張清珍 黃鷹

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023）

粟酒裂殖酵母中Shy1定位及功能的研究

張清珍 黃鷹

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023）

旨在揭示芽殖酵母線粒體蛋白SHY1（YGR112W）在粟酒裂殖酵母中同源蛋白Shy1的功能。借助基因敲除方法獲得shy1基因缺失菌株獲Δshy1，并觀察其在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長表型；生物信息學(xué)分析顯示粟酒裂殖酵母Shy1在N端含有大概30個(gè)氨基酸的線粒體定位序列（MTS），為進(jìn)一步確定Shy1蛋白的定位，借助nmt1啟動(dòng)子調(diào)控下的Shy1蛋白C端GFP熒光標(biāo)記，觀察GFP綠色熒光位置。最后利用Western blotting檢測shy1的缺失對(duì)線粒體蛋白的影響。研究結(jié)果表明，shy1基因缺失菌株在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出生長缺陷，是線粒體呼吸缺陷型菌株；當(dāng)GFP標(biāo)記于nmt1啟動(dòng)子調(diào)控下的Shy1蛋白C端時(shí)，綠色熒光觀察確定Shy1蛋白定位在線粒體；Western blotting檢測結(jié)果顯示shy1缺失導(dǎo)致線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)量明顯下降；結(jié)果表明，粟酒裂殖酵母Shy1定位于線粒體且是線粒體呼吸鏈正常發(fā)揮功能所必須的。

線粒體；粟酒裂殖酵母；Shy1；呼吸鏈

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸的主要場所，在細(xì)胞代謝旺盛的需能部位比較集中。線粒體主要功能是通過氧化磷酸化作用合成ATP，為細(xì)胞各種生理活動(dòng)提供能量，固有“細(xì)胞發(fā)電廠”之稱；同時(shí)線粒體

電子傳遞鏈的本質(zhì)作用是促進(jìn)天冬氨酸的合成［1，2］。線粒體是半自主細(xì)胞器，含有線粒體DNA，可以編碼構(gòu)成呼吸鏈復(fù)合物的若干亞基；具有獨(dú)立的遺傳體系，能夠進(jìn)行DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯。粟酒裂殖酵母的線粒體DNA編碼25種tRNA、8種mRNA、2種rRNA和一個(gè)rnpB［3］。所以，線粒體DNA的正常轉(zhuǎn)錄翻譯對(duì)于線粒體正常的執(zhí)行自身的功能具有十分重要的意義。

線粒體功能障礙會(huì)引起線粒體代謝酶的缺陷，導(dǎo)致ATP合成障礙、能量來源不足。許多研究表明，線粒體功能異常與帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、糖尿病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)［4-8］。線粒體的表達(dá)障礙直接導(dǎo)致各種各樣的疾病，如何治療線粒體疾病受到較大關(guān)注。

線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)異常是線粒體功能紊亂的主要原因，而線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)正是從整體角度，分析線粒體的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)等的動(dòng)態(tài)變化，旨在闡明線粒體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式，從而在蛋白質(zhì)水平探索線粒體生理功能和相關(guān)疾病的聯(lián)系。通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)可系統(tǒng)研究正常和病變組織中線粒體蛋白分布與表達(dá)的差異，從而為研究線粒體相關(guān)疾病的分子機(jī)制和以線粒體為靶標(biāo)的藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。近年來，人類基因組測序的完成、串級(jí)質(zhì)譜和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展加速了線粒體蛋白組學(xué)的研究。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展對(duì)線粒體相關(guān)疾病的研究起到了積極的推動(dòng)作用［9］。

