陳敏，崔海峰，馮才偉*，賈芳芳，楊春艷

（1.武漢中糧肉食品有限公司，湖北武漢430200；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京102206）

利巴韋林單克隆抗體制備以及酶聯(lián)免疫試劑盒的研究

陳敏1，崔海峰2，3，馮才偉2，3*，賈芳芳2，3，楊春艷2，3

（1.武漢中糧肉食品有限公司，湖北武漢430200；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京102206）

首先合成出利巴韋林半抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物得到抗利巴韋林單克隆抗體，制備利巴韋林殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)雞肉、豬肉中利巴韋林殘留量。結(jié)果表明：該試劑盒對(duì)雞肉、豬肉的檢測(cè)限分別為4.88 μg/kg、4.42 μg/kg，半抑制濃度（IC50）為7.9 μg/L，回收率為80%～105%，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為0～81 μg/L，批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜10%。4℃下能夠保存12個(gè)月，穩(wěn)定性較好。

利巴韋林；半抗原制備；酶聯(lián)免疫法

利巴韋林（ribavirin，RBV）是一種廣譜抗病毒藥物，該種藥物具有高效性，被用于多種病毒治療，然而不法分子將其用于畜牧養(yǎng)殖，在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中違規(guī)濫用，使得該類(lèi)藥物通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)產(chǎn)生不良影響[1-4]。由于利巴韋林藥物容易出現(xiàn)上述情況，因此農(nóng)業(yè)部發(fā)布了2005年第560號(hào)公告《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》和農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]33號(hào)文件《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，明確規(guī)定了禁止利巴韋林等藥物的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和使用，違者按生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)假獸藥和使用禁用獸藥處理。

目前，常用于檢測(cè)利巴韋林的方法有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、放射免疫法等[5-9]，而國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中利巴韋林殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法。原因可能是由于動(dòng)物源性食品的基質(zhì)復(fù)雜，前處理方法不完善造成的，另外，利巴韋林屬于核苷類(lèi)化合物，與動(dòng)物組織中的某些自身物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，因此不易準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測(cè)。又由于利巴韋林檢測(cè)的實(shí)際需求，本研究利用酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)動(dòng)物組織中利巴韋林藥物的殘留量，自主研發(fā)制備出檢測(cè)成本低、操作方法簡(jiǎn)單、靈敏度較高的檢測(cè)試劑盒，極易應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中，而儀器方法不僅使用的儀器昂貴，需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，而且大型儀器不適于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)，該試劑盒更適于基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；洗滌液（向0.02 mol/L PBS中加入1%吐溫）、封閉液（在0.02 mol/L PBS中加入0.05%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA））、底物顯色液（由A液和B液組成，A液為過(guò)氧化氫，B液為四甲基聯(lián)苯胺）、終止液（2 mol/L H2SO4）：北京百欣試劑公司；雞肉、豬肉：市售；Balb/c小鼠、無(wú)病原體羊：北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3酶標(biāo)儀：上海雷勃分析儀器有限公司；HFJ-10振蕩器、MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；2L/R201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海一科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的制備

（1）半抗原的制備

a）取5-硝基-1H-1,2,4-噻唑-3-羧酰胺5 g，加β-D-呋喃核糖-1,2,3,5-四乙酸酯3.26 g，加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，加雙（對(duì)硝基苯基）磷酸酯1.2 g，油浴加熱，170℃條件下反應(yīng)2 h。停止反應(yīng)，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯2∶1（V/V）洗脫分離，得到中間體a（4.15 g）。

b）取中間體a加氫氧化鈉水溶液溶解，60℃條件下反應(yīng)2 h，停止反應(yīng)，中和滴加6 mol/L的濃鹽酸，中和至pH=7（采用1-14試紙監(jiān)測(cè)），旋蒸蒸干，加80 mL無(wú)水乙醇。乙醇重結(jié)晶，得到硝基利巴韋林（2.11 g）。

c）取硝基利巴韋林（分子量415.31）2.1 g，加甲醇溶解，加催化劑（即摩爾分?jǐn)?shù)5%的鈀）鈀碳，加氫氣，三口圓底燒瓶中，換氣，加氫氣球。室溫?cái)嚢? h，檢測(cè)，薄層層析（thin layer chromatography，TLC）檢測(cè)，展開(kāi)劑二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=500 μL∶500 μL∶20 μL，待原料反應(yīng)完全，抽濾，除去鈀碳，旋蒸蒸干，得到油狀物，1,2-二氯乙烷重結(jié)晶，得到氨基利巴韋林半抗原產(chǎn)物（1.21 g）。利巴韋林半抗原合成途徑見(jiàn)圖1。

圖1 利巴韋林半抗原合成途徑Fig.1 Synthesis path of ribavirin hapten

（2）免疫原的制備

取15 mg氨基利巴韋林半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）中，用pH 9.1的碳酸鹽緩沖液（carbonate buffer solution，CB）稀釋?zhuān)游於?.2 mL，攪拌反應(yīng)2 h，得到A液。稱(chēng)取牛血清蛋白（BSA）50 mg，使之充分溶解在4 mL CB（pH 9.5）中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫條件下攪拌24 h，用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）于4℃條件透析（透析袋截留分子質(zhì)量8 000～14 000 u）3 d，每天換3次透析液。分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）包被原的制備

