離子液體中胰島素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的分子動(dòng)力學(xué)模擬

潘曉莉，李代禧，魏冬青

?

離子液體中胰島素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的分子動(dòng)力學(xué)模擬

潘曉莉1，李代禧1，魏冬青2

（1上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093；2上海交通大學(xué)微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

離子液體作為一種新型綠色溶劑，由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性研究。選用熱敏性蛋白藥物胰島素作為研究對(duì)象，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，從分子層面上研究不同種類的離子液體對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定效果。結(jié)果表明，與純水體系相比，在常溫下離子液體能夠有效地穩(wěn)定胰島素的分子結(jié)構(gòu)，且體系中陰離子的氫鍵堿性越弱，陽離子的烷基鏈越短，對(duì)胰島素分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用越強(qiáng)。并深入分析不同烷基鏈長度的二氰胺類離子液體與胰島素之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相較于長烷基鏈離子液體，短烷基鏈離子液體與胰島素之間的相互作用更強(qiáng)，揭示了后者能更好地維持和穩(wěn)定胰島蛋白的分子結(jié)構(gòu)。

離子液體；胰島素；蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；相互作用能；分子模擬

引 言

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，蛋白類藥物已成為生物技術(shù)新藥的主要類型，并逐步轉(zhuǎn)為商業(yè)化生產(chǎn)。然而，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性極大程度地限制了其醫(yī)學(xué)以及商業(yè)應(yīng)用[1-2]。由此，對(duì)熱敏性蛋白藥物穩(wěn)定性的不斷探索一直是生物制藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。胰島素具有降低血糖的功能，是很多糖尿病患者的必備藥物。同時(shí)，它也是一種非常典型的熱敏性蛋白藥物[3]。胰島素常以六聚體的結(jié)構(gòu)存在，作為緩釋劑，但以單體結(jié)構(gòu)發(fā)揮其生理功能。胰島素單體在常溫下極其不穩(wěn)定，常因其結(jié)構(gòu)變性而失去生物活性[4]。

與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比，離子液體具有其獨(dú)特的理化性質(zhì)，如極低的熔點(diǎn)和蒸氣壓、高極性和熱穩(wěn)定性、可調(diào)的溶解能力等。作為一種新型“綠色溶劑”，離子液體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性研究[5-6]。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白質(zhì)在離子液體中具有良好的穩(wěn)定性[7-12]。例如在[chol][dhp]（膽堿磷酸二氫鹽）中，HAS（人血清蛋白）的三級(jí)折疊結(jié)構(gòu)保持不變[10]；另有報(bào)道木瓜蛋白酶在[Emim][BF4]（1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽）中具有較高的催化活性[11]。此外，Yao等[12]考察二元離子液體對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂肪酶的活性結(jié)構(gòu)在[C4mim][PF6]（1-丁基-3-甲基咪唑六氟硼酸鹽）- [C4mim][BF4]（1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽）混合體系中得到較好的保持。因此，研究離子液體的性質(zhì)與熱敏性蛋白藥物穩(wěn)定性之間的關(guān)系，對(duì)離子液體的分子設(shè)計(jì)及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定保護(hù)具有重要意義。

本文以胰島素單體為研究對(duì)象，選擇10種不同種類的離子液體作為溶劑，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬（molecular dynamic，MD）方法[13]，從分子層面上探討離子液體氫鍵堿性的強(qiáng)弱及烷基鏈的長短與胰島蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性之間的差異性。以期突破實(shí)驗(yàn)研究的局限性，并與國際上提出的“綠色化學(xué)”接軌，對(duì)研究離子液體穩(wěn)定熱敏性蛋白藥物具有一定的參考作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備

本文選用了10種咪唑類離子液體： [C4mim][NO3]（1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽）、[C4mim][CH3SO3] （1-丁基-3-甲基咪唑甲基磺酸鹽）、[C4mim][Cl] （1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽）、[C4mim][OAC]（1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽）和[Cmim] [DCA]（4, 6, 8, 10, 12, 14）（1-烷基-3-甲基咪唑二氰胺鹽）。所有的離子液體初始分子結(jié)構(gòu)（圖1）均取自于Chemical數(shù)據(jù)庫，并利用Gaussian09軟件包在HF/6-31G* 方法下進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到最終的離子液體結(jié)構(gòu)[14]。