Shy1是SURF家族的蛋白。酵母基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測shy1的缺失可能會(huì)導(dǎo)致線粒體表達(dá)障礙和Leigh綜合征。Leigh綜合征是由SURF1突變引起在嬰兒期嚴(yán)重的腦肌病。shy1在芽殖酵母里的同源基因SHY1，在芽殖酵母中已經(jīng)有人報(bào)道［10-12］。在芽殖酵母中，SHY1是哺乳動(dòng)物SURF1基因的酵母同源物，編碼呼吸所需要的線粒體蛋白質(zhì)。還有文獻(xiàn)報(bào)道，芽殖酵母Shy1是線粒體內(nèi)膜的不可或缺的組成部分，是酵母細(xì)胞色素c氧化酶的高效組裝所必須的。本研究旨在揭示粟酒裂殖酵母中同源蛋白Shy1的定位及相關(guān)功能。首先，通過生物信息學(xué)對(duì)粟酒裂殖酵母的線粒體信號(hào)肽進(jìn)行分析和觀察Shy1的GFP綠色熒光位置，確定Shy1的定位；為了研究粟酒裂殖酵母蛋白Shy1的功能，以單倍體酵母菌株yHL6381為出發(fā)菌株構(gòu)建shy1基因缺失突變株，研究shy1缺失菌株在非發(fā)酵性培養(yǎng)基上的生長狀況；最后，通過提取線粒體，利用Western blotting技術(shù)進(jìn)一步分析shy1的缺失對(duì)線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 E.coli Top10、粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381（h+，his3-D1，leu1-32，ura4-D18，ade6-M210）、pFA6a-KanMX6、pYJ19又稱（pJK148-nmt1new-trz1-gfp）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉10 g/L，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂，固體和液體培養(yǎng)基在需要時(shí)添加氨芐霉素至50 mg/L。YES培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，4種添加營養(yǎng)物（如ade，leu，ura，his）至終濃度為225 mg/L，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。YES+3%甘油：yeast extract 5 g/L，glycerol 3%，4種添加營養(yǎng)物（ade，leu，ura，his）至終濃度為225 mg/ L，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。YES+6%甘油：yeast extract 5 g/L，glycerol 6%，4種添加營養(yǎng)物（如ade，leu，ura，his）至終濃度為225 mg/L，固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。YES+KanMX抗性（KanMX是一種氨基苷類抗菌素衍生物，對(duì)真核細(xì)胞均有毒性作用，能阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成。KanMX用在酵母體系中，可擴(kuò)大篩選使用菌株的范圍，便于提高外源基因的表達(dá)產(chǎn)量）：每100 mL YES固體培養(yǎng)基+100 μL KanMX，KanMX的濃度為100 mg/mL；EMM（Edinburgh minimal medium）-leu培養(yǎng)基（g/L）：3 g鄰苯二甲酸氫鉀，5.55 g十二水合磷酸氫二鈉，5 g氯化銨，10 mL 100×salt stock，1 mL的1 000×vitamin，0.1 mL 10 000×mineral stock，20 g葡萄糖，3種添加營養(yǎng)物（如ade，ura，his）至終濃度為225 mg/L，葡萄糖分開滅菌，固體培養(yǎng)基加2.0%的瓊脂粉。

1.1.3 儀器與試劑 各種限制性內(nèi)切酶、solution I［kite code.6022］、rTaq DNA 聚合酶、PrimeSTAR DNA Polymerase、蛋白 marker、均購自TaKaRa公司；DNA割膠回收試劑盒、PCR過柱純化試劑盒購自博

爾迪公司；DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；氨芐霉素購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 粟酒裂殖酵母shy1基因序列來源于酵母基因組數(shù)據(jù)（S.pombe_GeneDB，http:// www.pombase.org/）；粟酒裂殖酵母Shy1的查找使用NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），芽殖酵母同源蛋白SHY1的查找使用SGD數(shù)據(jù)庫（http:// www.yeastgenome.org/）；用AlignX對(duì)所查到蛋白序列進(jìn)行Clustal W序列比對(duì)分析；線粒體信號(hào)肽預(yù)測分析采用MitoProt II（http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 Shy1-GFP融合蛋白的構(gòu)建：根據(jù)S.pombe_GeneDB數(shù)據(jù)庫中shy1（SPBC1215.01）的基因序列設(shè)計(jì)上下游引物：shy1-Pst I-up：5'-AACT GCAGATGTTTTGGTGGAAAAGTGCTACT-3'，shy1-Sal I-down：5'-ACGCGTCGACTAATCGTTTGTTGTTTAG AATCTTGC-3'（下劃線代表酶切位點(diǎn)）。以粟酒裂殖酵母yHL6381基因組為模板擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增條件為98℃ 2 min，98℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

