羽絨中DNA提取方法及鴨絨鵝絨成分的定量檢測

吳姍++++虞惠貞++++任明興++++方瑩

摘要：為提高用PCR法鑒定鴨絨鵝絨的準確度，提高羽絨中DNA的提取效率，優(yōu)化了DNA提取方法；同時為了便于對羽絨制品的真?zhèn)舞b別，建立了羽絨中鵝絨鴨絨等的定量計算方法。通過比較5種前處理方法和4種抽提試劑盒及其組合間的抽提效率，建立最佳的抽提程序。利用熒光PCR定量的優(yōu)勢，建立了羽絨中的鵝絨鴨絨比例定量計算的方法，并將計算得到的值與預設的混合比例加以比較。經驗證，本研究建立的鵝絨鴨絨等定量計算方法能準確反映含量變化的趨勢，可作為一種有效的輔助手段對羽絨制品進行真?zhèn)握鐒e。

關鍵詞：羽絨；DAN提??；熒光PCR；定量檢測；真?zhèn)握鐒e

我國是世界上最大的羽絨及制品的生產國和出口國，也是最大的消費國[1]。目前市場上羽絨產品主要是鵝絨、鴨絨兩大類，兩種絨在外觀上并無明顯區(qū)別，但在保暖性能上，相同含量的鵝絨要優(yōu)于鴨絨，鵝絨的價格要高于鴨絨[2]。因此出現了將鴨絨或其他陸禽的毛絨摻在鵝毛絨中進行銷售，以牟取暴利的現象。鴨、鵝毛絨的鑒別是羽毛絨檢測中重要一項，相關標準，如GB/T 10288—2003《羽絨羽毛檢驗方法》，FZ/T 80001—2002《水洗羽毛羽絨試驗》等為鵝、鴨毛絨的種類鑒定提供依據。但在日常檢測中，一方面，相關標準基本上都是一些文字性說明，檢驗人員難以準確掌握；另一方面，鴨、鵝毛絨以各種形式存在，羽毛分為正常和損傷兩種，羽絨主要指絨子和絨絲，絨子還分為朵絨、未成熟絨、類似絨和損傷絨等，微觀顯微結構存在交叉、雷同現象，給檢驗造成了困難[3]。

陳國培等[4]設計了鴨和鵝物種特異性的引物探針，并通過建立熒光PCR的方法對鴨絨和鵝絨進行鑒定，該方法克服了顯微鏡觀察法主觀性大的缺點，可作為顯微鏡法有效的輔助檢測手段。以DNA為目標檢測物的PCR方法，其前期DNA的提取質量直接關系到整個檢測過程的成敗。該文獻報道使用SDS-異硫氰酸胍-β-巰基乙醇的提取方法能滿足檢測的需求，但該方法比較耗時費力，整個提取步驟僅水浴就耗時6個小時，而DNA還需要沉淀過夜進行收集。除此以外，關于從羽絨制品中提取DNA的方法則鮮有報道。為提高用PCR法鑒定鴨絨鵝絨的準確度，我們嘗試了不同前處理方法和不同抽提試劑盒，以提高鴨絨、鵝絨提取DNA的效率。在此基礎上，我們利用熒光PCR可定量的特性，建立了羽絨制品中鵝絨、鴨絨等比例的計算方法。

1 材料和方法

1.1 羽絨

羽絨樣品來自浙江中大技術進出口集團有限公司和浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心微生物實驗室。在各種前處理和DNA提取方法的比較試驗中，選用了“北京白鴨絨”“波蘭白鴨絨”和“東北白鵝絨”3個樣品；在后續(xù)的羽絨樣品DNA提取和物種成分檢測試驗中所用的樣品見表1。

1.2 DNA抽提

（1）DNA抽提前的處理

在用試劑盒抽提DNA前，先用剪刀將羽絨盡可能地剪碎剪小，然后再進行以下前處理：前處理A——不再做任何前處理，直接按照試劑盒步驟進行DNA抽提；前處理B——振蕩研磨法：將剪碎的羽絨放入帶有磁珠（Φ3mm，Sigma，美國）的管子中，用振蕩研磨儀進行研磨（5500 r/min 振蕩20s，重復4～6次）；前處理C——手工液氮研磨法：將剪碎的羽絨放入研缽，加入液氮，手工研磨至細末；前處理D——振蕩研磨法+手工液氮研磨法：即經過振蕩研磨處理后的樣品，再用液氮研磨處理；前處理E——機器液氮研磨法：使用冷凍研磨儀進行研磨，研磨程序設置為：研磨循環(huán)數為1，預冷時間7min，研磨時間2min，研磨間隔時間2min，運行頻率12次/min。

