徐懷超,昝林森,2*,王洪寶,2,寧 越

(1.西北農林科技大學動物科技學院, 楊凌 712100； 2. 國家肉牛改良中心, 楊凌 712100)

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CRTC3基因多態(tài)性及基因型組合與秦川牛生長性狀的關聯(lián)分析

徐懷超1,昝林森1,2*,王洪寶1,2,寧 越1

(1.西北農林科技大學動物科技學院, 楊凌 712100； 2. 國家肉牛改良中心, 楊凌 712100)

旨在探討CRTC3基因作為秦川牛生長性狀候選基因的可能性，尋找與秦川牛生長相關的分子標記。本研究采用PCR-RFLP方法檢測395頭健康秦川牛CRTC3基因的多態(tài)性，分析其多態(tài)位點不同基因型及組合基因型與秦川牛生長性狀的關聯(lián)性。結果發(fā)現(xiàn)，CRTC3基因擴增序列區(qū)間存在2個SNPs位點(位于外顯子區(qū)域的G66478C和位于內含子區(qū)域的C91297T)。關聯(lián)性分析表明，在本試驗所選取的395頭秦川牛群體中， G66478C位點GC基因型個體在體斜長方面極顯著高于CC型個體均值(P<0.01)，且在胸深方面顯著高于CC型個體均值(P<0.05)。在C91297T位點，CT基因型個體均值在體斜長、腰高、尻長和胸深方面顯著高于TT基因型個體均值(P<0.01)。CRTC3基因的優(yōu)勢基因型組合CC-TT的個體在腰高、尻長上極顯著高于CC-CT基因型組合的個體均值(P<0.01)，且基因型組合CC-TT的個體在胸深、胸圍顯著高于CC-CT組合的個體均值(P<0.05)。綜上，可以嘗試將CRTC3基因作為影響秦川牛生長性狀的候選基因用于標記輔助選擇，為秦川牛選育工作提供科學依據(jù)。

CRTC3；生長性狀；基因型組合；分子標記

生長性狀是畜牧業(yè)生產中一個重要的經濟性狀，是衡量育種價值及經濟效益的重要指標，尋找相關的分子標記可以縮短對生長性狀的選育年限[1]。CRTC3(CREB regulated transcription coactivator 3)是最近發(fā)現(xiàn)在葡萄糖和脂質代謝中發(fā)揮重要作用的一個蛋白因子，CRTC3屬于CREB共活化因子家庭。CRTCs是一個主要調節(jié)CREB轉錄因子活性的蛋白質家族，2003年首先由諾華制藥公司的科研人員利用基因組高通量篩選發(fā)現(xiàn)。CRTCs首次發(fā)現(xiàn)時被命名TORC(Transducer of regulated CREB)[2]，CRTCs基因被證實存在于果蠅、鼠及人類中。哺乳動物的CRTCs蛋白家族有3個成員，CRTC1、CRTC2和CRTC3。3種亞型在N端同源性高，其高度保守的卷曲螺旋結構域(Coiled-coil domain) 能與CREB的堿性亮氨酸拉鏈結構域(Basic leucine zipper，bZIP)相結合，提示其對CREB依賴的轉錄調控可能具有重要作用[3]。

CRTC3是環(huán)磷腺苷反應元件結合物協(xié)同激活物家族一個新發(fā)現(xiàn)的重要成員。研究證實，CRTC3在棕色脂肪里高度表達，且能夠通過調控脂肪組織里的兒茶酚胺信號通路來影響脂肪的代謝和促進肥胖的發(fā)生發(fā)展[4]。CRTC3也能通過增加PPARγ和PGC-lα的表達來誘導棕色脂肪組織的UCP1表達增加,從而促進其脂肪組織的代謝活性,消耗更多的能量[5]。此外,CRTC3在肌肉組織中也表現(xiàn)出較強的代謝活性。在肌細胞里,CRTC3與CREB的互作強有力的刺激PGC-7amRNA轉錄活性,從而促進線粒體呼吸鏈和三羧酸循環(huán)下游目的基因的表達,其結果是增加了線粒體代謝活動。敲除CRTC3大鼠的能量消耗和氧化代謝明顯增加,對胰島素敏感性明顯增加，并且出現(xiàn)脂肪組織減少和體重減輕的現(xiàn)象[6]。Y.Song等研究發(fā)現(xiàn)CRTC3基因突變小鼠表現(xiàn)出較強的脂肪分解和脂肪酸氧化的能力[7]。基于CRTC3的分子結構和生物學特性以及在老鼠和人類中發(fā)現(xiàn)的生物學功能，說明它很有可能是一種能影響動物生長性狀的調節(jié)因子。