構(gòu)建重組質(zhì)粒shy1-del-KanMX：根據(jù)shy1的基因序列設(shè)計(jì)上游同源臂和下游同源臂的引物：shy1-5-Sma I-up：5'-TCCCCCGGGGCATAAGTAGTGTGGG AGCAAG-3'，shy1-5-Bgl II-dw：5'-GAAGATCTGATA GACAGGAATCCAAGATTCAATCG-3'，shy1-3-Sac I-up：5'-CGAGCTCAAAATTTTCATATTTATAAGTTTCTAA ATATTATCTACC-3'，shy1-3-Spe I-dw：5'-GACTAGT CGATTATGAGAACTCCACGCCT-3'。擴(kuò)增條件和模板同上。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 純化的Shy1-GFP的擴(kuò)增片段和pYJ19空載質(zhì)粒，用Pst I和Sal I雙酶切、純化、酶連；將酶連產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行Pst I和Sal I雙酶切驗(yàn)證。酶切正確的重組質(zhì)粒委托南京思普金生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序。

重組質(zhì)粒shy1-del-KanMX構(gòu)建時(shí)，先構(gòu)建用上游同源臂，再構(gòu)建下游同源臂。上游同源臂所用酶切位點(diǎn)為Sma I和Bgl II，下游同源臂所用酶切位點(diǎn)Sac I和 Spe I。構(gòu)建及驗(yàn)證過程同上。

1.2.4 將目的片段轉(zhuǎn)入酵母菌株及菌種驗(yàn)證 將構(gòu)建好的Shy1-GFP重組質(zhì)粒用Nru I單切以獲得目的片段；以shy1-del-KanMX重組質(zhì)粒為模板，shy1-5-Sma I-up和shy1-3-Spe I-dw為引物PCR，擴(kuò)增出目的片段；經(jīng)過醋酸鋰轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌株中，通過同源重組的方式整合到酵母的基因組上。

熒光顯微鏡觀察驗(yàn)證shy1-gfp菌株。PCR驗(yàn)證Δshy1菌株：以粟酒裂殖酵母yHL6381（作為對(duì)照）和醋酸鋰轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，shy1-5-yz：5'-ATCACTGCAGTTAAGCGTCCTGAG-3'和 shy1-3-yz：5'-CAAGACAGCATA-GTAAACGGCG-3'為引物PCR，比較野生型菌株與Δshy擴(kuò)增片段的大小。

1.2.5 Δshy1在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長實(shí)驗(yàn) 將活化好的yHL6381、Δshy1的單菌落分別接種于10 mL的YES液體中，于30℃，220 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜；將種子液轉(zhuǎn)接至起始OD600為0.2左右，于30℃，220 r/min恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為1-2之間；收菌，水洗；調(diào)整初始OD600為3左右，10倍差異梯度稀釋，每個(gè)濃度各取3 μL點(diǎn)圈于YES、YES+3%甘油、YES+6%甘油培養(yǎng)基；30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，拍照。

