張彥青，李惠萍，涂京霞，房慧婧，李琳

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州510308；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

啤酒高分子蛋白檢測方法的評估及應(yīng)用

張彥青1，2，3，李惠萍2，涂京霞2，房慧婧2，李琳1

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州510308；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027）

通過對考馬斯亮藍法檢測啤酒高分子蛋白含量的操作方法進行優(yōu)化，提升其方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，優(yōu)化后該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性相對標準偏差(RSD)分別為3.68%和3.92%。同時，對該方法檢測的高分子蛋白含量與啤酒泡持性進行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，巴氏殺菌啤酒泡持值與高分子蛋白含量的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.923(P＜0.01)；純生啤酒在貯存3 d、1個月、2個月和4個月的泡持值和其高分子蛋白含量的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.700(P＜0.01)、0.739(P＜0.01)、0.899(P＜0.01)和0.883(P＜0.01)。表明該方法不僅能用于啤酒高分子蛋白含量的檢測，還能用于巴氏殺菌啤酒和純生啤酒泡持性的監(jiān)控。

啤酒；高分子蛋白；泡持性；考馬斯亮藍法

啤酒泡沫是啤酒外觀質(zhì)量評價的核心指標，是消費者判斷啤酒質(zhì)量的第一感覺[1]。啤酒中蛋白質(zhì)對泡沫的影響很大，與泡沫有關(guān)的高分子蛋白有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer proteins，LTPs）、蛋白質(zhì)Z、脂質(zhì)結(jié)合蛋白等[2-4]。除蛋白質(zhì)外，影響啤酒泡沫的還有其他指標，如脂肪等[5]。

國外研究人員對上述泡沫蛋白做了諸多方面的研究，詳細研究了其組成、結(jié)構(gòu)和功能[6-7]，國內(nèi)研究人員在此方面也有一些相關(guān)研究[8]。隨著蛋白質(zhì)分析技術(shù)尤其是二維電泳及質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，對啤酒泡沫蛋白的研究也愈加深入[9]。但迄今為止，這些研究主要集中在對泡沫蛋白本質(zhì)的剖析，而對泡沫蛋白波動量的研究較少，而且復(fù)雜的檢測方法不利于啤酒企業(yè)對泡沫蛋白的監(jiān)控。目前，啤酒企業(yè)尚缺乏簡單又行之有效地能反映泡持性的蛋白質(zhì)檢測方法。

采用考馬斯亮藍法檢測的啤酒高分子蛋白含量與啤酒泡持值相關(guān)性較強，已被很多研究者用于啤酒泡沫蛋白檢測，并對方法的檢測條件如吸光度值、反應(yīng)時間、pH值等進行了優(yōu)化[10-12]。在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，該方法檢測結(jié)果的重復(fù)性雖然較好，但在不同時間檢測結(jié)果的穩(wěn)定性則較差，這一缺點可能會限制該方法在啤酒企業(yè)的推廣利用。

本研究對考馬斯亮藍法檢測啤酒高分子蛋白含量的方法進行系統(tǒng)評價，同時，針對以往基于巴氏殺菌啤酒中高分子蛋白與泡持性研究情況，對純生啤酒泡持性和高分子蛋白含量的相關(guān)性進一步深入研究。以期改善和提高檢測方法的穩(wěn)定性，為啤酒企業(yè)提供簡單、方便、可靠的啤酒中高分子蛋白含量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴氏殺菌啤酒和純生啤酒：廣州珠江啤酒股份有限公司。

考馬斯亮藍G-25（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清蛋白（分析純）：上海伯奧生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：安徽安特食品股份有限公司；磷酸（分析純）：廣州市東紅化工廠；十二水合磷酸氫二鈉、檸檬酸（分析純）：廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

V3140型分光光度計：澳大利亞GBC儀器公司；Nibem-T Haffman泡沫測定儀：荷蘭Haffmans公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；HHW21-420 XMTB數(shù)顯調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；HI8417 pH計：意大利Hanna公司；MEDIFRIGER-BL型冷凍離心機：西班牙JP SELECTA S.A.儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 牛血清蛋白標準曲線的繪制