圖1 離子液體的分子結(jié)構(gòu)

胰島素的初始結(jié)構(gòu)取自于PDB數(shù)據(jù)庫（ID：3inc[15]），刪除其他原子得到經(jīng)二硫鍵共價(jià)鍵合的胰島素單體，如圖2所示。

圖2 胰島素的初始三維結(jié)構(gòu)

1.2 模擬過程

分子動(dòng)力學(xué)模擬方法采用Gromacs5.0.5[16]軟件包，其中胰島蛋白選用Amber99sb-ildn[17]分子力場(chǎng)，離子液體選用Amber[18]通用分子力場(chǎng)，水分子選用Tip4p[19]模型。本次模擬中，時(shí)間步長設(shè)定為2fs，范德華分子間相互作用和靜電相互作用的截?cái)嗑O(shè)為1.0nm，靜電相互作用的遠(yuǎn)程修正采用PME（particle mesh Ewald）[20]方法。系統(tǒng)壓力采用Berendsen[21]方法控制為1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，并將velocity-rescal[22]方法用于溫度的控制，模擬溫度設(shè)為300K。

首先，建立一個(gè)10 nm×10 nm×10 nm的周期性體系，在每個(gè)體系中分別添加1個(gè)胰島素單體分子、400個(gè)離子液體及相應(yīng)的抗衡離子，共構(gòu)建了10個(gè)不同種類的離子液體體系，各體系組成如表1所示。另外構(gòu)建了胰島素的純水體系作為參考體系。每個(gè)體系均采用最速下降法[23]進(jìn)行1 ns的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，接著在NPT系綜下進(jìn)行10 ns的限制性分子動(dòng)力學(xué)模擬，使離子液體或水分子在胰島素周圍均勻分布。然后在相同系綜下對(duì)體系進(jìn)行常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬，所有體系的模擬時(shí)間長度為60 ns。取最后5 ns的模擬軌跡用于分析胰島素的結(jié)構(gòu)保護(hù)結(jié)果。

表1 不同種類離子液體體系的組成

2 結(jié)果和討論

2.1 不同氫鍵堿性的離子液體對(duì)熱敏性蛋白穩(wěn)定性的影響

2.1.1 [C4mim]系列離子液體體系中胰島素的整體構(gòu)象變化分析 均方根偏差[24]（root mean square deviation，RMSD）可以反映特定構(gòu)象與初始結(jié)構(gòu)的相似程度，其值越低，表明特定構(gòu)象與初始結(jié)構(gòu)的差異性越小[25]。通過計(jì)算各體系中胰島素的RMSD值（圖3）表征不同氫鍵堿性的離子液體對(duì)熱敏性蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性影響。由圖3可知，相較于純水體系，離子液體體系中胰島素的RMSD值大幅度降低，且隨著離子液體氫鍵堿性的減弱（[OAC]-＞[Cl]-＞[CH3SO3]-＞[NO3]-＞[DCA]-）[26]，RMSD值降低的幅度增加。這說明離子液體能有效穩(wěn)定胰島素的分子結(jié)構(gòu)，且氫鍵堿性較弱的離子液體對(duì)胰島蛋白表現(xiàn)出更優(yōu)的穩(wěn)定效果。而氫鍵堿性較強(qiáng)的離子液體對(duì)胰島素呈現(xiàn)出較弱的穩(wěn)定性，是因?yàn)殡x子液體的氫鍵堿性越強(qiáng)，越容易破壞維持蛋白質(zhì)高級(jí)有序結(jié)構(gòu)的作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的穩(wěn)定性降低[26-27]。

圖3 各體系中胰島素的RMSD值

2.1.2 [C4mim]系列離子液體體系中胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異性分析 胰島素的RMSD值體現(xiàn)蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的變化，要得到離子液體氫鍵堿性的強(qiáng)弱對(duì)胰島素局部結(jié)構(gòu)的影響，還需對(duì)各體系中胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。因此，通過DSSP[28]（definition of secondary structure of proteins）軟件統(tǒng)計(jì)了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，與初始結(jié)構(gòu)相比，純水體系中胰島素的α-螺旋數(shù)目大幅度減少，其無規(guī)則卷曲數(shù)目則大幅度增加；而在不同氫鍵堿性的離子液體中，胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)并未大量轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲，這表明相較于純水體系，離子液體具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的作用。特別是在氫鍵堿性較弱的[C4mim][DCA]體系中，胰島素的二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎和初始結(jié)構(gòu)一致，說明該種離子液體對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)效果。但隨著離子液體氫鍵堿性的增強(qiáng)（[NO3]-＜[CH3SO3]-＜[Cl]-＜[OAC]-），胰島素的α-螺旋數(shù)目呈減少趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角數(shù)目隨之增加。表明離子液體的氫鍵堿性影響胰島蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，氫鍵堿性越強(qiáng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性越弱。