經過上述前處理的樣本各取50 mg，用DNA抽提試劑盒K1按照說明書進行抽提，最后將抽提得到的DNA溶解在50μL水中。重復3次。

將上述抽提得到的DNA，進行濃度、純度檢測，同時進行熒光PCR檢測。

（2）DNA抽提試劑盒

通過DNA濃度、純度比較和熒光PCR檢測結果比較，在A、B、C、D、E中選擇一種較理想的方法，作為統(tǒng)一的前處理的方法，在此前基礎上，再比較不同DNA抽提試劑盒的提取效果。各種試劑盒如下：K1試劑盒：Promega（美國）FF3750抽提試劑盒，該方法是磁珠吸附法，整個過程耗時1.5h～2h，取樣量為50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K2試劑盒：Promega（美國）DC6740抽提試劑盒，該方法是磁珠吸附法，整個過程耗時不超過2h，取樣量為50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K3試劑盒：QIAamp（美國）56304抽提試劑盒，一管取樣10 mg（試劑盒要求一次取樣量不超過10 mg），共抽提5管（5個樣），最后5個管抽提得到DNA都用同一50 μL水重復洗脫，作為一個樣品。K4試劑盒：QIAamp（美國）51304抽提試劑盒，取樣25 mg（試劑盒要求一次取樣量不超過25 mg），共抽提兩管（兩個樣），最后兩個管抽提得到的DNA都用同一50 μL水重復洗脫，作為一個樣品。

上述K3和K4方法是膜柱法，根據說明書，樣品中加入裂解液后，一般水浴分別為1h～3h和4h～6h，但為了裂解充分建議裂解過夜，我們在K3和K4的抽提過程中都采用了過夜的方法，但裂解后的抽提程序相對簡單，整個過程不超過1.5h。上述不同試劑盒抽提各重復3次。

1.3 熒光PCR反應

對上述抽提得到的DNA進行鴨、鵝和雞等物種檢測，檢測方法參照標準SNT 2727—2010《飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法》。熒光PCR擴增體系配制及擴增溫度和時間見標準。

1.4 標準曲線繪制

為檢測熒光PCR檢測體系的檢出限和線性范圍，對鴨和鵝肉中抽提得到的DNA進行梯度稀釋，并利用DNA濃度和Ct（Ct表示每個反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數）值之間的相關性繪制標準曲線。鴨肉和鵝肉的DNA抽提方法采用前處理B和K1提取試劑盒的組合，抽提得到的兩種DNA，都統(tǒng)一調節(jié)濃度至20 ng/μL，后進行4倍梯度稀釋。變量相關性公式[5]：Ct = b·log[DNA濃度] + a，其中：b是斜率；a是截距。

1.5 混合樣的制備，以及計算鴨成分和鵝成分的計算

取波蘭白鴨絨和東北白鵝絨為材料，將鴨絨和鵝絨按不同的質量比進行混合，后采用前處理B和K4提取試劑盒的組合進行DNA抽提。熒光PCR后通過標準曲線計算得到每個樣品中鴨和鵝的DNA濃度，計算兩者間比例，并與設置的鴨絨與鵝絨的比例進行比較。

2 結果

2.1 不同前處理對DNA質量的影響

處理A，即羽毛絨僅做剪碎處理，該處理的DNA濃度都非常低，僅2 ng/μL左右，而OD260/OD280的值在2.4～3.0之間（見表1），說明所抽提的DNA純度較低。經過B的磁珠研磨和C的液氮研磨處理，抽提得到的DNA濃度有所上升，平均值達到4 ng/μL左右，而OD260/OD280的值雖未達到理想的1.8，但平均值介于1.5～2.3之間，純度優(yōu)于A處理。D是B和C處理的組合，即經過磁珠研磨和液氮研磨兩重處理；而E是通過液氮研磨儀處理的，其過程也是將樣品浸入在液氮環(huán)境中進行物理機械研磨，即集液氮處理和機械研磨于一體，且實現同步化。如表1所示，經過D和E的處理，所得到的DNA濃度達到7 ng/μL左右，雖然比其他方法有所提高，但仍停留在個位數。而D和E的處理對DNA純度的提高則更加明顯，所得DNA的OD260/OD280的值都落在1.6～2.1之間，更加接近理想的1.8。

