李春川 潘孝明 王靜 董平 李敬 梁興國(guó)

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

反向重復(fù)序列DNA的PCR擴(kuò)增特性研究

李春川 潘孝明 王靜 董平 李敬 梁興國(guó)

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266003）

旨在研究反向重復(fù)序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)模板擴(kuò)增的影響。研究DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部大小、莖部長(zhǎng)度、引物相對(duì)于莖部位置等對(duì)PCR擴(kuò)增效率的影響，探討如何通過(guò)引物設(shè)計(jì)及改變退火溫度等條件來(lái)實(shí)現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA的有效擴(kuò)增的方法。結(jié)果顯示，如果引物的位置同發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部5'序列相同或部分相同，則由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成阻礙引物與模板結(jié)合而對(duì)PCR產(chǎn)生抑制作用，并且抑制作用隨著莖部長(zhǎng)度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)環(huán)部的長(zhǎng)度達(dá)到50 nt以上時(shí)，抑制作用明顯減弱。較高的退火溫度和引物濃度都有助于引物同分子內(nèi)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭(zhēng)，使PCR擴(kuò)增更容易進(jìn)行。

發(fā)卡結(jié)構(gòu)；PCR擴(kuò)增；反向重復(fù)序列

隨著人類基因組計(jì)劃（Human genome project，HGP）的完成以及高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展完善，眾多生物的基因組信息得以確定。在分析基因組序列過(guò)程中，大量的重復(fù)序列的發(fā)現(xiàn)引起了科研工作人員的重視，其多樣性和廣泛性［1-3］也得到了越來(lái)越多的研究。重復(fù)序列是指基因組中不同位置出現(xiàn)的相同或?qū)ΨQ性片段，其中，反向重復(fù)列（Inverted repeat，簡(jiǎn)稱IR）是指同一DNA鏈內(nèi)下游存在著與上游某一段序列互補(bǔ)的序列，是重復(fù)序列中一類具有生物學(xué)意義的序列［4］，其特點(diǎn)是可形成具有雙螺

旋莖部和單鏈環(huán)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，即在同一條DNA鏈內(nèi)堿基發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)形成DNA雙螺旋的莖部，而兩個(gè)反向重復(fù)序列單元之間的序列形成單鏈的環(huán)部。反向重復(fù)序列在真核和原核生物基因組中廣泛存在［5］，并且在生物體中具有多種功能［6］，如與真核病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)有關(guān)［7，8］，參與調(diào)控基因的表達(dá)，能夠終止原核生物的轉(zhuǎn)錄［9］等；同時(shí)也是生物體基因組不穩(wěn)定的原因之一［10-13］。長(zhǎng)的回文序列與基因擴(kuò)增［14，15］和減數(shù)分裂中基因重組［16，17］有密切聯(lián)系。另外，DNA雙鏈中的反向重復(fù)序列在體外［18］和體內(nèi)［19］都可形成十字形結(jié)構(gòu)（Cruciform structure），該在基因的復(fù)制［20］以及生物體正常和病理［21，22］的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。有研究表明，DNA雙鏈中反向重復(fù)序列之間間隔堿基小于5 nt時(shí)，負(fù)超螺旋帶來(lái)的拓?fù)鋸埩墒怪纬墒中谓Y(jié)構(gòu)［23］。形成這些高級(jí)結(jié)構(gòu)的難易程度除與間隔序列的長(zhǎng)短和序列有關(guān)外，還與反向重復(fù)序列本身的長(zhǎng)短和GC含量有關(guān)。

在研究生物體基因組中反向重復(fù)序列時(shí)，需要大量的模板，通常獲得大量模板的常規(guī)方法是PCR擴(kuò)增，而以具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列作為模板時(shí)，分子內(nèi)部的雜交會(huì)對(duì)PCR引物的結(jié)合產(chǎn)生影響，使擴(kuò)增效率降低（圖1），這一問(wèn)題容易被忽視，且缺乏相關(guān)研究進(jìn)行指導(dǎo)。針對(duì)具有反向重復(fù)序列的模板，如果能通過(guò)設(shè)計(jì)引物使其順利擴(kuò)增，這將會(huì)拓展PCR的應(yīng)用范圍。因此，本文深入研究了發(fā)卡結(jié)構(gòu)的環(huán)部大小、莖部長(zhǎng)度、引物相對(duì)于莖部的位置等對(duì)PCR的影響，旨在探討通過(guò)引物設(shè)計(jì)及改變退火溫度等條件來(lái)實(shí)現(xiàn)目的模板有效擴(kuò)增的方法。