1.2.6 熒光顯微鏡觀察Shy1的定位 挑取LiAc轉(zhuǎn)化子單菌落劃線于相應(yīng)的選擇性平板，挑取少量菌于EMM-leu液體中，轉(zhuǎn)接使起始OD600約0.2，培養(yǎng)6-8 h后，OD600約0.8到1之間，取1 mL菌液PBS洗細(xì)胞一次，最終懸浮于200 μL PBS（含有終濃度為2 nmol/L的染料）中，30℃，染色1-2 min，加入1 mL PBS 稀釋染料，離心棄上清，加入100 μL PBS，取3 μL用于顯微鏡觀察使用。制片后，利用 Zeiss Axio imager A1 microscope（Zeiss，Jena，Germany）進(jìn)行熒光觀察。先調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋再調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，在顯微鏡中找到細(xì)胞，并在DIC通道拍照，然后轉(zhuǎn)換顯微鏡至GFP通道（GFP 濾光片為Catalog No.41017），激發(fā)波長為488 nm，GFP信號(hào)通過Chroma（Brattleboro，VT）獲得，觀察熒光信號(hào)，并拍照，最后轉(zhuǎn)換顯微鏡至DsRed通道觀察紅色熒光信號(hào)，并拍照［13，14］。相機(jī)系統(tǒng)為Sensicam

QE cooled digital camera system（Cooke Corp）；圖像整合系統(tǒng)為MetaMorph/MetaFluor combination package analysis software（Uniwersal Imaging，West Chester，PA）；圖像后期處理使用Adobe Photoshop7.0（Adobe，San Jose，CA）。

1.2.7 Δshy1菌株中線粒體蛋白表達(dá)量的檢測 提取Δshy1、yHL6381菌株的線粒體［15，16］用于Western blotting檢測。處理線粒體的粗提液：線粒體蛋白Cox2、Cox4、內(nèi)參Hsp60，在100℃處理10 min，Cox1、Cob1、Cox3在45℃處理3 min。Western blotting檢測用ODDESSY進(jìn)行掃描顯色。本研究選擇線粒體基質(zhì)的蛋白Hsp60作為內(nèi)參，檢測線粒體相關(guān)蛋白Cox1、Cox2、Cox3、Cob1、Cox4的表達(dá)量，抗體及稀釋比例分別為anti-HSP60（1∶1 000），anti-Cox1（1∶1 000），anti-Cox2（1∶500），anti-Cox3（1∶400），anti-Cox4（1∶1 000）and anti-Cob1（1∶500）。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

重組質(zhì)粒Shy1-GFP的目的片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1-A）顯示，在750-1 000 bp之間且有單一、清晰的條帶，與目的基因873 bp相吻合；重組質(zhì)粒Shy1-GFP雙酶切，在750-1 000 bp之間有釋放片段，大小與PCR擴(kuò)增片段一致圖（1-B），酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序；重組質(zhì)粒shy1-del-KanMX上游同源臂和下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果（圖1-C），與目的片段大小634 bp和545 bp相吻合；重組質(zhì)粒shy1-del-KanMX上游同源臂酶切后釋放片段（黑色粗箭頭處）與PCR大小相符（圖1-D），進(jìn)行DNA測序；重組質(zhì)粒shy1-del-KanMX酶切后釋放片段（黑色粗箭頭處）大小相符（圖1-E），進(jìn)行DNA測序；即本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒Shy1-GFP和shy1-del-KanMX。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

2.2 菌株shy1-gfp和Δshy1的驗(yàn)證

由圖2-A可以看到綠色熒光，即菌株shy1-gfp構(gòu)建成功；PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖2-B）顯示，敲除菌株擴(kuò)增出目的基因比野生型菌株擴(kuò)增出目的基因大，說明shy1基因缺失突變株構(gòu)建成功。

圖2 菌株shy1-gfp和Δshy1的驗(yàn)證

2.3 粟酒裂殖酵母Shy1生物信息學(xué)分析

2.3.1 SpShy1的同源性分析 通過在GeneDB和NCBI數(shù)據(jù)庫的搜索，得到裂殖酵母shy1基因序列，其系統(tǒng)名為SPBC1215.01。Shy1蛋白由290個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測的分子量約為33.38 kD（圖3）。