取10 mg氨基利巴韋林半抗原，溶解于1 mL稀鹽酸（0.12 mol/L）中，冷卻到0℃攪拌，亞硝酸鈉水溶液（含亞硝酸鈉3 mg）0.5 mL，攪拌1 h，得到A液。稱(chēng)取卵清蛋白（ovalbumin，OVA）50mg，使之充分溶解在4mLCB（pH9.0）中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于低溫（0～5℃）條件下攪拌4 h；用0.01 mol/L的PBS于4℃透析（透析袋截留分子質(zhì)量8 000～14 000 u）3 d，每天換3次透析液。分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備酶標(biāo)記抗體：是酶標(biāo)記抗抗體，即酶標(biāo)記二抗

按照1.3.1步驟得到免疫原后，將其注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，進(jìn)行免疫，得到利巴韋林單克隆抗體[10]，用該單克隆抗體免疫無(wú)病原體羊，得到羊抗鼠抗體[11]，然后將羊抗鼠抗體與辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)[12]，即得到酶標(biāo)記抗體。

1.3.3 篩選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標(biāo)板

在測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm，抗原稀釋倍數(shù)依次為1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000；單克隆抗體稀釋倍數(shù)依次為1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶標(biāo)記抗體液的稀釋倍數(shù)為1∶1 000時(shí)；分別測(cè)定0、1 μg/L質(zhì)量濃度的利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，并按如下公式計(jì)算百分吸光率：

百分吸光率（即抑制率）=（標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值/0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值）×100%

在酶標(biāo)板每孔包被100 μL抗原包被液，在37℃條件下放置2 h，隨后清洗酶標(biāo)板，再加入150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%BSA的0.02 mol/L PBS緩沖液，在37℃條件下放置2 h[13]，即完成酶標(biāo)板的制備。

1.3.4 樣本的前處理方法

稱(chēng)取（1.00±0.05）g絞碎的雞肉或豬肉樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入10 mL甲醇，用振蕩器振蕩2 min，混勻，3 000 g室溫（20～25℃）離心5 min；移取1 mL上層有機(jī)相至10 mL潔凈干燥玻璃管中，（50～60℃）水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤?mL復(fù)溶工作液，渦動(dòng)3min；取50mL用于分析。

1.3.5 利用酶標(biāo)板檢測(cè)樣本

依次往酶標(biāo)板中加入50 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為0、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L、81 μg/L）及雞肉、豬肉樣本溶液，每孔均為50 mL，然后再加入50 mL抗體工作液，25℃條件下，避光反應(yīng)30 min；洗滌酶標(biāo)板，然后每孔加入100 mL酶標(biāo)二抗，25℃條件下，避光反應(yīng)30 min；洗滌酶標(biāo)板，每孔先后加入50 μL過(guò)氧化氫和50 μL四甲基聯(lián)苯胺，25℃條件下，避光反應(yīng)15 min；每孔加入50 mL 2 mol/LH2SO4溶液終止顯色反應(yīng)，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定酶標(biāo)板每孔的OD450nm值，每孔2個(gè)重復(fù)。

1.3.6 計(jì)算樣本中利巴韋林含量

根據(jù)1.3.5測(cè)定的OD450nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，橫坐標(biāo)為利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg/L）的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為lg（B（OD450nm（1 μg/L））/B0（OD450nm（0 μg/L）），然后將樣本的OD450nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可得到其相應(yīng)的質(zhì)量濃度，用該質(zhì)量濃度乘以稀釋倍數(shù)即為動(dòng)物樣本中利巴韋林殘留量。

1.3.7 檢測(cè)性能

（1）計(jì)算檢測(cè)限

測(cè)定雞肉、豬肉空白樣本各20份，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為方法的檢測(cè)限（limit of detection，LOD），即可檢測(cè)出的最低被測(cè)物濃度[14]。

（2）精密度和準(zhǔn)確度

分別向雞肉、豬肉樣本中添加利巴韋林，使其藥物質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，測(cè)定添加回收率，以此評(píng)價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度。測(cè)定3批酶標(biāo)板，每個(gè)樣本做4個(gè)平行），計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），該指標(biāo)可以評(píng)價(jià)試劑盒的精密度。

（3）測(cè)定穩(wěn)定性

將試劑盒在4℃條件下保存12個(gè)月，每個(gè)月測(cè)定半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）、450 nm波長(zhǎng)條件下的最大吸光度值、雞肉樣本的添加回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度

測(cè)定不同單克隆抗體稀釋倍數(shù)以及抗原稀釋倍數(shù)條件下，質(zhì)量濃度為0和1 μg/L的利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值，并計(jì)算百分吸光率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗原、抗體的濃度優(yōu)選結(jié)果Table 1 Optimized detection results of antigen and antibody concentration

通過(guò)多年驗(yàn)證，當(dāng)百分吸光率在70%～85%時(shí)，以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)[15]。由表1結(jié)果可知，此次篩選的抗原稀釋倍數(shù)為16 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數(shù)為160 000。