準確稱取40 mg牛血清蛋白，加蒸餾水溶解，并定容至200 mL，配制成200 mg/L牛血清蛋白標準溶液。分別取200mg/L牛血清蛋白標準溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL于試管中，加蒸餾水至10 mL，混勻，分別取1 mL上述標準溶液與5 mL考馬斯亮藍G-250染液，充分混勻，在恒定室溫下反應(yīng)10 min，測其在波長595 nm處的吸光度值，做3個平行試驗，繪制牛血清蛋白標準曲線。

1.3.2 高分子蛋白含量測定

稱取100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL體積分數(shù)為95%的乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，過濾至棕色試劑瓶中備用。啤酒樣品經(jīng)除氣后用蒸餾水稀釋4倍（準確吸取2.5 mL除氣啤酒，用蒸餾水定容至10 mL），取1 mL啤酒稀釋液與5 mL上述配制好的考馬斯亮藍G-250染色液混合均勻，在恒定室溫下反應(yīng)10 min，于波長595 nm處測定吸光度值，重復(fù)3次，根據(jù)牛血清蛋白標準曲線回歸方程計算啤酒中高分子蛋白的含量。

1.3.3 泡持值的測定

按照國標啤酒分析方法GB/T4928—2008《啤酒分析方法》中儀器法檢測啤酒泡持值，平行檢測兩次，取平均值[13]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件對試驗結(jié)果進行Pearson相關(guān)性分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清蛋白標準曲線的繪制

采用考馬斯亮藍法測定不同質(zhì)量濃度牛血清蛋白的吸光度值，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制出牛血清蛋白標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

由圖1可知，在牛血清蛋白質(zhì)量濃度為0～120 mg/L范圍內(nèi)，標準曲線回歸方程為y=0.006 5x+0.013 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6。結(jié)果表明，牛血清蛋白質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 考馬斯亮藍法檢測啤酒中高分子蛋白方法優(yōu)化

2.2.1 染色液顏色對檢測結(jié)果的影響

在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，染液在靜止放置時會出現(xiàn)上清液顏色變淺的現(xiàn)象。染液空白隨時間變化的情況結(jié)果見圖2。由圖2可知，染液在放置3周后吸光度值明顯下降。染液顏色變化對標準曲線斜率的影響也非常顯著，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以吸光度值（y）為縱坐標，繪制染液放置1周、2周和3周的標準曲線分別為：

這種標準曲線斜率的變化就會導(dǎo)致檢測結(jié)果較大的誤差。因此，每次比色時嚴格控制染液的顏色變化，盡量在1周內(nèi)進行檢測。

圖2 不同放置時間染液吸光度值的變化Fig.2 Changes of dye solution absorbance values at different time

2.2.2 比色液上層泡沫對檢測結(jié)果的影響

在用該方法檢測啤酒中高分子蛋白含量的過程中，發(fā)現(xiàn)染液和樣品混合后混合液澄清透明沒有氣泡的情況下，容易在液面上面產(chǎn)生泡沫，當泡沫比較多時會對吸光度值產(chǎn)生影響。為了清晰地展示泡沫厚度對吸光度值的影響，本研究選取2 mm泡沫厚度（檢測方法理想控制值）和5 mm泡沫厚度（混合不當容易導(dǎo)致的結(jié)果）對吸光度值的影響。圖3為這兩個厚度值下同一樣品平行檢測6次的結(jié)果，t檢驗發(fā)現(xiàn)兩組結(jié)果存在顯著性差異（P＜0.01）。因此，在檢測操作過程中，要盡量小心，不要使液面上面產(chǎn)生過多泡沫，控制泡沫的厚度為2 mm以內(nèi)。

圖3 比色液上層泡沫厚度對吸光度值的影響Fig.3 Effect of the upper foam thickness of color solution on the absorbance value

2.3 考馬斯亮藍法檢測結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性

通過上述改進，采用考馬斯亮藍法測定啤酒中高分子蛋白含量，在相同操作條件下，進行6次平行試驗，計算該方法檢測結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），重復(fù)性試驗結(jié)果見表1。由表1可知，6次平行試驗重復(fù)性結(jié)果RSD值為3.68%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表1 啤酒中高分子蛋白含量重復(fù)性試驗結(jié)果Table 1 Repetitive experiments results of high molecular protein contents in beer