熒光PCR的結果（見表2）和測得的DNA濃度純度的結果較為吻合，表現為濃度純度較低的，對應的Ct值大，若濃度純度相應較高，得到的Ct值則相對小，即相同的樣品前處理從A到E，對應熒光PCR測得的Ct值逐步降低，特別是在檢測北京白鴨絨和波蘭白鴨絨的鴨成分時，A處理檢測得到的Ct值在37左右，B和C在32～35之間，D和E則在30左右，陽性增強的趨勢較明顯。在檢測東北白鵝絨的鵝成分時，只有A處理的Ct值高達37.7，B和C處理的Ct值降至30左右，D和E處理的Ct值則都接近28，也充分體現了DNA的品質對PCR檢測的重要性。

根據以上檢測結果，D和E的前處理往往能得到濃度和純度較高的DNA，而相應PCR結果的陽性也較強。但D處理同時需要儀器振蕩研磨處理和人工液氮研磨處理，工序相對繁瑣，因此在后續(xù)的試驗中，不特別說明的情況下，我們選擇E處理作為統(tǒng)一的前處理方式，以此比較不同抽提試劑盒的DNA抽提性能。

此外，從不同物種的檢測結果看（表2），鴨絨和鵝絨中都沒有檢測到雞源性成分，鴨絨中只檢測到鴨源性成分，但在檢測鵝絨的時候，發(fā)現鵝絨中不但檢測到鵝源性DNA，還檢測到了鴨源性DNA成分，但Ct值較高在35左右。

2.2 不同抽提試劑盒對DNA質量的影響

在前處理都相同的情況下，比較了不同試劑盒的DNA提取效率。如表3所示，K1試劑盒提取的DNA質量與表2中對應的值接近，即DNA濃度在7ng/μL～10ng/μL之間，OD260/OD280的值在1.5～2.0之間。K2試劑盒抽提得到的DNA，濃度有較大幅度的提升，最低的濃度也達到了19.8 ng/μL，而最高濃度則達到了28.7ng/μL，但該處理的DNA純度不高，OD260/OD280值較低，介于1.1～1.4之間，該方法雖然DNA的得率較高，但同時也未能有效去除蛋白質、酚等的污染。K3和K4用的都是QIAamp的試劑盒，抽提得到的DNA品質也相仿，即濃度多在10ng/μL～15 ng/μL之間，OD260/OD280值在1.6～1.9之間，雖然這兩種處理得到的DNA濃度只有K2處理的一半，但純度較高，即OD260/OD280的值都接近理想的1.8。

在隨后的熒光PCR檢測中，也證實了雖然K2處理所得到的DNA濃度較高，但檢測得到的Ct值并沒有比K3、K4處理有更多優(yōu)勢。如表4所示，K3、K4的Ct值在24～26之間，低于K2處理的26～27之間，說明與濃度一樣，DNA的純度對PCR的擴增同樣重要。而K1處理檢測到的Ct值和表2中對應的值接近，該試劑盒的表現較為穩(wěn)定。

表4中熒光PCR的物種檢測結果和表3的一致，即：鴨絨中只檢測到鴨的DNA成分；鵝絨中除了檢測到鵝的DNA，還檢測到了鴨的DNA，而這次鵝絨中鴨源性成分的Ct值也達到了30左右，陽性明顯。

經過上述試驗，我們發(fā)現本試驗中抽提試劑盒對DNA抽提效率的影響要大于前處理對抽提效率的影響，因此，為了簡化操作又增加了前處理A與K3、K4試劑盒的組合，即僅將羽絨剪小剪碎處理的情況下，檢測試劑盒提取效率，且K3、K4試劑盒提取時在裂解液中統(tǒng)一處理3h。提取的結果如表5所示：不進行前處理對K3試劑盒抽提得到DNA的濃度影響不大，但對純度影響較大，OD260/OD280值達到了3左右，可能存在大分子雜質產生了光吸收，或存在RNA雜質；K4抽提得到的DNA，不經過前處理（A前處理）與經過E前處理比較，濃度下降40%左右，表示純度的OD260/OD280值也從比較完美的1.8左右升至2.0以上。盡管如此，從熒光PCR的檢測結果看（表6），鴨絨中鴨成分的Ct值在25～27之間，鵝絨中鵝成分的Ct值在27～30之間，鵝絨中鴨成分的Ct值在31左右，雖然比對應的經過E處理的Ct值都有所升高，但擴增曲線陽性特征明顯（圖略），可以滿足物種鑒定的檢測需求。因此在后續(xù)的對其他樣本的檢測中，我們采用了前處理A（無前處理）和K4的組合。