鑒于CRTC3基因在能量代謝和脂質代謝過程中的重要作用，我們推測其在畜禽生長性狀方面可能發(fā)揮直接或間接的作用，但是目前尚未見到相關報道。因此，本研究擬以CRTC3基因為目標基因，采用PCR-RFLP方法，分析不同標記基因型及基因型組合對秦川牛生長性狀的影響，以期為秦川牛分子育種提供新的理論方法和技術路徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

血樣采自陜西省良種肉牛繁育中心、陜西省秦川牛保種廠和西北農林科技大學良種肉牛繁育中心3個場區(qū)，選擇395頭同等飼養(yǎng)條件下的18～24月齡健康的秦川牛，對每頭牛頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(V(ACD)∶V(血液)=1∶6)，置于-80 ℃保存。同時采集試驗牛的8個生長性狀指標(體斜長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬)。

1.2 基因組DNA的提取及檢測

采用常規(guī)的酚-氯仿提取法[8]提取秦川牛血樣基因組DNA，提取的DNA 用TE緩沖液處理后，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計測定DNA濃度，然后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CRTC3基因PCR擴增、測序

根據(jù)GenBank公布的牛CRTC3序列(GenBank AC_000178)，利用Primer 5.0軟件設計引物(表1)，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR反應體系30.0 μL：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0 μL，ddH2O 11.8 μL，上游、下游引物各(10 pmol·μL-1)0.6 μL、模板DNA(50 ng·μL-1)2.0 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性 5 min；94℃ 35 s，退火30 s (退火溫度見表1)，72 ℃ 30 s，37個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。在擴增好的PCR產物中，每種隨機選取20個樣本使用凝膠回收試劑盒回收純化，送至上海生物工程股份有限公司進行測序，測序結果使用DNAMAN軟件進行對比分析，尋找突變位點。

1.4 PCR-RFLP分析

經測序比對后，取含有突變位點的PCR擴增產物10 μL，依照G66478C和C91297T順序，分別加入限制性內切酶Eco47 III (TaKaRa, Dalian, China)和ApaL I (TaKaRa, Dalian, China) 各1.0 μL，2.0 μL的10×Buffer，加入去離子水至20 μL，將反應體系分別置于37、65、37和37 ℃恒溫箱中4 h，然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)照相分析。對切開的不同條帶的DNA樣品擴增送至上海生物工程股份有限公司進行測序，驗證酶切效果。

表1CRTC3基因2個SNPs位點引物信息

Table 1 Primer information of 2 SNPs inCRTC3 gene

SNPs突變區(qū)域Mutationregion引物序列(F/R)(5'-3')Primersequence退火溫度/℃Tm擴增片段大小/bpFragmentsizeG66478CExon6TTTATGGATGATTGTAAATCGGGAGAAAGAGGTGGGAGGGAAGG67424C91297TIntron13AGTGTGCTGAGGAGGGAGGTGGACAGTGCGGATTAGAAGGCGTG66843

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)基因型統(tǒng)計分析結果計算2個SNPs位點的基因型和等位基因頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡適應性檢驗。通過SHEsis在線軟件計算連鎖不平衡相關系數(shù)γ2。利用SPSS (19.0) 軟件中的GLM分析模型對秦川肉牛生長性狀的影響。分析結果用“平均數(shù)±標準誤”表示(P<0.05為差異顯著水平)。分析模型：

Yij=μ+Gi+eij

其中，Yij為個體表型值，μ為群體均值，Gi為標記基因型效應，еij為隨機誤差。

2 結 果

2.1 CRTC3基因型分析

通過測序分析發(fā)現(xiàn)，CRTC3基因擴增序列存在2處SNPs，分別命名為G66478C和C91297T。G66478C是錯義突變且突變導致了絲氨酸到蘇氨酸的改變，C91297T是位于內含子區(qū)域的突變。

對SNP位點所在序列擴增后進行PCR-RFLP分型。具體酶切效果如圖1所示。對G66478C所在序列酶切分型結果為CC型(424 bp),GC型 (163、261、424 bp)。對C91297T所在序列酶切分型結果為CC型(843 bp)，CT型(246、597、 843 bp)，TT型(246、597 bp)。將G66478C和C91297T突變位點不同基因型對應的DNA樣品進行PCR擴增，送至上海生物工程股份有限公司進行測序，經檢驗發(fā)現(xiàn)酶切正確(圖2)。