圖4 各體系中胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

2.2 不同長度烷基鏈的離子液體對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響

2.2.1 [DCA]系列離子液體體系中胰島素的結(jié)構(gòu)差異性分析 離子液體對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性由陰、陽離子的理化性質(zhì)共同決定。由2.1節(jié)可得，氫鍵堿性較弱的[C4mim][DCA]更能穩(wěn)定熱敏性蛋白藥物的分子結(jié)構(gòu)。因此，為了探討離子液體的烷基鏈長度對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響，計(jì)算不同長度烷基鏈的[DCA]類離子液體體系中胰島素的RMSD值（圖5）。在[Cmim][DCA]（4～14）體系中，隨著離子液體烷基鏈長度的增加（值增加），胰島蛋白的RMSD值呈上升趨勢(shì)，且當(dāng)烷基鏈上的碳原子個(gè)數(shù)≥10時(shí)，該值上升的幅度變大。說明胰島蛋白的穩(wěn)定性與離子液體的烷基鏈長度密切相關(guān)，短烷基鏈咪唑類離子液體能有效穩(wěn)定胰島素的分子結(jié)構(gòu)，當(dāng)陽離子的烷基鏈較長時(shí)，離子液體對(duì)胰島素的穩(wěn)定效果明顯減弱。

圖5 各體系中胰島素的RMSD值

Yan等[29]用熒光光譜法研究在一系列不同長度烷基鏈的離子液體中α-胰凝乳蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，得出該酶能穩(wěn)定存活于[Cmim][Br]（4, 6, 8）（1-烷基-3-甲基咪唑溴鹽）中，相反地，在[C10mim][Br]中該酶的催化活性較大程度地降低。婁文勇等[11]通過高效液相色譜法研究離子液體的組成對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在[Cmim][BF4]（2～6）（1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽）介質(zhì)中，酶活性隨著離子液體烷基鏈長度的縮短而提高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文通過分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究得出胰島素在短烷基鏈咪唑類離子液體中穩(wěn)定性更優(yōu)的結(jié)果一致，表明短烷基鏈離子液體確實(shí)更能穩(wěn)定胰島蛋白的分子結(jié)構(gòu)。

為深入分析蛋白質(zhì)在不同長度烷基鏈離子液體中的結(jié)構(gòu)差異性，詳細(xì)統(tǒng)計(jì)了不同烷基鏈長度的離子液體體系中胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)目的變化，結(jié)果示于圖6。從圖中可以觀察到，相較于初始結(jié)構(gòu)，[Cmim][DCA] (4～ 8)體系中胰島蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均未發(fā)生較大變化；而在[Cmim][DCA]（10～14）體系中，隨著離子液體烷基鏈長度的持續(xù)增加，蛋白質(zhì)的α-螺旋數(shù)目呈降低趨勢(shì)，其β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲數(shù)目均隨之小幅度升高。這說明短烷基鏈離子液體能夠有效穩(wěn)定胰島蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；相反地，長烷基鏈離子液體體系中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化，且隨著烷基鏈長度的增加，變化越劇烈。