圖1 反向重復(fù)序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)示意圖

1 材料與方法

1.1 材料

所有寡核苷酸序列均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；DreamTaq DNA聚合酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；dNTPs購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。Life-express 熱循環(huán)儀為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器 廠； Molecular imager Gel Doc XR+ imaging system型凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，PikoReal熒光定量PCR儀購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 具有不同環(huán)部長(zhǎng)度的發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的PCR擴(kuò)增 所用模板和引物分別在表1、表2中，以發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)25 bp、環(huán)部長(zhǎng)度分別為72、62、52、42、32、22 和12 nt的DNA發(fā)卡序列H25S-72L、H25S-62L、H25S-52L、H25S-42L、H25S-32L、H25S-22L和H25S-12L為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以P1（與發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部完全互補(bǔ)）作為引物，擴(kuò)增示意圖如圖2；同時(shí)以長(zhǎng)度相同、不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的線性模板N25S-72L、N25S-62L、N25S-52L、N25S-42L和N25S-32L、N25S-22L和N25S-12L作為對(duì)照，以P1和P3作為引物對(duì)。考察發(fā)卡結(jié)構(gòu)中不同環(huán)部長(zhǎng)度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）中含有1×的Dream-Taq Buffer（2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）），0.5 U DreamTaq DNA 聚合酶，0.6 μmol/L引物，200 μmol/L dNTPs，模板拷貝數(shù)為106。

反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳1 h，EB染色15 min后，置于凝膠成像儀上成像。

1.2.2 具有不同莖長(zhǎng)度的發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的PCR擴(kuò)增 以發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度為52 nt，莖部長(zhǎng)度分別為20 bp、15 bp、10 bp DNA發(fā)卡序列H20S-52L、H15S-52L、H10S-52L（表2）為模板，分別以P1和P2、P1和P4、P1和P5作為引物（表3），擴(kuò)增示意圖如圖3；以長(zhǎng)度相同、不含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的線性模

板N20S-52L、N15S-52L、N10S-52L作為對(duì)照，分別以P2和P3、P3和P4、P3和P5作為引物對(duì)，考察發(fā)卡結(jié)構(gòu)中不同莖部長(zhǎng)度對(duì)模板擴(kuò)增的影響。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.1。

表1 探究發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度對(duì)PCR擴(kuò)增影響所用模板

表2 本研究使用的其他模板

1.2.3 引物位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖外側(cè)時(shí)模板的擴(kuò)增

以長(zhǎng)度為102 bp，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的環(huán)部長(zhǎng)度10 nt，莖部長(zhǎng)度為20 bp以及莖部?jī)啥烁?6 nt游離端的序列H20S-10L為模板（表2），以P3和P6（表3）作為引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，引物與游離端部分互補(bǔ)，擴(kuò)增示意圖如圖4。以長(zhǎng)度相同、不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列N25S-52L作為對(duì)照，以P1和P3作為引物對(duì)。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.1。

表3 本研究所使用的引物序列

1.2.4 不同擴(kuò)增反應(yīng)條件下發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增

1.2.4.1 不同退火溫度下發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增 以

發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度25 bp，環(huán)部長(zhǎng)度分別為52、42和32 nt的DNA發(fā)卡序列H25S-52L、H25S-42L、H25S-32L為模板，以P1作為引物；同時(shí)以長(zhǎng)度相同、不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的N25S-52L、N25S-42L和N25S-32L的序列作為對(duì)照，以P1和P3作為引物對(duì)，進(jìn)行梯度退火PCR反應(yīng)，退火溫度設(shè)置為63℃、60℃和 57℃，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.1。