圖3 芽殖酵母SHY1和裂殖酵母Shy1的蛋白序列比對(duì)

2.3.2 SpShy1p的定位于線粒體的信號(hào)肽（MTS）分析 借助在線工具M(jìn)itoProt II對(duì)Shy1含有定位于線粒體的信號(hào)肽的可能性進(jìn)行分析。通過MitoProt II的預(yù)測，SpShy1p存在定位于線粒體概率為82.07%。實(shí)驗(yàn)已證明，對(duì)已知定位于線粒體的信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果大于76%［17］，可以確定SpShy1p中含有定位于線粒體的信號(hào)肽。根據(jù)預(yù)測結(jié)果（表1），SpShy1p定位于線粒體的信號(hào)肽為其N端的30 aa殘基，具體序列為：MFWWKSATKFTFSKRGPCVFRYLSTLEGTT。

根據(jù)預(yù)測結(jié)果（表1），可以得知靶向序列中

含有12個(gè)堿性殘基和1個(gè)酸性殘基，Shy1在細(xì)胞質(zhì)合成后，運(yùn)往線粒體的過程中，在第31為氨基酸處切割，線粒體信號(hào)肽不進(jìn)入線粒體；線粒體的信號(hào)肽為其N端的30 aa殘基，具體序列為：MFWWKSATKFTFSKRGPCVFRYLSTLEGTT，Shy1輸入線粒體的概率為82.07%。

表1 Shy1的線粒體定位信號(hào)肽MitoProt II分析結(jié)果

2.4 shy1的缺失導(dǎo)致在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長缺陷

為了確定Shy1在粟酒裂殖酵母中的功能，本實(shí)驗(yàn)研究了shy1基因缺失突變株在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，與yHL6381的生長情況相比，在以葡萄糖為碳源的YES培養(yǎng)基上，shy1基因缺失突變株和yHL6381生長狀況基本一致；而在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵性培養(yǎng)基上，shy1基因缺失突變株生長受損，表現(xiàn)出明顯的呼吸缺陷。說明Δshy1是呼吸缺陷菌株，即shy1的缺失影響粟酒裂殖酵母線粒體功能的正常發(fā)揮。

圖4 Δshy1在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況

2.5 熒光顯微鏡觀察Shy1-GFP定位在線粒體

生物信息學(xué)分析可知，Shy1含有線粒體的信號(hào)肽的概率高達(dá)82.07%。為了進(jìn)一步確定Shy1的定位，用線粒體示蹤染料來標(biāo)記線粒體的位置，作為線粒體的Marker。熒光顯微鏡觀察可以看到紅色熒光；含有綠色熒光標(biāo)簽的shy1-gfp菌株在熒光顯微鏡觀察下呈現(xiàn)綠色熒光。如圖5所示，同一視野下的綠色熒光和紅色熒光可以重疊，Shy1與線粒體共定位，即Shy1定位于線粒體。

圖5 shy1-gfp的熒光顯微鏡觀察

2.6 shy1的缺失導(dǎo)致線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)量下降

由已取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，shy1缺失菌株在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上生長明顯受損，影響粟酒裂殖酵母線粒體功能的正常發(fā)揮。為了探究這種受損的原因，在實(shí)驗(yàn)室已有實(shí)驗(yàn)條件的前提下，通過Western blotting分析線粒體復(fù)合體中部分亞基的含量。Cox1、Cox2、Cox3參與組成呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ，Cob1則參與組成呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ，這些都屬于線粒體自身編碼的蛋白，Cox4是由核編碼定位于線粒體的蛋白。