圖6 各體系中胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

2.2.2 [DCA]系列離子液體體系中離子液體與胰島素之間的相互作用分析 離子液體通過與胰島素之間的相互作用發(fā)揮其穩(wěn)定熱敏性蛋白活性結(jié)構(gòu)的功能。分別計(jì)算[DCA]系列離子液體體系中陰離子、陽離子與胰島素之間的相互作用能[圖7(a)]，表征不同烷基鏈長度的離子液體與蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度。觀察圖7(a)可知，隨著陽離子烷基鏈長度的持續(xù)縮短，陽離子、陰離子與胰島蛋白之間的相互作用能均增大，且陽離子烷基鏈越長，對(duì)陰離子與胰島素之間相互作用能的影響越大。圖7(b)描述了不同長度烷基鏈離子液體體系中胰島素表面與陽離子之間的徑向分布函數(shù)，第一個(gè)峰的峰值表示二者之間最強(qiáng)的相互作用[30]。由()分析得出，隨著體系中烷基鏈長度的持續(xù)增大，第一個(gè)峰的峰值呈降低的趨勢(shì)，且當(dāng)烷基鏈上的碳原子個(gè)數(shù)≥10時(shí)，該峰值降低幅度增大。這說明與長烷基鏈咪唑類離子液體相比，短烷基鏈咪唑類離子液體與胰島素之間呈現(xiàn)出更強(qiáng)的相互作用。這些數(shù)據(jù)表明相較于長烷基鏈離子液體，短烷基鏈離子液體通過較強(qiáng)的相互作用吸附和覆蓋在胰島素的表面，有效穩(wěn)定熱敏性蛋白胰島素的分子結(jié)構(gòu)。這也驗(yàn)證了2.2.1節(jié)中胰島蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的分析結(jié)果。

圖7 各體系中陰、陽離子與胰島素之間的相互作用

(a) total energy between cations, anions and insulin; (b) radial distribution function between canion and surface of insulin

為了進(jìn)一步闡釋離子液體的烷基鏈長度如何影響離子液體與胰島素之間的相互作用，分別計(jì)算體系中陽離子的1-甲基咪唑基和烷基與胰島素之間的相互作用能（表2）。分析表2可得，6個(gè)體系中1-甲基咪唑基與胰島素之間的相互作用能均遠(yuǎn)大于烷基與胰島素之間的。說明陽離子主要依靠其1-甲基咪唑基與胰島素之間的相互作用穩(wěn)定蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，這可能是由于陽離子的正電荷主要分布在其1-甲基咪唑基上。為此分別分析了陽離子中1-甲基咪唑基和烷基與胰島素之間的非鍵相互作用，結(jié)果如表2所示。比較表中數(shù)據(jù)可得，陽離子的1-甲基咪唑基與胰島素之間的靜電相互作用大于范德華相互作用；相反地，陽離子的烷基與胰島素之間的主要相互作用為范德華相互作用。這證實(shí)了之前得出的猜想，陽離子的正電荷分布在咪唑環(huán)靠近甲基的N原子上，從而使帶一個(gè)正電荷的1-甲基咪唑基與胰島素表面的負(fù)電勢(shì)氨基酸形成較強(qiáng)的靜電相互作用；而陽離子的烷基部分幾乎呈電中性，通過較弱的范德華相互作用吸附在胰島蛋白表面。

Note:total—total interaction energy;ele—electrostatic interaction energy;vdw—van der Waals interaction energy.

長烷基鏈[C14mim][DCA]體系中陽離子與胰島蛋白表面的直接吸附作用（圖8）表明，與胰島蛋白表面有直接吸附作用的是陽離子的1-甲基咪唑基，其烷基部分并未全部吸附在蛋白質(zhì)的表面。進(jìn)一步揭示了離子液體的1-甲基咪唑基與胰島素之間形成的靜電吸引作用提供了一種約束作用，抑制了蛋白質(zhì)的伸展變化，有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

圖8 [C14mim][DCA]體系中陽離子與胰島素表面直接吸附作用示意圖

(blue part represents surface of insulin; purple part represents stick model of cation; green circles represent adsorption between surface of insulin and cation)

2.2.3 [DCA]系列離子液體體系中胰島素與離子液體之間的接觸數(shù) 接觸數(shù)是指分子間發(fā)生相互作用的原子接觸個(gè)數(shù)，該參數(shù)被用來表征兩分子之間相互作用的強(qiáng)弱[31]。因此，通過Gromacs中的mindist程序分別計(jì)算了胰島素與陰離子和陽離子的1-甲基咪唑基之間的接觸數(shù)[32]（如圖9），表征胰島素與陰、陽離子之間的相互作用強(qiáng)度。