從群體遺傳學角度分別分析這2個SNPs的基因型頻率和等位基因頻率，并進行卡方檢驗檢測Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。表2結果顯示，在G66478C和C91297T處，CC為優(yōu)勢基因型，C是G66478C和C91297T的優(yōu)勢基因?？ǚ綑z驗表明，G66478C和C91297T屬于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.01)。

A. G66478C酶切圖；B. C91297T酶切圖A. The RFLP map of G66478C; B. The RFLP map of C91297T 圖1 SNP位點RFLP酶切圖Fig.1 RFLP patterns of SNP loci

A.G66478C不同基因型的驗證圖；B. C91297T不同基因型的驗證圖A.The verification of different genotypes at G66478C; B. The verification of different genotypes at C91297T圖2 CRTC3基因SNPs位點測序驗證圖Fig.2 The verification of CRTC3 at SNPs

2.2 CRTC3基因SNP位點與秦川牛生長性狀的關聯(lián)分析

對395頭秦川牛的8個生長性狀分別與CRTC3基因2個SNPs位點不同基因型進行關聯(lián)分析。表3結果顯示，G66478C位點GC基因型個體均值在體斜長方面極顯著高于CC型個體均值(P<0.01)，GC基因型個體均值在胸深方面顯著高于CC型個體均值(P<0.05)。C91297T位點CT基因型個體均值在體斜長、腰高、尻長、胸深方面極顯著高于TT型個體均值(P<0.01)；CT基因型個體均值在體高、腰角寬、坐骨端寬方面顯著高于其他兩種不同基因型個體均值(P<0.05)。

表2CRTC3位點的基因型和等位基因分布頻率

Table 2 Genotype and allele frequency ofCRTC3

位點Site等位基因頻率Allelefrequency基因型頻率Genotypefrequency卡方檢驗χ2G66478CGGGCCCGC00.180.880.090.913.97C91297TTTCTCCTC0.100.190.710.200.8062.02

表3CRTC3基因各SNP位點不同基因型和秦川牛生長性狀關聯(lián)分析

Table 3 Associations betweenCRTC3 SNP genotypes and growth traits of Qinchuan cattle

位點Site基因型Genotype體斜長/cmBL體高/cmWH腰高/cmHH尻長/cmRLG66478CGC(71)135.89±0.74A121.20±0.65124.10±0.4042.70±0.24CC(348)130.09±1.63B117.97±1.42123.93±0.8641.92±0.53P0.0010.3290.0710.079C91297TCC(280)135.19±0.81a120.90±0.70124.99±0.4243.53±0.26ACT(75)139.58±2.13A123.70±1.85a125.71±1.12A44.10±0.69ATT(40)131.70±1.56Bb118.22±1.35b120.89±0.82B40.72±0.05BP0.0030.0180.0010.000位點Site基因型Genotype腰角寬/cmHW胸深/cmCD胸圍/cmCC坐骨端寬/cmPBWG66478CGC(71)39.36±0.3259.98±0.40a165.48±1.0719.18±0.20CC(348)38.93±0.7157.55±0.88b163.92±2.3618.82±0.45P0.0570.0130.1480.063C91297TCC(280)37.31±0.51b59.79±0.43162.90±1.82b19.20±0.22CT(75)39.16±0.56a62.43±1.14A163.98±2.01b19.52±0.59aTT(40)39.27±0.70a58.43±0.83B170.87±2.48a17.96±0.43bP0.0160.0010.0110.012

同列相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著P<0.05，不同大寫字母表示差異極顯著P<0.01，下表同

Data marked with different superscripts in the same row differ significantly (Capital letters.P<0.01; Small letters.P<0.05). BL. Body length; WH. Wither height; HH. Hip height; RL. Rump length; HW. Hip width; CD. Chest depth; CC. Chest circumference;PBW. Pin bone width.The same as below

2.3 CRTC3基因突變位點的連鎖不平衡分析及單倍型分析

運用PHASE軟件對2個突變位點進行連鎖不平衡分析。統(tǒng)計得到r2值為0.005(小于0.33)，表明這2個SNPs位點連鎖性不強。研究表明，當SNP位點處于弱的連鎖性時，基因型組合比單位點標記在分子標記方面更能利于相關性狀的關聯(lián)分析[9-10]。表4所示單倍型頻率大于3%的有4種，分別命名為 Hap1～Hap4，單倍型頻率分別為0.668、0.149、0.135和0.047(表4)。

