劉丹丹，孫曉帥，王志洪，喬 琴，何飛飛*

(1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南昆明 650091；2.云南三標(biāo)農(nóng)林科技有限公司，云南昆明 650302)

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云南小粒速溶咖啡中百菌清提取凈化方法研究

劉丹丹1，孫曉帥1，王志洪2，喬 琴1，何飛飛1*

(1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南昆明 650091；2.云南三標(biāo)農(nóng)林科技有限公司，云南昆明 650302)

[目的]探討云南小粒速溶咖啡中百菌清的最佳提取凈化方法。[方法]分別采用石油醚-丙酮萃取法、固相吸附法及二氯甲烷-丙酮萃取法這3種不同的方法提取凈化云南小粒速溶咖啡中的百菌清，并利用高效液相色譜進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定，根據(jù)回收率的大小和凈化方式的繁簡(jiǎn)，確定最適宜的百菌清測(cè)定方法。[結(jié)果]3種不同方法提取凈化百菌清的加標(biāo)回收率分別為85.3%、111.4%和118.7%。[結(jié)論]通過(guò)回收率及凈化方式的比較可知，可利用固相吸附法對(duì)云南小粒速溶咖啡中的百菌清進(jìn)行提取純化。

速溶咖啡；百菌清；提取凈化；方法優(yōu)化

云南咖啡屬阿拉伯原種的變異種，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的栽培馴化，現(xiàn)被稱(chēng)為“云南小粒種咖啡”。由于云南光照時(shí)間長(zhǎng)，晝夜溫差大，有利于咖啡養(yǎng)分的積累，因此，云南小?？Х鹊臓I(yíng)養(yǎng)成分高于國(guó)內(nèi)外其他咖啡品種，形成了自己的特色。隨著云南咖啡產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，速溶咖啡占據(jù)了很大市場(chǎng)。在咖啡的生產(chǎn)栽培過(guò)程中會(huì)使用大量的殺菌劑及殺蟲(chóng)劑，在咖啡豆的加工中也會(huì)出現(xiàn)污染。速溶咖啡屬于直接飲用的食品，農(nóng)藥殘留等成了安全問(wèn)題中的最大隱患。

農(nóng)藥殘留主要是由直接施藥引起的，也可以是吸收環(huán)境中的農(nóng)藥或通過(guò)食物鏈富集造成。農(nóng)藥的理化性質(zhì)、作物類(lèi)型、施藥方法、環(huán)境因子都是影響殘留的因素。在同一區(qū)域內(nèi)施用多種農(nóng)藥，存在農(nóng)藥的同系物、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物的影響[1]，農(nóng)作物通過(guò)根莖吸收、傳導(dǎo)等途徑，使農(nóng)藥進(jìn)入其組織內(nèi)部，從而加大了檢測(cè)的難度。因此，發(fā)展各種新的分析方法，特別是多種類(lèi)農(nóng)藥殘留量的同時(shí)分析方法具有重要的意義。目前，對(duì)于咖啡的農(nóng)藥殘留檢測(cè)均局限于對(duì)咖啡豆的檢測(cè)[2]，鮮有關(guān)于對(duì)速溶咖啡檢測(cè)的報(bào)道。農(nóng)業(yè)部NY/T 289—1995在標(biāo)準(zhǔn)中只是規(guī)定了六六六、滴滴涕2種農(nóng)藥的殘留量及測(cè)定方法[3]。

百菌清是非內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，該農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法在黃瓜、茶葉及咖啡豆中均有報(bào)道[3-4]，檢測(cè)方法多為氣相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等[5-6]。其中，質(zhì)譜聯(lián)用方法靈敏度高，但是價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本較高。因此，建立快速、高效、易推廣的檢測(cè)方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。筆者通過(guò)加標(biāo)回收使用3種不同的方法對(duì)速溶咖啡中的百菌清進(jìn)行提純凈化，通過(guò)比較探討該農(nóng)藥最適宜的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料 原料：云南產(chǎn)小粒速溶咖啡。主要儀器：高效液相色譜儀(Waters，e2695-2489)，超聲波振蕩儀器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。主要試劑：百菌清標(biāo)準(zhǔn)品(99.5%)，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、檸檬酸氫二鈉、乙腈、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，均為色譜純，購(gòu)自阿拉丁試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。在50 mL容量瓶中，精密稱(chēng)取百菌清標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加入40 mL二氯甲烷，放入超聲浴中溶解15 min，冷卻至室溫，用二氯甲烷稀釋至刻度，混勻，貯于冰箱中。