觀察圖9可得，隨著陽離子烷基鏈長度的增加，胰島素與陰離子和陽離子的1-甲基咪唑基之間的接觸數(shù)均呈降低趨勢(shì)，說明胰島素與陰、陽離子之間的相互作用強(qiáng)度均隨著陽離子烷基鏈長度的增加而減弱。這是因?yàn)殚L烷基鏈陽離子的結(jié)構(gòu)較大，使體系中陰、陽離子吸附在胰島蛋白表面的概率均較小，二者之間的原子接觸數(shù)也較少，導(dǎo)致陰、陽離子與胰島素之間的相互作用能較低（見圖7）。這揭示了離子液體的烷基鏈長度較大程度地影響其與蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度，陽離子結(jié)構(gòu)較小的短烷基鏈咪唑類離子液體與胰島素之間具有較強(qiáng)的相互作用，進(jìn)而顯示出對(duì)熱敏性蛋白藥物更好的保護(hù)性。

圖9 胰島素與陰離子和陽離子的1-甲基咪唑基之間的接觸數(shù)

3 結(jié) 論

本文利用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，從分子水平上闡釋了離子液體氫鍵堿性的強(qiáng)弱及烷基鏈的長短對(duì)熱敏性蛋白藥物胰島素穩(wěn)定性的影響。分析結(jié)果表明，離子液體，特別是氫鍵堿性較弱且烷基鏈較短的離子液體能有效穩(wěn)定胰島素的分子結(jié)構(gòu)。離子液體的陽離子主要依靠其1-甲基咪唑基與胰島素之間的靜電相互作用穩(wěn)定蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。且相較于長烷基鏈[DCA]離子液體，分子結(jié)構(gòu)較小的短烷基鏈[DCA]離子液體與胰島素之間的相互作用更強(qiáng)，進(jìn)一步揭示了短烷基鏈咪唑類離子液體對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定效果更優(yōu)。

[1] 王宇新, 周曉巍, 黨穎, 等. 提高蛋白質(zhì)和多肽類藥物代謝穩(wěn)定性的研究進(jìn)展 [J]. 生物技術(shù)通訊, 2005, 16 (6): 665-667. WANG Y X, ZHOU X W, DANG Y,. Progress in the stability of protein and polypeptide drugs [J]. Letters in Biotechnology, 2005, 16 (6): 665-667.

[2] 任勇, 丁東平, 渠剛, 等. 蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定性研究進(jìn)展 [J]. 華南國防醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 20 (4): 31-33. REN Y, DING D P, QU G,. Advances stability of the protein drugs [J]. Military Medical Journal of South China, 2006, 20 (4): 31-33.

[3] RICHTER B, NEISES G. ‘Human’ insulinanimal insulin in people with diabetes mellitus [J]. Cochrane Database Syst. Rev., 2002, 3 (3): CD003816.

[4] 李代禧, 張燕, 郭柏松, 等. 低溫干燥過程中LEA蛋白對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究 [J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2013, 30 (4): 854-859. LI D X, ZHANG Y, GUO B S,. Investigation on bioactive protection of LEA protein for insulin by molecular simulation in the low-temperature drying process [J]. Biomed. Eng., 2013, 30 (4): 854-859.

[5] RAJAN P, MEENA K, ABBUL B K. Recent advances in the applications of ionic liquids in protein stability and activity: a review [J]. Appl. Biochem. Biotechnol., 2014, 172 (8): 3701-3720.

[6] NAUSHAD M, ALOTHMAN Z A, KHAN A B,. Effect of ionic liquid on activity, stability, and structure of enzymes: a review [J]. Int. J. Biol. Macromol., 2012, 51 (4): 555-560.

[7] KAAR J L, JESIONOWSKI A M, BERBERICH J A,. Impact of ionic liquid physical properties on lipase activity and stability [J].J. Am. Chem. Soc., 2003, 125 (14): 4125-4131.

[8] HERNANDEZ-FERNANDEZ F J, DELOSRIOS A P, TOMAS-ALONSO F,. Stability of hydrolase enzymes in ionic liquids [J]. Canadian J. Chem. Eng., 2009, 87 (6): 910-914.

[9] YANG Z, YUE Y J, HUANG W C. Importance of the ionic nature of ionic liquids in affecting enzyme performance [J]. J. Biochem., 2009, 145 (3): 355-364.

[10] YASAR A, MATTHIAS J N J, DARIUSH H. Effect of ionic liquids on the solution structure of human serum albumin [J]. Biomacromolecules, 2011, 12 (4): 1072-1079.