與野生型菌株yHL6381相比，Δshy1菌株中Cox1、Cox2、Cox3 、Cox4、Cob1蛋白在線粒體中的含量明顯降低（圖6），即shy1的缺失導(dǎo)致線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白的表達(dá)量顯著降低。這些蛋白表達(dá)量的下降使得線粒體呼吸鏈功能嚴(yán)重受損，這也就解釋了Δshy1缺失突變體在非發(fā)酵碳源培養(yǎng)基上不能正常生長的原因。總之，shy1的缺失導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物的合成缺陷，使得線粒體呼吸鏈功能嚴(yán)重受損。

圖6 Western Blot檢測Δshy1線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)量

3 討論

根據(jù)人類的基因圖譜，估計(jì)大約有1 000-2 000種線粒體蛋白，大約有600多種已經(jīng)被鑒定出來。線粒體蛋白質(zhì)只有2%是線粒體自己合成的，98%的線粒體蛋白質(zhì)是由細(xì)胞核編碼、細(xì)胞質(zhì)核糖體合成后運(yùn)往線粒體的；粟酒裂殖酵母線粒體中含有300多個(gè)蛋白，其中有8個(gè)蛋白由線粒體基因組編碼的，其他的也均由細(xì)胞核基因組編碼。線粒體的蛋白質(zhì)參與機(jī)體許多生理、病理過程，線粒體蛋白質(zhì)的研究日益受到關(guān)注。

利用突變體進(jìn)行基因功能研究是經(jīng)典遺傳學(xué)的重要方法，在粟酒裂殖酵母中經(jīng)典的基因敲除方法是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的。它克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳，并進(jìn)一步推測被替代基因功能的方法。為了研究Shy1的結(jié)構(gòu)與功能，本研究首先獲得了shy1基因缺失菌株。

特定基因的突變往往導(dǎo)致酵母菌株表型的變化，根據(jù)表型變化確定基因功能是檢測基因功能最直接的方法之一。對(duì)于酵母而言，存在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵型培養(yǎng)基和以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基涉及線粒體的功能差異，發(fā)酵型不需要呼吸作用，非發(fā)酵的需要呼吸作用，即發(fā)酵型不依賴線粒體，而非發(fā)酵的需要線粒體功能的正常發(fā)揮［18］。首先構(gòu)建shy1基因缺失菌株，在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基上表現(xiàn)出明顯的生長缺陷。在以甘油為唯一碳源的情況下，細(xì)胞不能進(jìn)行糖酵解過程只能通過線粒體進(jìn)行呼吸作用，但是敲除菌由于線粒體受損不能正常利用甘油進(jìn)行三羧酸循環(huán)為細(xì)胞提供能量，最終導(dǎo)致在甘油培養(yǎng)基上不能正常生長。

線粒體呼吸鏈主要由線粒體呼吸鏈酶，包括NADH脫氫酶（也稱為復(fù)合物I）、琥珀酸氧化還原酶（也稱為復(fù)合物II）、細(xì)胞色素c還原酶（復(fù)合物III）、細(xì)胞色素c氧化酶（也稱為復(fù)合物IV）和ATP合成酶（也稱為復(fù)合物V）組成。Cob1由復(fù)合物III編碼，Cox1、Cox2、Cox3由復(fù)合物IV編碼，

而Atp6、Atp8、Atp9則由復(fù)合物V編碼。線粒體呼吸鏈酶的作用為通過一系列的氧化還原過程最終形成ATP，為肌體組織提供能量。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物缺陷是導(dǎo)致線粒體病的重要原因。細(xì)胞色素氧化酶基因上的缺陷，包括突變，能夠?qū)е聡?yán)重的常常甚至是致命的代謝紊亂［19-21］。這種紊亂通常出現(xiàn)在幼兒時(shí)代的早期，并且主要影響需要高能量的組織器官（腦、心臟、肌肉）。在許多分級(jí)的線粒體疾病中，與細(xì)胞色素氧化酶組裝缺陷的疾病被認(rèn)為是最嚴(yán)重的。在shy1基因缺失菌株中，線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白Cox1、Cox2、Cox3、Cob1、Cox4的表達(dá)量下降，即shy1的缺失破壞了線粒體呼吸鏈的功能。