2.3 對11個鴨絨、鵝絨樣本的物種成分檢測

在對其余11個樣本檢測后，發(fā)現即便不經過研磨等前處理，DNA濃度在8ng/μL～14ng/μL之間，濃度尚可（見表7）。但OD260/OD280值低至1.2，或者高至2.8，偏離1.8的理想值較遠。特別是灰鴨絨和灰鵝絨，相比較白鴨絨和白鵝絨，所抽提得到的DNA的純度更低，這可能是不能有效除去灰絨的色素所導致。但所有抽提得到的DNA都能滿足熒光PCR檢測的需求：11個樣品熒光PCR檢測得到目標物種的Ct值在27～31之間，灰鴨絨、灰鵝絨的Ct值高于白鴨絨、白鵝絨的Ct值，與對應的DNA質量相符。

對11個樣品的物種檢測發(fā)現，所有樣本中都未能檢測到雞源性DNA成分，鴨絨中都檢測到了鴨，鵝絨中也都檢測到了鵝，在一個鵝絨樣本中也檢測到了鴨的DNA成分。新的發(fā)現是，在一個鴨絨的樣本中檢測到了鵝的成分。鵝絨中檢測到了鴨，一般會懷疑以次充好，以價低的鴨絨冒充相對價高鵝絨，但鴨絨中檢測到了鵝絨，一般不會是商家有意為之，而往往是因為生產過程中無意識混入。

2.4 標準曲線的繪制及鵝絨中鴨絨含量的計算

對從鴨肉和鵝肉中抽提得到的DNA進行4倍梯度稀釋，檢測引物探針的靈敏度，并繪制標準曲線，結果顯示（表8，圖1），當DNA濃度大于等于0.005ng/μL時，鴨和鵝得到的標準曲線的R2值分別為0.9835和0.9815，都較接近0.99，理論上，該濃度以上的檢測結果較為可靠（圖1）。

按照一定的比例（表9），配制了波蘭白鴨絨和東北白鵝絨的混合樣，將混合樣的DNA進行熒光PCR檢測。根據標準曲線計算得到樣品中鴨和鵝的濃度，并計算鴨成分占樣品的比例，將計算得到的比例和最初設置的比例進行比較。如表9所示，100%的東北白鵝絨（0%鴨質量百分比）中檢測到3.7%的鴨成分，理論上鴨質量百分比分別為10%～50%的樣品中，分別檢測到了11.4%、20.9%、31.7%、44.3%和56.7%的鴨成分，檢測值與理論值相近，但都高于理論值。

本研究采用的東北白鵝絨是“90絨”，即保證該批鵝絨中至少90%的成分是鵝絨，其余10%可能是毛片、飛絲等其他成分，也可能是鴨絨或其他陸禽絨。統(tǒng)計了表4、表6和表9中，“100%東北白鵝絨”時檢測到的鴨的含量，得到的平均值為5.4%（表9中調整后鴨質量百分比理論值）。假設“100%的鵝絨”中5.4%鴨成分是真實值，則之前所得到的10%～50%的鴨質量百分比的理論值則有待調整，即原來10%的值調整后為 [（10+90×0.054）]%=14.6%，其余以此類推，調整后鴨質量百分比理論值如表9所示。與對應的鴨質量百分比計算值比較發(fā)現，雖然兩個值并不完全相同，但也較相近，計算值和調整后的理論值的差距在-21.6%到7.6%之間，隨著鴨含量的增高，差距有所減小，計算值越靠近理論值?？偟膩碚f，本研究計算得到的鴨絨的添加量能準確反映含量變化的趨勢，可作為一種有效的輔助手段在品質鑒定時加以采用。利用本研究建立的計算方法，計算了表7中“白鵝絨”樣品中鴨的成分，發(fā)現鴨絨含量高達10.3%。

3 總結與討論

比較了各種前處理方法對羽絨中提取DNA的影響，得出：高強度的物理研磨，或者在有液氮條件下的研磨都有助于提高DNA的得率。因此，若實驗室具備液氮研磨儀或者振蕩研磨儀等設備，建議在抽提前進行一定的研磨處理；但若不具相關設備，手動液氮研磨耗時費力，則建議省略該步，可把重點放到選擇合適的提取試劑盒。研究發(fā)現，與研磨等前處理相比，DNA提取試劑盒對抽提效果影響更加明顯。結合本研究，在具備相關設備的情況下，抽提模式可選擇B/D+K3/K4（B或D加K3或K4），否則可選擇A+K3/K4的模式，一般兩種模式得到的DNA濃度都可達10 ng/μL左右，但前一種模式純度更高，因此在進行目標物種成分熒光PCR檢測時，所得到的Ct值前者24、25左右，后者27、28左右。陳國培等[4]用SDS-異硫氰酸胍-β-巰基乙醇法提取得到的DNA濃度在20ng/μL～200ng/μL之間，明顯高于本研究得到的DNA濃度，但陳等所選用的是帶毛囊的羽絨，且真正用于提取DNA的僅僅是取樣品中的毛囊部位，本研究所采用的是隨機選取的完整羽絨，不區(qū)分是否帶有毛囊；而動物纖維中的DNA主要存在于毛囊部位，毛干中存有少量線粒體DNA[6]，因此得到的DNA濃度低于前者與取樣部位有很大關系，但本研究取樣的隨機性簡化了操作，更符合實際檢測的需求。