圖2 具有發(fā)卡夾結(jié)構(gòu)模板的PCR示意圖

圖3 不同莖部長(zhǎng)度模板擴(kuò)增示意圖

圖4 引物處于莖兩端游離端時(shí)模板擴(kuò)增過(guò)程

1.2.4.2 不同引物濃度下發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增 以發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度25 bp，環(huán)部長(zhǎng)度為52 nt的DNA序列H25S-52L為模板，同時(shí)以長(zhǎng)度相同、不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA序列N25S-52L作為對(duì)照進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物濃度設(shè)置為0.6 μmol/L、0.1 μmol/L、0.05 μmol/L，其他PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.1。1.2.5 部分發(fā)卡結(jié)構(gòu)熔點(diǎn)的測(cè)定 檢測(cè)S-25L和S-25R、S-20L和S-20R、S-15L和S-15R合成的雙鏈的熔點(diǎn)；檢測(cè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度為20 bp，環(huán)部長(zhǎng)度分別為20、30和50 nt的DNA序列H20S-20L、H20S-30L、H20S-50L的熔點(diǎn)；檢測(cè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度分別為25 bp、20 bp、15 bp序列H25S-32L、H20S-42L、H15S-52L的熔點(diǎn)。

熔點(diǎn)檢測(cè)體系（10 μL）：1×EvaGreen，1×DreamTaq Buffer，200 μmol/L dNTPs，500 nmol/L的DNA。檢測(cè)條件：首先95℃加熱3 min對(duì)DNA序列進(jìn)行充分變性；然后以0.1℃/s緩慢降溫至20℃以形成其最適結(jié)構(gòu)，此時(shí)熒光染料EvaGreen與DNA充分結(jié)合并釋放最大熒光；隨后緩慢升溫至95℃進(jìn)行DNA序列的熔解，該過(guò)程中每升高0.1℃進(jìn)行熒光信號(hào)收集，獲得體系隨溫度變化的熒光熔解曲線。采用Piko Real Software 2.1對(duì)熒光熔解曲線進(jìn)行微分運(yùn)算處理（-d（RFU）/dT，即熒光強(qiáng)度相對(duì)溫度的一階微分運(yùn)算的負(fù)數(shù)），獲得熒光微分曲線和序列相應(yīng)的熔點(diǎn)。

1.2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物定量及顯著性分析 利用Molecular imager Gel Doc XR+ imaging system對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，以ladder中已知質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)條帶作為參照，對(duì)電泳圖中各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物定量后的數(shù)據(jù)經(jīng)Tukey's檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。所有數(shù)據(jù)以±s表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)，定為差異顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用SPSS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

由圖5可知，不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板都得到較好的擴(kuò)增，而具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板當(dāng)環(huán)的長(zhǎng)度為22、32 nt（即72 bp和82 bp模板）時(shí)均未檢測(cè)到產(chǎn)物，當(dāng)環(huán)的長(zhǎng)度為42 nt、52 nt、62 nt、72 nt（即92 bp、102 bp、112 bp和122 bp模板）時(shí)可檢測(cè)到強(qiáng)弱不等的目的條帶，而且隨著環(huán)長(zhǎng)度的增加，條帶亮度逐漸增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)25 bp莖長(zhǎng)，環(huán)長(zhǎng)分別為42 nt、52 nt、62 nt、72 nt的模板擴(kuò)增產(chǎn)物條帶定量后通過(guò)顯著性分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的量分別為13.0±1.7 ng/μL、28.4±2.7 ng/μL、64.5±3.4 ng/μL、102.9±2.4 ng/μL（P＜0.05），可以看出當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部長(zhǎng)度為25 bp，環(huán)部長(zhǎng)度為42 nt、52 nt、62 nt、72 nt時(shí)，產(chǎn)物的量隨著環(huán)長(zhǎng)度的增長(zhǎng)約呈2倍增多，并且產(chǎn)物的量之間呈現(xiàn)顯著性差異。

圖5 具有不同環(huán)部長(zhǎng)度發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度對(duì)PCR的影響