根據(jù)序列比對(duì)，裂殖酵母Shy1和芽殖酵母中同源蛋白SHY1有一定的同源性，且具有芽殖酵母的功能保守位點(diǎn)，即第137位的G和344位的Y。在芽殖酵母里，這兩個(gè)功能位點(diǎn)影響復(fù)合物的組裝；這兩個(gè)位點(diǎn)突變后，線粒體呼吸鏈復(fù)合體不能正常組裝，導(dǎo)致呼吸受損。在裂殖酵母中，初步推測Shy1具有類似芽殖酵母Shy1的功能，即參與線粒體呼吸鏈復(fù)合體的正常組裝。因而，shy1的缺失導(dǎo)致在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基上生長缺陷和線粒體蛋白表達(dá)的下降。

4 結(jié)論

粟酒裂殖酵母shy1基因大小為873 bp，共編碼290個(gè)氨基酸。本文主要研究的為芽殖酵母同源蛋白SHY1的同源Shy1，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩者的同源性為36%。線粒體信號(hào)肽分析和GFP熒光觀察，最終確定Shy1是一個(gè)定位于線粒體的蛋白。同時(shí)，在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵型培養(yǎng)基上shy1缺陷菌株表現(xiàn)出明顯的生長缺陷，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)這種呼吸呼吸受損影響的生長缺陷是由于Shy1缺失導(dǎo)致線粒體呼吸復(fù)合體不能正常組裝，目前證明復(fù)合物VI的部分亞基包括Cox1、Cox2、Cox3、復(fù)合物III的Cob1、細(xì)胞核編碼的蛋白Cox4的含量都發(fā)生明顯的減少，最終導(dǎo)致線粒體呼吸不能正常進(jìn)行而引發(fā)在甘油培養(yǎng)基上生長缺陷。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Study on the Localization and Function of Shy1 in Schizosaccharomyces pombe

ZHANG Qing-zhen HUANG Ying
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023）

Mitochondria are the main place for cell respiration，and mitochondrial dysfunction causes various human diseases. Here we aimed to explore the function of the Schizosaccharomyces cerevisiae mitochondrial protein SHY1（YGR112W）in homologous protein Shy1 of Schizosaccharomyces pombe. Firstly，we generated the strain Δshy1 of shy1 gene deletion by gene knockout，and examined its phenotype in the non-fermentation medium with glycerol as the sole carbon source. Then，bioinformatics analyses revealed that Shy1 of S. pombe contained the conserved MTS（mitochondrial targeting sequence）of about 30 amino acids at the N-terminus. To further study the localization of Shy1，the location of green fluorescent protein（GFP）was observed by labeling GFP at the C-terminus of Shy1 protein regulated by the nmt1 promoter. Lastly，we detected the influence of the deletion of shy1 on the expression of mitochondrial protein by Western blotting. The results demonstrated that the strain of shy1 gene deletion presented its growing deletion in the non-fermentation medium with glycerol as the sole carbon source，and was one with mitochondrial respiratory defect. When GFP was labeled at the C terminus of Shy1 protein regulated by the nmt1 promoter，the location of Shy1 protein was in the mitochondria as the green fluorescence was observed. Moreover，the results of Western blotting revealed that the expression of protein related to mitochondria resulted from the shy1 gene deletion was dramatically declined. Therefore，these findings indicate that Shy1 is localized in mitochondria and is obligatory for mitochondrial respiratory chain to play ordinary function in S. pombe.

mitochondria；Schizosaccharomyce pombe；Shy1；respiratory chain

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.027

2016-05-17

張清珍，女，碩士研究生，研究方向：線粒體蛋白結(jié)果與功能；E-mail：809777459@qq.com

黃鷹，男，教授，研究方向：微生物生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：hy464576900@163.com