1.2.2 色譜條件。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；色譜柱：Gemini 5 μm，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：甲醇-水(75%∶25%)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3 樣品前處理及測(cè)定。該試驗(yàn)采用濃度為1.0 mg/L百菌清對(duì)云南小粒速溶咖啡進(jìn)行處理，采用3種不同的方法提取凈化百菌清，并進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定。

1.2.3.1 石油醚-丙酮萃取法(處理①)。稱(chēng)取1 g速溶咖啡，用37 μm(相當(dāng)于400目)篩選，置于100 mL 具塞三角瓶中。加入石油醚-丙酮(4∶1)混合溶劑30 mL，超聲提取15 min，過(guò)濾后取濾液凈化。吸取試樣提取液2 mL，注入已淋洗過(guò)的層析柱中，用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)混合溶劑100 mL 洗脫。收集洗脫液于蒸餾瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮近干，用少量石油醚多次溶解殘?jiān)诳潭入x心管中，定容至1.0 mL，在色譜條件下進(jìn)行分析。

1.2.3.2 固相吸附法(處理②)。稱(chēng)取1 g速溶咖啡于50 mL具蓋離心管中，精確至0.1 mg，加入10 mL水，振蕩，直至樣品被水充分浸潤(rùn)，靜止10 min。移取10 mL乙腈和1 mL混合內(nèi)標(biāo)工作液到離心管中，于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min 速度振蕩1 min，分別加入4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉和5 mL甲苯，立即于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min 速度振蕩2 min，以防止無(wú)水硫酸鎂遇水反應(yīng)造成局部過(guò)熱并結(jié)塊，然后以4 000 r/min 離心10 min。移取5 mL樣品提取液上層清液于10 mL離心管中，加入500 mg無(wú)水硫酸鎂和150 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min 速度振蕩2 min，以6 000 r/min 離心2 min，上機(jī)測(cè)定。

1.2.3.3 二氯甲烷-丙酮萃取法(處理③)。稱(chēng)取1 g速溶咖啡，用37 μm(相當(dāng)于400目)篩選，置于100 mL 具塞三角瓶中。加入30 mL二氯甲烷與丙酮混合液(9∶1)，在超聲浴中提取15 min。提取液過(guò)裝有無(wú)水硫酸鈉的漏斗，用20 mL二氯甲烷洗滌比色管3次，用100 mL蒸餾瓶收集濾液。30 ℃水浴在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)至近5 mL，過(guò)弗羅里硅土預(yù)柱，用20 mL二氯甲烷分3次洗蒸餾瓶。再用60 mL二氯甲烷分4次洗滌預(yù)柱，收集全部預(yù)柱流出液于200 mL蒸發(fā)皿中。置于通風(fēng)櫥內(nèi)，水浴30 ℃揮發(fā)至近干，用二氯甲烷移于5 mL比色管內(nèi)，定容，過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜，儀器自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.4 結(jié)果計(jì)算。試樣中百菌清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按下式計(jì)算：

W=(A1/A2)×m1/m2×V1/V2

式中，W為試樣中百菌清的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/kg)；A1為被測(cè)定試樣各組分的峰值(峰高或面積)；A2為百菌清標(biāo)準(zhǔn)的峰值；m1為百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量(ng)；m2為被測(cè)定試樣的取樣量(g)；V1為被測(cè)定試樣的稀釋體積(mL)；V2為被測(cè)定試樣的進(jìn)樣體積(μL)。

2 結(jié)果與分析

百菌清經(jīng)3種不同的方法提取、凈化后用高效液相色譜法測(cè)定，通過(guò)對(duì)回收率的測(cè)定進(jìn)行比較，選出百菌清高效液相色譜法測(cè)定最適宜的方法。