探究發(fā)卡結(jié)構(gòu)中不同莖部長(zhǎng)度對(duì)模板擴(kuò)的影響，由圖6可知，相應(yīng)的對(duì)照組，即反應(yīng)過(guò)程中不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板均得到較好的擴(kuò)增條帶。反應(yīng)過(guò)程中形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)環(huán)部長(zhǎng)度為52 nt，莖部長(zhǎng)度分別為10、15和20 bp的模板也都檢測(cè)到了目的條帶，但是當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度為20 bp時(shí)，產(chǎn)物的條帶亮度明顯比發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度為15 bp和10 bp的弱。

圖6 發(fā)卡結(jié)構(gòu)中具有不同莖長(zhǎng)度模板擴(kuò)增結(jié)果

2.3 引物與發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部的相對(duì)位置對(duì)PCR的影響

當(dāng)引物結(jié)合位點(diǎn)在發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部外側(cè)時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖7，隨著模板濃度的降低，目的片段的條帶強(qiáng)度逐漸減弱，此時(shí)的最低檢出限為1 000拷貝；而使用不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板時(shí)最低檢出限為10拷貝，表明本實(shí)驗(yàn)中模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在使PCR的檢測(cè)靈敏度降低了約100倍。

圖7 引物處于兩端游離端時(shí)模板擴(kuò)增結(jié)果

2.4 擴(kuò)增反應(yīng)條件對(duì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板PCR的影響

2.4.1 退火溫度對(duì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板擴(kuò)增的影響

選取發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度25 bp，總長(zhǎng)度為82 bp、92 bp和102 bp的DNA鏈為模板，同時(shí)設(shè)置長(zhǎng)度相同，不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)共分為3組，退火溫度分別為63℃、60℃、57℃，探討反應(yīng)過(guò)程中不同退火溫度對(duì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8。不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板在不同退火溫度下均檢測(cè)到目的條帶。而具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板在不同的退火溫度下擴(kuò)增結(jié)果卻不同，當(dāng)退火溫度為63℃時(shí)，最短可檢測(cè)到92 bp的條帶；當(dāng)退火溫度為60℃時(shí)，僅檢測(cè)到102 bp的目的條帶，并且條帶亮度比退火溫度為63℃時(shí)要弱；當(dāng)退火溫度為57℃時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到目的條帶。

圖8 不同退火溫度下模板的擴(kuò)增結(jié)果

2.4.2 引物濃度對(duì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板擴(kuò)增的影響 為探究引物濃度的改變對(duì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板擴(kuò)增的影響，以發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度25 bp、環(huán)部長(zhǎng)度52 bp的DNA序列為模板，以長(zhǎng)度相同、不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板作為對(duì)照，在不同的引物濃度梯度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖9可知，當(dāng)反應(yīng)體系中引物濃度為0.6 μmol/L時(shí)，具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)和不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板均檢測(cè)到目的條帶，并且不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板條帶亮度強(qiáng)于具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的條帶亮度。當(dāng)反應(yīng)過(guò)程中形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板在引物濃度降至0.1 μmol/L時(shí)便部能檢測(cè)到產(chǎn)物條帶；而反應(yīng)過(guò)程中不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的對(duì)照模板在引物濃度降至0.05 μmol/L時(shí)才不能檢測(cè)到目的產(chǎn)物條帶。

圖9 不同引物濃度時(shí)模板擴(kuò)增結(jié)果

2.5 發(fā)卡結(jié)構(gòu)熔點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果

利用Piko Real Software 2.1獲得熒光微分曲線和序列相應(yīng)的熔點(diǎn)（圖10，表4），圖10-A中25 bp、20 bp、15 bp雙鏈熔點(diǎn)分別為72.5℃、71.1℃、66.7℃，雙鏈熔點(diǎn)隨著雙鏈長(zhǎng)度的增長(zhǎng)而升高；圖10-B中長(zhǎng)度為82 nt，發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖長(zhǎng)分別為25 bp、20 bp、15 bp的序列熔點(diǎn)分別為80.5℃、79.1℃、76.1℃，并且序列的熔點(diǎn)隨著發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度的增長(zhǎng)而升高；圖10-C中發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度20 bp，環(huán)部長(zhǎng)度分別為20 nt、30 nt、50 nt的序列的熔點(diǎn)分別是82.6℃、81.5℃、78.8℃，并且序列的熔點(diǎn)隨著發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度的增長(zhǎng)而降低。另外，圖10-B和圖10-C中每個(gè)熔點(diǎn)曲線出現(xiàn)了兩條峰，推測(cè)熔點(diǎn)較低的峰可能是模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)所造成的結(jié)果。