2.4 CRTC3基因型組合與秦川牛生長性狀的關聯(lián)分析

CRTC3基因型組合與秦川牛8個生長性狀的關聯(lián)分析結果如表5所示(基因型組合頻率個體數(shù)小于5%的不參與統(tǒng)計分析)。分析結果表明，基因型組合CC-TT個體均值在腰高、尻長指標上極顯著高于CC-CT基因型組合的個體均值(P<0.01)，且基因型組合CC-TT個體在胸深、胸圍顯著高于CC-CT組合的個體均值(P<0.05)。在3種基因型組合中CC-TT型秦川牛生長性狀的數(shù)值均是最優(yōu)的。因此，在實際育種生產中可加強CC-TT組合個體的選擇強度，不斷提高其在群體當中的比例，以加快秦川肉牛生產性能的改良和提高。

表4CRTC3基因單倍型分析

Table 4 Haplotypes ofCRTC3 gene and their frequencies

單倍型HaplotypeG66478CC91297T頻率Frequency數(shù)量NumberHap1CC0.668528Hap2CT0.149118Hap3GC0.135107Hap4GT0.04737

表5 秦川牛CRTC3基因不同基因型組合生長性狀的平均值

Table 5 The average values of different genotype combinations in growth traits inCRTC3 of Qinchuan cattle

基因型組合Genotypecombination頻率Frequency體斜長/cmBL體高/cmWH腰高/cmHH尻長/cmRLCC-CC59.5%(235)134.77±14.02134.77±14.02123.99±7.37b42.55±4.56CC-CT14.7%(58)133.00±13.37133.00±13.37121.79±7.37B40.95±3.83BCC-TT7.60%(30)137.83±9.43137.83±9.43126.02±5.24Aa43.93±3.66AP0.1140.0730.0100.003基因型組合Genotypecombination頻率Frequency腰角寬/cmHW胸深/cmCD胸圍/cmCC坐骨端寬/cmPBWCC-CC59.5%(235)38.98±6.1859.64±7.60164.69±20.5319.06±3.81CC-CT14.7%(58)38.00±4.8757.85±6.29b159.40±17.06b18.34±4.05CC-TT7.60%(30)40.30±4.9761.70±6.05a168.33±14.46a19.03±1.96P0.0820.0190.0420.192

3 討 論

單倍型是同一染色體上能夠共同遺傳的多個基因座上等位基因的組合。D.Fallin等研究發(fā)現(xiàn)，在種群中單倍型比單個位點能夠更有效的得到傳遞，近年來在家畜多態(tài)性分析中單倍型分析得到越來越多的應用，研究者多利用單倍型分析來研究數(shù)量性狀位點(QTL)與家畜生產性能的關系[11]。與家畜生產性能相關的大多數(shù)性狀都是由多基因或是某一基因的多個位點共同調控的，所以在試驗中分析某一基因中單個位點的多態(tài)性往往不能準確得出基因或等位基因與性狀的真實相關性，需要同時加強對多個位點的綜合效應進行探討，分析結果的可靠性才更加有效[12]。桂林生等研究發(fā)現(xiàn)SIRT1和SIRT2基因的基因型組合對秦川牛眼肌面積和肌間脂肪有顯著影響[13]。張松研究發(fā)現(xiàn)CD36和KEAP1基因突變位點的基因型組合對秦川牛的體尺性狀有顯著影響[14]。

作為我國著名的五大地方黃牛之一的秦川牛，存在生長發(fā)育較慢，后軀肌肉欠充實等明顯缺陷[15]。目前，通過傳統(tǒng)的育種方法來改善牛的生長性狀是一件長期而艱巨的工作。研究人員已經發(fā)現(xiàn)的生長性狀相關的基因分子標記可以加快家畜育種工作進程，并縮短育種時間。目前，針對秦川牛的遺傳改良僅集中于基因單個位點的多態(tài)性研究[16-18]，鑒于基因單倍型分析的優(yōu)勢以及在畜禽上的逐步應用，本試驗挑選與機體脂肪代謝和能量相關的CRTC3基因，研究其多態(tài)性及單倍型組合與秦川牛生長性狀的關聯(lián)性。