2.2 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)，lg（B/B0）（y）為縱坐標(biāo)，繪制利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程Fig.2 Regression equation of standard curve of ribavirin

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=-1.735x+1.561，相關(guān)系數(shù)R2為0.997。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的范圍為0～81 μg/L，IC50為7.9 μg/L。

2.3 計(jì)算檢測(cè)限

20個(gè)雞肉、豬肉空白樣本中利巴韋林的檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表2、表3。檢測(cè)限以測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

表2 雞肉空白樣本檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Table 2 Detection limit results of chicken blank samples

表3 豬肉空白樣本檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Table 3 Detection limit results of pork blank samples

由表2、表3可知，20個(gè)雞肉空白樣本中利巴韋林的檢測(cè)結(jié)果平均值為1.91 μg/kg，最低檢測(cè)限為4.88 μg/kg；20個(gè)豬肉空白樣本中利巴韋林的檢測(cè)結(jié)果平均值為1.60 μg/kg，最低檢測(cè)限為4.42 μg/kg。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

測(cè)定添加不同質(zhì)量濃度利巴韋林的雞肉、豬肉樣本，其精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表4、表5。

表4 雞肉樣本精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Precision and accuracy tests results of chicken samples

表5 豬肉樣本精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Precision and accuracy tests results of pork samples

由表4可知，添加不同質(zhì)量濃度利巴韋林的雞肉樣本，回收率范圍是85.0%～99.3%，當(dāng)添加量為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg時(shí)，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）是5.7%～9.7%；批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為7.0%～9.6%。

由表5可知，添加不同質(zhì)量濃度利巴韋林的豬肉樣本，回收率范圍是89.6%～101.4%，當(dāng)添加量為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg時(shí)，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%～9.5%；批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）是6.0%～7.8%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試劑盒保存在4℃條件下，測(cè)定的試劑盒的最大吸光度值、IC50及回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，測(cè)定的無(wú)添加利巴韋林試劑盒的最大百分吸光度值范圍是1.51～1.92，IC50范圍是6.7～8.3 μg/L，利巴韋林添加回收率范圍是80.9%～103.3%，由此可見(jiàn)，各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)。從測(cè)定結(jié)果可知，該試劑盒在4℃條件下至少能夠保存12個(gè)月。

表6 試劑盒在4℃保存的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Stability tests results of the kit kept at 4℃

2.6 討論

2014年，陳燕等[16]對(duì)豬肉和雞肉中的利巴韋林進(jìn)行了測(cè)定，所用的方法是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測(cè)限均為10 μg/kg。鄭鋅等[17-19]分別用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了雞肉中的利巴韋林，檢出限在1～4 μg/kg。目前檢測(cè)畜禽肉中利巴韋林藥物含量的方法集中在儀器方法，鮮有快速檢測(cè)方法，本研究對(duì)雞肉、豬肉的檢測(cè)限分別為4.88 μg/kg、4.42 μg/kg，達(dá)到了和儀器檢測(cè)利巴韋林相同水平的檢測(cè)限數(shù)量級(jí)，而且快速檢測(cè)方法在應(yīng)用方面具有成本低、操作方便、快速等優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)制備利巴韋林半抗原、利巴韋林單克隆抗體，篩選出抗原包被濃度和單克隆抗體濃度，運(yùn)用酶聯(lián)免疫法研發(fā)出利巴韋林酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍為0～81 μg/L，對(duì)雞肉、豬肉的檢測(cè)限分別為4.88 μg/kg、4.42 μg/kg，回收率范圍均在80%～105%，批內(nèi)/批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜10%。由于該試劑盒能夠在4℃下保存12個(gè)月，表明該試劑盒穩(wěn)定性較好[20]。

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Production of ribavirin monoclonal antibodies and its ELISA kit for rapid detection

CHEN Min1,CUI Haifeng2,3,FENG Caiwei2,3*,JIA Fangfang2,3,YANG Chunyan2,3
(1.COFCO Wuhan Meat Product Limited,Wuhan 430200,China; 2.Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206,China; 3.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection,Beijing 102206,China)

Synthesized ribavirin hapten was prepared from a sequence of reactions,and ribavirin monoclonal antibodies were prepared by animal immune.Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit was prepared which was used to test ribavirin in chicken and pork.Then the limit of detection and relative standard deviation(RSD)of ribavirin ELISA kit was studied.Results showed that the limit of detection was 4.88 μg/kg in chicken and 4.42 μg/kg in pork with half maximal inhibitory concentration(IC50)values of 7.9 μg/L.The recovery rates were between 80%-105%.The linear range of the standard curve was 0-81 μg/L,and the intra and inter-assay RSD were both less than 10%.The stability tests results revealed that the kit can be kept at 4℃for 12 months.

ribavirin;hapten preparation;ELISA

TS207.3

0254-5071（2016）11-0167-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.035

2016-07-29

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（16275507D）

陳敏（1986-），女，助理工程師，本科，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。

*通訊作者：馮才偉（1978-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)技術(shù)。