3 討論

本文深入研究了發(fā)卡結(jié)構(gòu)的環(huán)部大小、莖部長(zhǎng)度、引物相對(duì)于莖部的位置等對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，同時(shí)探討了通過(guò)引物的設(shè)計(jì)和改變退火溫度等PCR條件來(lái)實(shí)現(xiàn)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的有效擴(kuò)增。

通過(guò)對(duì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中不同環(huán)部長(zhǎng)度對(duì)PCR擴(kuò)增影響的探究發(fā)現(xiàn)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)能夠明顯抑制模板PCR擴(kuò)增，并且當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖部長(zhǎng)度一定時(shí)，環(huán)越短，發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)模板擴(kuò)增的抑制作用越強(qiáng)，當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度達(dá)到50 nt以上時(shí)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)模板PCR擴(kuò)增的抑制作用明顯減弱。推測(cè)原因?yàn)榉磻?yīng)過(guò)程中引物-模板結(jié)合和模板自身的發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)

系，導(dǎo)致模板擴(kuò)增效率下降。另外，模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部越長(zhǎng)，PCR反應(yīng)過(guò)程中模板自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的能力越弱，進(jìn)而導(dǎo)致引物有更多的機(jī)會(huì)與模板結(jié)合，當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度達(dá)到50 nt以上時(shí)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)模板PCR擴(kuò)增的抑制作用明顯減弱。縮短發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖的長(zhǎng)度，能夠減弱發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)模板PCR擴(kuò)增的抑制作用，當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度小于15 bp時(shí)，具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的檢測(cè)線與不可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的檢測(cè)線接近?？赡苁怯捎诎l(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖部長(zhǎng)度變短，反應(yīng)過(guò)程中模板自身形成的雙螺旋發(fā)卡結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致引物有更多機(jī)會(huì)與模板結(jié)合，使得具有卡結(jié)構(gòu)的模板能夠有效擴(kuò)增。為了使具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板能夠有效擴(kuò)增，探究了當(dāng)引物位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部外側(cè)時(shí)，模板擴(kuò)增情況。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引物位于模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部外側(cè)時(shí)，具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板檢測(cè)線是不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的檢測(cè)線的100倍；另外，將2.1中具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部長(zhǎng)25 bp、環(huán)部長(zhǎng)52 bp的模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，使用與發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部完全互補(bǔ)的引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)限為105拷貝，是引物位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部外側(cè)時(shí)模板檢測(cè)線的100倍。由此可知，在擴(kuò)增具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板時(shí)，使用位于發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖部?jī)蓚?cè)游離端的引物能夠明顯提高具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的有效擴(kuò)增。由于反向重復(fù)序列廣泛存在于生物體基因組中［5］，在實(shí)際PCR擴(kuò)增過(guò)程中除本研究針對(duì)的情況外（反向重復(fù)序列位于擴(kuò)增片段的上下游引物區(qū)），還可能出現(xiàn)重復(fù)序列分布于擴(kuò)增子內(nèi)部的情況，針對(duì)這類待擴(kuò)增模板，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)避開(kāi)重復(fù)序列區(qū)，即引物結(jié)合區(qū)為非重復(fù)序列。

圖10 雙鏈DNA熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

表4 雙鏈DNA熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

另外，探究了退火溫度和引物濃度的改變對(duì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板擴(kuò)增的影響。研究發(fā)現(xiàn)，較高的退火溫度，有利于具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增。原因可