按照相同操作方法，分別放置1 d、2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后測定啤酒樣品中高分子蛋白含量，計算方法穩(wěn)定性相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表2。由表2可知，啤酒中高分子蛋白含量在6 d內(nèi)，穩(wěn)定性試驗結(jié)果RSD值為3.92%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

表2 啤酒中高分子蛋白含量穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Stability experiments results of high molecular protein contents in beer

2.4 啤酒中高分子蛋白含量和泡持值的相關(guān)性分析

2.4.1 與普通巴氏殺菌啤酒泡持值的相關(guān)性

選取17種巴氏殺菌啤酒樣品，按照國標法檢測啤酒泡持值，并采用考馬斯亮藍法對其高分子蛋白含量進行檢測，結(jié)果見表3。

表3 巴氏殺菌啤酒中高分子蛋白含量與泡持值測定結(jié)果Table 3 Determination results of high molecular protein contents and foam stability value in pasteurized beer

由表3可知，按照高分子蛋白含量的大小對樣品進行排序，發(fā)現(xiàn)其與啤酒泡持值大小有較好的對應(yīng)性。對檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Pearson相關(guān)系數(shù)為0.923（P＜0.01），表明考馬斯亮藍法檢測的巴氏殺菌啤酒高分子蛋白含量與其泡持值呈顯著正相關(guān)，可以用該方法評價巴氏殺菌啤酒泡沫的質(zhì)量。

2.4.2 與純生啤酒泡持值的相關(guān)性

成品純生啤酒不經(jīng)過巴氏殺菌而采用物理膜過濾方式除菌，造成活性蛋白酶A的殘留，對高分子蛋白起到分解作用[15]。因此，純生啤酒在貯存過程中，高分子蛋白含量會一直處在變化過程中。為了研究高分子蛋白含量變化對純生啤酒泡持值的影響，本研究跟蹤分析了13組成品純生啤酒在貯存過程中高分子蛋白含量與泡持值的變化情況，并進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，純生啤酒貯存3d、1個月、2個月、4個月時，其高分子蛋白含量與泡持值都呈非常顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.700、0.739、0.899和0.883，這說明在同一時間內(nèi)，通過測定純生啤酒高分子蛋白含量高低能反映其泡持值的大小。但由于純生啤酒在貯存過程中，高分子蛋白含量與泡持值均出現(xiàn)變化，因此，縱向來看，泡持值與高分子蛋白含量之間的相關(guān)性呈現(xiàn)出一些規(guī)律性的變化，如盡管純生成品啤酒4個月后的泡持值與其在貯存過程中各個時間段高分子蛋白含量都呈正相關(guān)，但4個月時的泡持值與4個月時高分子蛋白含量的相關(guān)性更強（相關(guān)系數(shù)為0.883），與2個月、1個月和3 d時高分子蛋白含量的相關(guān)性較弱（相關(guān)系數(shù)本別為0.866、0.587和0.597）。貯存3 d時的泡持值與各個時間段的高分子蛋白含量也呈現(xiàn)相似的規(guī)律。因此，用考馬斯亮藍法檢測的高分子蛋白含量能夠反映純生啤酒泡持值的大小。

表4 純生啤酒貯存過程中高分子蛋白含量與泡持值的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of high molecular protein content and foam stability value during draft beer storage

3 結(jié)論

本研究對考馬斯亮藍法檢測啤酒中高分子蛋白含量的方法進行了評估，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，均滿足啤酒中高分子蛋白含量的檢測要求。在此基礎(chǔ)上，對普通巴氏殺菌啤酒和純生啤酒的高分子蛋白含量與其泡持性的相關(guān)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)該方法檢測的高分子蛋白含量不僅能很好地反映巴氏殺菌啤酒的泡持性，也能反映純生啤酒在貯存過程中的泡持性變化情況。因此，所建立的檢測蛋白的方法可用于啤酒企業(yè)對啤酒泡持性的質(zhì)量監(jiān)控。

[1]EVANS D E,TOLHURST R L,ROBINSON L H,et al.Application of innunological methods to differetiate between foam-positive and hazeactive proteins originating from malt[J].J Am Soc Brew Chem,2003, 61(2):55-62.