[11] 婁文勇, 宗敏華.離子液體的組成及溶劑性質(zhì)與木瓜蛋白酶催化特性的關(guān)系 [J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2007, 28 (7): 1283-1287. LOU W Y, ZONG M H. Correlation between catalytic characteristics of papain and components and solvate properties of ionic liquids [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2007, 28 (7): 1283-1287.

[12] YAO P, YU X, HUANG X. Effect of the physicochemical properties of binary ionic liquids on lipase activity and stability [J]. Int. J. Biol. Macromol., 2015, 77: 243-249.

[13] KRUGER P, STRBBURGER W, WOLLMER A,. The simulated dynamic of the insulin monomer and their relationship to the molecule’s structure [J]. Eur. Biophys. J., 1987, 14: 449-459.

[14] 吳云劍, 崔穎璐, 鄭清川, 等. CYP2C9酶與Warfarin結(jié)合模型的立體選擇性理論研究 [J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 35 (12): 2605-2611. WU Y J, CUI Y L, ZHENG Q C,. Theoretical studies on the substrate binding mode and regioselectivity of human CYP2C9 with- and-warfarin [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2014, 35 (12): 2605-2611.

[15] NAGAMPALLI R S, KRISHNA, VASANTHA,. Metal induced conformational changes in human insulin: crystal structure of Sr2+, Ni2+and Cu2+complexes of human insulin [J].Protein Pept. Lett., 2011, 18 (5): 457-466.

[16] VAN DER S D, LINDAHL E. GROMACS: fast, flexible and free [J]. J. Comput. Chem., 2005, 26 (16): 1701-1718.

[17] VYTATUAS G, SERVAAS M, DANIEL S. Automated protein structure and topology generation for alchemical perturbations [J]. J. Comput. Chem., 2015, 36 (5): 348-354.

[18] ALEXEI M N, YURY V M, ALEXANDER P L. A new AMBER-compatible force field parameter set for alkanes [J]. J. Mol. Model., 2014, 20 (3): 1-10.

[19] PEIKUN Y. Incroporation of the TIP4P water model into a continuum solvate for computing salvation free energy [J]. Chem. Phys., 2014, 443: 93-106.

[20] WANG H, DOMMERT F, HOLM C. Optimizing working parameters of the smooth particle mesh Ewald algorithm in terms of accuracy and efficiency [J]. Chem. Phys., 2010, 133 (3): 034117-034128.

[21] ANIRBAN M, CHARUSITA C. Effect of the Berendsen thermostat on the dynamical properties of water [J]. Mol. Phys., 2004, 102 (7): 681-685.

[22] BUSSI G, ZYKOVA-TIMAN T, PARRINELLO M. Isothermal- isobaric molecular dynamics using stochastic velocity rescaling [J]. Chem. Phys., 2009, 130 (7): 074101-074109.

[23] RENTENIER A, MORETTO-CAPELLE P, BORDENAVE- MONTESQUIEU D,. Analysis of fragment size distributions in collision of monocharged ions with the C60 molecule [J]. J. Phys. B: At., Mol. Opt. Phys., 2005, 38 (7): 789-806.

[24] RATHORE B, SHAKYA M. Insilico 3D structure prediction of E-cadherin protein: a molecule responsible for suppressing melanoma metastasis [J]. J. Adv. Bioinformatics Applications Res., 2012, 3 (2): 310-316.

[25] 楊程, 盧滇楠, 張敏蓮, 等. 分子動(dòng)力學(xué)模擬二硫鍵對(duì)胰島素構(gòu)象穩(wěn)定性的影響 [J]. 化工學(xué)報(bào), 2010, 61 (4): 929-934. YANG C, LU D N, ZHANG M L,. Molecular dynamjcs simulation of impact of disulfide bridge on conlbrmational stability of insulin [J]. CIESC Journal, 2010, 61 (4): 929-934.

[26] 胡小玲, 郭小青, 管萍, 等. 在離子液體中蛋白質(zhì)溶解性及穩(wěn)定性的研究進(jìn)展 [J]. 功能材料, 2013, 44 (12): 1679-1685. HU X L, GUO X Q, GUAN P,. Research progress of dissolution and stability of protein in ionic liquids [J]. J. Functional Materials, 2013, 44 (12): 1679-1685.

