身免疫異常通常指正常的免疫系統(tǒng)由于某種原因而出現(xiàn)免疫功能紊亂，會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的包括AIH在內(nèi)的多種自身免疫異常疾病。

PD-1作為CD28家族分子之一，屬于免疫細(xì)胞的抑制性共刺激分子，在免疫反應(yīng)特別是T細(xì)胞免疫反應(yīng)中具有重要作用。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，通過其胞質(zhì)尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM基序)傳入抑制信號(hào)，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[7]。PD-1/PD-L1通路抑制了免疫應(yīng)答的初始與效應(yīng)階段，維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)，否則過強(qiáng)的免疫應(yīng)答將導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[9]。在許多自身免疫病動(dòng)物模型如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性糖尿病等動(dòng)物，阻斷PD-1/PD-L1通路則加速疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展。PD-1基因敲除的小鼠出生3 d后給予切除胸腺，小鼠可發(fā)展為自身免疫性肝炎[8-9]，且在自身免疫性肝炎動(dòng)物模型中，肝組織內(nèi)PD-1的mRNA與蛋白含量表達(dá)增高[10-11]。在肝組織內(nèi)PD-L1可表達(dá)于肝細(xì)胞、竇上皮細(xì)胞及庫(kù)普弗細(xì)胞上，對(duì)活化T細(xì)胞的增殖和分裂有抑制作用，在活化的T細(xì)胞或者在病毒感染期，PD-L1的表達(dá)能力升高，表達(dá)于肝細(xì)胞上的PD-L1與表達(dá)于T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合能誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡[12]。PD-L1基因敲除小鼠的CD8+T細(xì)胞大量聚集在肝內(nèi)，活化T細(xì)胞在肝內(nèi)的清除率下降，AIH的發(fā)病率上升[13]。

本研究證實(shí)，AIH患者肝組織病理學(xué)特征為肝實(shí)質(zhì)破壞的界面性肝炎，提示存在針對(duì)匯管區(qū)肝界板及周圍肝細(xì)胞的特異性免疫攻擊。本研究還發(fā)現(xiàn)AIH患者肝組織內(nèi)的所有匯管區(qū)均有明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了AIH患者肝組織發(fā)生主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致了持續(xù)的肝細(xì)胞炎性損傷[14]。同時(shí)，本研究表明PD-1在活動(dòng)期AIH患者表達(dá)增高，間接反映了肝內(nèi)浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞已被激活，發(fā)揮生物學(xué)功能。此外，在活動(dòng)期AIH患者PD-L1的表達(dá)水平亦升高，表明其與PD-1結(jié)合可抑制T細(xì)胞的活化，調(diào)控肝臟浸潤(rùn)效應(yīng)性T細(xì)胞的功能，阻止過度的免疫反應(yīng)，從而部分程度上避免了自身反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)肝臟的破壞作用。研究還發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1的相互作用雖然可以起到自身免疫反饋抑制作用，但由于表達(dá)PD-L1的肝組織細(xì)胞數(shù)量較少，PD-L1的升高并不與PD-1平行。由此推測(cè)，PD-1/PD-L1通路并不能有效控制活化T細(xì)胞增殖分化的速度與強(qiáng)度，肝臟中PD-1/PD-L1通路調(diào)控失常，最終導(dǎo)致了AIH的發(fā)展。如果有藥物或其他細(xì)胞、分子等物質(zhì)上調(diào)PD-L1的表達(dá)，促進(jìn)PD-1與PD-L1的相互作用，達(dá)到一定程度后，可能會(huì)加速活化的T細(xì)胞凋亡，從而起到治療AIH的作用。因此，對(duì)PD-1/PD-L1通路的干預(yù)可能為治療自身免疫性肝炎提供一種新的思路。

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(本文編輯：錢燕)

Expressions of PD and PD-L 1 in liver tissues of patients with autoimmune hepatitis and their clinic correlation

KEKun-yu,WEIDa-hai,CHENLi-fang,KONGJin-feng,SUNFang,XIONGKe-gong.

Departmentofliver,TheinfectiousdiseasehospitalofFujianmedicaluniversity,Fuzhou350012,China

Correspondingauthor:XIONGKe-gong,Emal: 510768115@qq.com

Objective To investigate the expressions of programmed death 1 (PD-1) and programmed death ligand 1 (PD-L1) in hepatic tissues of patients with autoimmune hepatitis (AIH), and to explore their roles in the pathogenesis of AIH. Methods The expressions of PD-1 and PD-L1 in hepatic tissues from 43 AIH patients and 9 healthy controls were detected by immunohistochemistry combined with computer image quantitative analysis. Results The PD-1 and PD-L1 expressions in hepatic tissues of AIH patients were 10.12±5.31% and 7.45±4.29%, respectively, which were significantly higher than those in controls (1.74±0.37% and 1.48±0.32%, respectively). The expressions of PD-1 and PD-L1 in hepatic tissues of AIH patients at active stage were 15.68±6.31% and 7.45±4.29%, respectively, which were higher than those in AIH patients in remission (6.24±3.25% and 4.78±2.43%, respectively) and healthy controls (1.74±0.37% and 1.48±0.32%, respectively). Conclusion PD-1 and PD-L1 are overexpressed in hepatic tissues of AIH patients, which reveals that PD-1 and its ligand might play an important role in the pathogenesis of AIH.

AIH; PD-1; PD-L1; Liver tissues; Immunohistochemistry

福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-S-w21)

350025 福州 福州市傳染病醫(yī)院(福建醫(yī)科大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院)肝病區(qū)

熊克宮，Email:510768115@qq.com

2016-06-28)