[2]KENNETH A L,GRAHAM G S,IAN P M.Beer polypeptides and silica gelpartⅡ.polypeptidesinvolvedinfoamformation[J].J Inst Brew,2003, 109(1):73-79.

[3]SORENSEN S B,BECH L M,MULDBJERG M,et al.Barley lipid transfer protein 1 is involved in beer foam formation[J].Tech Q Master Brew Assoc Am,1993,30:135-145.

[4]EVANS D E,HEJGAARD J.The impact of malt derived proteins on beer foam quality.Part I.The effect of germination and kilning on the level of protein Z4,protein Z7 and LTP1[J].J Inst Brew,1999,105(3):159-169.

[5]楊東升，羅先群，王新廣.CO2對啤酒發(fā)酵過程中酵母生長代謝及酯的形成影響[J].中國釀造，2013，32（4）：70-73.

[6]JEGOU S,DOULIEZ J,MOLLE D,et al.Purification and structural characterization of LTP1 polypeptides from beer[J].J Agr Food Chem, 2000,48(10):5023-5029.

[7]HEJGAAD J.Origin of a dominant beer protein,immunochemical identity with a-amylase-associated protein from barley[J].J Inst Brew,1977, 83(2):94-96.

[8]郝俊光，單連菊，董建軍，等.雙向電泳和MALDI TOF MS對啤酒泡沫蛋白的鑒定[J].啤酒科技，2010（9）：18-22.

[9]劉捷，喬雨軒，祝忠付，等.啤酒膠體穩(wěn)定性及穩(wěn)定助劑的研究進展[J].中國釀造2013，32（6）：1-4.

[10]HRR V,HERWIG W C.Determination of high molecular weight proteins in beer using coomassie blue[J].J Am Soc Brew Chem,1982, 40:46-50.

[11]李志江.考馬斯亮藍G250染色法測定啤酒中蛋白質(zhì)含量[J].釀酒，2008，35（1）：70-71.

[12]孫浩思，王宏華.制麥過程中浸麥水pH值對泡沫蛋白的影響[J].中國釀造，2010，29（10）：90-93.

[13]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.中國國家標準化管理委員會標準.GB/T 4928—2008啤酒分析方法[S].北京：中國標準出版社，2008.

[14]黃奕雯，戴玉杰，鐘成.基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬啤酒釀造過程中糖度及乙醇濃度的變化[J].中國釀造，2013，32（1）：25-27.

[15]董倩倩，張彥青，李惠萍，等.工業(yè)化釀造過程中酵母分泌蛋白酶A的規(guī)律及影響因素的研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36（12）：157-161.

Evaluation and application of the detection method for high molecular protein in beer

ZHANG Yanqing1,2,3,LI Huiping2,TU Jingxia2,FANG Huijing2,LI Lin1
(1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Guangzhou Zhujiang Brewery Co.,Ltd.,Guangzhou 510308,China; 3.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

Coomassie brilliant blue method for detection of high molecular protein content in beer was optimized to improve the repeatability and stability of the method.The relative standard deviation(RSD)of repeatability and stability of the optimized method were 3.68%and 3.92%,respectively. At the same time,the correlation between the high molecular protein content detected by the method and beer foam stability was analyzed.The results showed that the Pearson correlation coefficient between pasteurized beer foam stability value and high molecular protein content was 0.923(P＜0.01). The Pearson correlation coefficient between draft beer foam stability value and high molecular protein content in storage for 3 d,1 months,2 months and 4 months were 0.700(P＜0.01),0.739(P＜0.01),0.899(P＜0.01)and 0.883(P＜0.01),respectively.It was found that the method could not only be used to detect high molecular protein content in beer,but also could be used to monitor the foam stability of pasteurized beer and draft beer.

beer;high molecular protein;beer foam stability;coomassie brilliant blue method

TS261.2

0254-5071（2016）11-0172-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.036

2016-05-17

廣州市海珠區(qū)科技計劃項目（2013-ZD-01）

張彥青（1980-），男，高級工程師，博士，研究方向為釀酒工藝技術(shù)。