能為，在PCR循環(huán)迅速降溫的過(guò)程中分子內(nèi)的互補(bǔ)鏈優(yōu)先于外源引物而進(jìn)行退火，在降低溫度至 Tm值以下后分子內(nèi)退火形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)于溫度較高時(shí)更穩(wěn)定，導(dǎo)致外源引物無(wú)法與其結(jié)合，而用較高的退火溫度，雖然在溫度下降的過(guò)程中分子內(nèi)部可能優(yōu)先退火，但由于最終的退火溫度較高，分子內(nèi)的退火處于動(dòng)態(tài)平衡，因此外源引物有更多的機(jī)會(huì)與模板進(jìn)行退火進(jìn)而發(fā)生聚合反應(yīng)，從而提高擴(kuò)增效率。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中不同引物濃度對(duì)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板擴(kuò)增的影響發(fā)現(xiàn)，提高反應(yīng)體系中引物濃度，能夠在一定程度上提高具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板的擴(kuò)增量。原因可能是形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的模板在退火時(shí)，引物競(jìng)爭(zhēng)性與模板結(jié)合，提高引物濃度，相應(yīng)提高了引物與模板結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)能力。

最后，檢測(cè)25 bp、20 bp、15 bp雙鏈；長(zhǎng)度為82 nt，發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖長(zhǎng)分別為25 bp、20 bp、15 bp的序列；莖部長(zhǎng)度20 bp，環(huán)部長(zhǎng)度分別為20 nt、30 nt、50 nt序列的熔點(diǎn)。發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度越長(zhǎng)，形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)熔點(diǎn)越高，并且發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)高于與莖部長(zhǎng)度相同的雙鏈的熔點(diǎn)；當(dāng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度相同時(shí)，環(huán)部越長(zhǎng)，其熔點(diǎn)越低。熔點(diǎn)的測(cè)定，從理論上支持了發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度的改變、環(huán)部長(zhǎng)度改變以及退火溫度改變時(shí)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)模板擴(kuò)增規(guī)律原因的猜想。

4 結(jié)論

在對(duì)具有反向重復(fù)序列的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，反向重復(fù)序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生抑制作用，并且這種抑制作用隨發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部長(zhǎng)度的變長(zhǎng)而增強(qiáng)，隨發(fā)卡結(jié)構(gòu)中環(huán)部長(zhǎng)度的變長(zhǎng)而減弱。當(dāng)引物與DNA中非反向重復(fù)序列部分結(jié)合時(shí)能夠明顯提高具有反向重復(fù)序列DNA的擴(kuò)增效率。為了使具有反向重復(fù)序列的DNA能夠有效擴(kuò)增，在擴(kuò)增具有反向重復(fù)序列的模板時(shí)，建議使用的引物盡量與DNA序列中非反向重復(fù)序列部分結(jié)合。另外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用引物與模板發(fā)卡結(jié)構(gòu)中莖部結(jié)合時(shí)，適當(dāng)提高退火溫度和引物濃度也可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的有效擴(kuò)增。

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（責(zé)任編輯 李楠）

PCR Amplification Characteristics of DNA with Inverted Repeat Sequence

LI Chun-chuan PAN Xiao-ming WANG Jing DONG Ping LI Jing LIANG Xing-guo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）

This work is to explore that effect of hairpin structure formed by inverted repeats on template amplification. We investigated the factors affecting PCR amplification efficiency of DNA with hairpin structure，including ring size，stem length and the stem position as to the primer’s hybridization，and discussed how to achieve efficient amplification of DNA with hairpin structure by designing primers and changing the annealing temperature. The results showed that if the position of the primers completely or partly complemented to the 5'-sequence of the hairpin stem，the formation of hairpin structure hindered the binding of primer and template，therefore the inhibition to PCR amplification occurred；moreover，the inhibition increased with the stem length increasing. The inhibition decreased significantly when，the loop portion was longer than 50 nt. Higher annealing temperature and primer concentration were favorable for primers to compete with the formation of hairpin structure within molecule，therefore leading PCR amplification to be more efficient.

hairpin structure；PCR amplification；inverted repeat sequence

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.028

2016-05-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571937，31201327），國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)-山東省人民政府聯(lián)合資助海洋科學(xué)研究中心項(xiàng)目（U1406402）

李春川，男，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：chunchuan@126.com

梁興國(guó)，男，教授，研究方向：核酸化學(xué)及分子生物技術(shù)；E-mail：liangxg@ouc.edu.cn