CRTC3作為cAMP-CREB信號轉錄通路的新成員，在脂肪、肝和骨骼肌等胰島素敏感組織中與環(huán)磷腺苷反應元件結合物(CREB)協(xié)同激活調控糖和脂類的代謝[19]。相關研究表明，CRTC3基因的多態(tài)性位點在墨西哥裔美國人中與肥胖有關[7]。此外，Z.Ou等的研究表明，在中國漢族人群中CRTC3基因多態(tài)性rs11635252位點與超重有關[20]。本試驗通過PCR-RFLP對395頭秦川牛CRTC3基因進行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)了2個多態(tài)位點。經過與GenBank上牛CRTC3基因比對發(fā)現(xiàn)：G66478C的突變導致了絲氨酸到蘇氨酸的改變。通過基因分型在C91297T發(fā)現(xiàn)3種基因型，而G66478C只有兩種基因型。這可能與試驗中選擇的群體過小或者在進化過程中自然和人為定向選擇有關。相對于外顯子區(qū)域的突變，越來越多的研究表明內含子區(qū)域的突變也能夠對性狀產生顯著的影響。雖然內含子的突變不會對編碼的氨基酸序列發(fā)生影響，但其可能對順式作用原件的功能產生影響或者改變細胞內mRNA的可變剪切，進而對基因的功能或者表達造成影響[21-22]。研究表明綿羊MSTN基因內含子突變對綿羊的生長發(fā)育造成顯著的影響[23]。本試驗中，位于內含子區(qū)域的C91297T位點上的突變可顯著影響秦川牛的部分生長。通過CRTC3基因不同基因型組合與秦川牛生長性狀的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，CRTC3基因型組合CC-TT在腰高、尻長上極顯著高于CC-CT基因型組合的個體均值，在胸深、胸圍方面顯著高于CC-CT組合。因此在本試驗群體中，CC-TT可被視為一種最為優(yōu)秀的合并基因型。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)CRTC3基因在秦川牛中存在多態(tài)性且與生長性狀顯著關聯(lián)。G66478C位點GC基因型個體在體斜長方面極顯著高于CC型，GC基因型個體在胸深方面顯著高于CC型個體。C91297T位點CT基因型個體均值在體斜長、腰高、尻長、胸深方面極顯著高于TT基因型個體均值；CT基因型個體均值在體高、腰角寬和坐骨端寬方面顯著高于其他兩種基因型個體均值。CRTC3基因的優(yōu)勢基因型組合CC-TT在腰高、尻長指標上極顯著高于CC-CT基因型組合的個體均值，在胸深、胸圍方面顯著高于CC-CT組合?？梢試L試將CRTC3基因作為影響生長性狀的候選基因用于標記輔助選擇，為秦川牛選育工作提供科學依據(jù)。

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(編輯 郭云雁)

Association ofCRTC3 Gene Polymorphisms and Genotype Combination with Growth Traits of Qinchuan Cattle

XU Huai-chao1,ZAN Lin-sen1,2*,WANG Hong-bao1,2,NING Yue1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China;2.NationalBeefCattleImprovementCenter,Yangling712100,China)

The aim of this study was to investigate the possibility ofCRTC3 gene as candidate gene for growth performance in Qinchuan cattle, and search the molecular markers related to Qinchuan cattle growth traits. PCR-RFLP method was applied to detect the polymorphisms ofCRTC3 in 395 healthy Qinchuan cattle, and the association of its polymorphisms and genotype combination with growth traits of Qinchuan cattle was also analyzed. The result showed that 2 SNPs were identified, including G66478C in exon and C91297T in intron. At the G66478C locus, the cattle with genotype GC had greater body length and chest depth values than those with genotype CC(P<0.01 andP<0.05, respectively). At the C91297T locus, animals with genotype CT had greater body length, hip height, rump length and chest depth values than those with genotype TT(P< 0.01) . Animals with CC-TT had significantly greater hip height and rump length values than those with CC-CT(P< 0.01), and chest depth and chest circumference values for CC-TT were greater than CC-CT(P<0.05). Therefore, variations in theCRTC3 gene and the genotype combination CC-CT may be useful as molecular markers for growth traits in Qinchuan cattle breeding.

CRTC3; growth traits; genotype combination; molecular markers

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.005

2016-02-29

國家863計劃(2013AA102505)；國家科技支撐計劃(2015BAD03B04)；國家自然科學基金(31272411)；國家肉牛牦牛產業(yè)技術體系(CARS-38)； 陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2014KTZB02-02-01)

徐懷超(1989-)，男，山東聊城人，碩士生，主要從事動物生物技術研究， E-mail: 727751348@qq.com

*通信作者：昝林森，教授，主要從事秦川肉牛新品系選育、肉牛遺傳改良與種質創(chuàng)新等方面的研究，E-mail: zanlinsen@163.com

S823;S813.3

A

0366-6964(2016)11-2184-07