熒光PCR檢測結果顯示：雖然從羽絨羽毛中抽提DNA的報道不多，但也有一些類似的研究，如從鳥的羽毛基部[6]和羽枝[7]中提取DNA，從哺乳動物的毛發(fā)中提取DNA[8]，從羊絨羊毛制品中提取DNA[6]，從人的染色的頭發(fā)中提取DNA[10]等。上述研究中，邵碧英等[6]和Speller等[7]認為合適的試劑盒可有效地從羊絨羊毛和羽毛中提取DNA；此外，上述報道中還較多地提到了Chelex 100的提取方法，認為該方法可有效地提取哺乳動物毛發(fā)中[8]和染色頭發(fā)中[9]的DNA，該方法操作相對簡便，可在后續(xù)的研究中進行嘗試。

物種特異性檢測結果顯示，鴨絨、鵝絨中摻雜雞絨的情況在本次研究的樣本中并沒有發(fā)現，但有發(fā)現鵝絨中摻雜鴨絨和鴨絨中摻雜鵝絨的現象。陳國培等[4]對25個鴨絨樣品進行鴨源性和鵝源性成分的熒光PCR檢測，所有樣品都檢測到了鴨源性成分，而未檢測到鵝源性成分；由于無鵝絨樣品，因此檢測結果無法體現是否有摻假行為，同時也未對雞源性成分進行檢測。從經濟角度而言，鴨絨中摻雜鵝絨，無利可圖，應該是一種無意識的混入；鵝絨中摻雜鴨絨，是以次充好，是有經濟驅動力的，但若摻入的量很低，則也可能是一種無意的行為，如使用相同的器具或流水線導致的混入。本研究進一步利用熒光PCR定量的優(yōu)勢，對同一樣本中兩種絨含量的比例進行計算，計算得到的值與預設值（表9中“鴨質量百分比理論值”或“調整后鴨質量百分比理論值”）接近，基本能顯現含量變化的趨勢。特別是當形態(tài)學檢測存在困難時，如將幼鴨的鴨絨充當鵝絨時，本方法可作為一種輔助檢測方法。

參考文獻：

[1]王敦洲. 我國羽絨生產現狀及外貿出口展望[J]. 水禽世界，2006（4）： 4-6.

[2]王華雄， 林德康， 付勁. 羽絨及其制品的質量與檢驗[M]. 北京： 中國紡織出版社， 2000.

[3]朱峰， 翁春艷， 涂貌貞， 等. 我國羽絨羽毛現行標準中羽毛絨種類鑒定方法研究[J]. 中國纖檢， 2011（8）： 54-56.

[4]陳國培， 賴心田， 唐復潤， 等. 鴨絨及鵝絨制品實時熒光PCR鑒定方法研究[J]. 中國纖檢， 2013（12）： 60-62.

[5]Pegels N， González I， García T， etal. Avian-specific real-time PCR assay for authenticity control in farm animal feeds and pet foods. Food Chem. 2014， 1（142）：39-47.

[6]邵碧英， 林志武， 陳文炳， 等. 高效的羊絨羊毛織品DNA提取方法的建立[J]. 生物技術， 2009， 19（5）：38-39.

[7] Speller CF， Nicholas GP， Yang DY. Feather barbs as a good source of mtDNA for bird species identification in forensic wildlife investigations [J]. Investigative Genetics. 2011（2）：16-23.

[8]徐艷春， 馬立新， 白素英， 等. 應用PCR方法通過毛發(fā)進行哺乳動物性別鑒定[J]. 東北林業(yè)大學學報， 2000， 28（6）：72-77.

[9]高林林， 唐暉， 嚴江偉， 等. 染色毛干mtDNA不同提取方法的研究[J]. 中國法醫(yī)學雜志， 2006， 21（5）：284-286.

（作者單位：吳姍、虞惠貞、方瑩，浙江省檢驗檢疫科學技術研究院；任明興，紹興出入境檢驗檢疫局）