[27] BAHAREH D, SARA D, ABBAS A S,. Effect of ionic liquids on the structure, stability and activity of two related α-amylases [J]. Int. J. Biol. Macromol., 2011, 48 (1): 93-97.

[28] PHIL C, CLAUS A F A, BURKHARD R,. DSSPcont: continuous secondary structure assignments for proteins [J]. Nucleic Acids Res., 2003, 31 (13): 3293-3295.

[29] YAN H, WU J Y, DAI G L,. Interaction mechanisms of ionic liquids [Cmim]Br (4, 6,8,10) with bovine serum albumin [J]. J. Luminescence, 2012, 132 (3): 622-628.

[30] MEI Q Q, HOU M Q, NING H,. Microstructure and intermolecular interactions of [Bmim][PF6]+water+alcohol systems: a molecular dynamics simulation study [J]. Acta Phys. -Chim. Sin., 2014, 30 (12): 2210-2215.

[31] LIU F F, DONG X Y, WANG T,. Rational design of peptide ligand for affinity chromatography of tissue-type plasminogen activator by the combination of docking and molecular dynamics simulations [J]. J. Chromatography A, 2007, 1175: 249-258.

[32] 白姝, 常穎, 劉小娟, 等. 海藻糖與氨基酸之間相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬 [J]. 物理化學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 30 (7): 1239-1246. BAI S, CHANG Y, LIU X J,. Interactions between trehalose and amino acids by molecular dynamics simulations [J]. Acta Phys. -Chim. Sin., 2014, 30 (7): 1239-1246.

Structural stability of insulin in imidazolium ionic liquids by molecular simulation

PAN Xiaoli1, LI Daixi1, WEI Dongqing2

(1Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;2State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Ionic liquids, as a kind of novel green solvents, have been widely applied to structural stability study of protein due to their unique physicochemical properties. In this study, insulin was chosen as a heat-sensitive protein medicine to research the structural stability of protein in various imidazolium ionic liquids from a molecular insight by using molecular dynamics simulation. The results indicate that the ionic liquids are able to stabilize the molecular structure of insulin effectively at room temperature compared with aqueous solution. The RMSD values and the secondary structure of insulin show that the weaker the hydrogen-bond basicity of anion is, the shorter the alkyl chain of cation is, the more stable the molecular structure of insulin is. In order to explain thoroughly the effect of alkyl chain length of ionic liquid on the stability of the protein, the interaction and the number of contact between the insulin and dicyanamide imidazolium ionic liquids with different alkyl chain length are further analyzed. It is found that the cation stabilize effectively the molecular structure of insulin which relies mainly on the electrostatic interaction between the insulin and the 1-methylimidazole of cation. Comparing to ionic liquids with long alkyl chain, the interaction between the insulin and ionic liquids is more powerful, and the insulin also adsorb more anion and 1-methylimidazole of cation in ionic liquids with short alkyl chain. All these results indicate that the ionic liquids with short chain alkyl indeed improve the molecular structural stability of insulin. Generally, the molecular dynamic simulation, as adopted to this research, provides a molecular insight to investigate the stability of insulin in ionic liquids, which is important and essential for molecular design of ionic liquids and stability study of heat-sensitive protein drugs.

ionic liquids; insulin; protein stability; interaction energy; molecular simulation

date: 2016-07-11.

Prof. LI Daixi,dxli75@126.com

10.11949/j.issn.0438-1157.20160968

O 6-39

A

0438—1157（2016）12—5215—07

上海市重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（T0503，P0502）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12ZR1420400）；上海市“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”國際科技合作項(xiàng)目（12430702000）；上海市聯(lián)盟計(jì)劃項(xiàng)目；上海理工大學(xué)人文社會(huì)科學(xué)基金項(xiàng)目（11XSY23）。

supported by the Shanghai Leading Academic Discipline Project (T0503, P0502), the Natural Science Foundation of Shanghai (12ZR1420400), the “Innovation Action Plan” International Science and Technology Cooperation Project of Shanghai (12430702000), Shanghai Alliance Program and the Humanities and Social Science Fund Project of University of Shanghai for Science and Technology (11XSY23).

2016-07-11收到初稿，2016-08-22收到修改稿。

聯(lián)系人：李代禧。第一作者：潘曉莉（1991—），女，碩士研究生。