百菌清標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為3.749 min，如圖1所示。用1.0 mg/L百菌清處理速溶咖啡后，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定其含量，如圖2所示，處理①所測(cè)誤差較大，處理②、③結(jié)果準(zhǔn)確。根據(jù)回收率的計(jì)算，處理①、②、③的平均回收率分別為85.3%、111.4%、118.7%。

3種提取純化的方法操作復(fù)雜，均需經(jīng)多次純化才能得到合格凈化液，耗時(shí)長(zhǎng)。其中，處理①為普遍采用的測(cè)定方法，但是回收率較低；處理②與處理③的測(cè)定方法準(zhǔn)確，精密度較高。因此，后2種均可作為測(cè)定百草清的方法，比傳統(tǒng)檢測(cè)法更能滿(mǎn)足目前的要求。但是，值得注意的是處理③比處理②更為繁瑣，操作過(guò)程中誤差較大，因此，建立使用固相吸附法對(duì)速溶咖啡中百菌清的提取純化進(jìn)行萃取。

圖1 百菌清標(biāo)準(zhǔn)品的色譜Fig.1 Chromatography of chlorothalonil standards

圖2 不同處理方法測(cè)定速溶咖啡粉中百菌清的含量Fig.2 Chlorothalonil content in instant coffee powder determined by different processing methods

3 結(jié)論與討論

據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)咖啡消費(fèi)者的數(shù)量越來(lái)越大，安全問(wèn)題逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)?？Х戎械霓r(nóng)業(yè)殘留主要是在種植過(guò)程中使用或從環(huán)境中攝入的，常用的殺蟲(chóng)及殺菌劑有六六六、滴滴涕、樂(lè)果、百菌清、多菌靈、甲基托布津等[3]。這些農(nóng)藥的種類(lèi)繁多，性質(zhì)各異，在食品中的殘留量極低，傳統(tǒng)的分析方法難以保證其檢測(cè)精度。目前，測(cè)定農(nóng)藥殘留主要采用離子-氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法[7]，但是測(cè)定費(fèi)用較高并且針對(duì)性較差。隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，開(kāi)發(fā)高效準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，以及制定嚴(yán)格的農(nóng)藥限量標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。該研究采用3種不同的方法萃取凈化速溶咖啡中百菌清，并通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)其加標(biāo)回收率進(jìn)行了測(cè)定，研究了這幾種方法對(duì)樣品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的穩(wěn)定性和適用性，最終確定采用固相吸附法提取純化速溶咖啡中的百菌清效果最好。

[1] 裴志國(guó).吡蟲(chóng)啉在小麥大田中的殘留規(guī)律及底物固相分散法在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用[D].天津：南開(kāi)大學(xué)，2003.

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Stndy on Extraction and Purification Method of Chlorothalonil in Yunnan Small Grain Instant Coffee

LIU Dan-dan1, SUN Xiao-shuai1, WANG Zhi-hong2, HE Fei-fei1*et al

(1. School of Agriculture, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650091; 2. Yunnan Three Standard of Agriculture and Forestry Science and Technology Co. Ltd., Kunming, Yunnan 650302)

[Objective] The aim was to explore the optimal extraction and purijication method for chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee. [Method] Three different extraction and purification methods (aether petrolei-acetone extraction, solid-phase adsorption and dichloromethane-acetone extraction) were performed to extract chlorothalonil in instant coffee. Then all of the extractions were tested using high performance liquid chromatography(HPLC). The most suitable method was determined according to the percentages of recovery measurement. [Result] The results obtained by three different extraction and purification methods showed that the recovery percentages were 85.3%, 111.4% and 118.7%, respectively. [Conclusions] By comparing recovery rate and purification methods, solid-phase adsorption method was the best one for testing chlorothalonil in Yunnan small grain instant coffee.

Instant coffee; Chlorothalonil; Extraction and purification; Method optimization

云南省建立農(nóng)科教相結(jié)合新型農(nóng)業(yè)社會(huì)化服務(wù)體系試點(diǎn)云咖啡產(chǎn)品單元子項(xiàng)目“咖啡產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和檢測(cè)平臺(tái)”(2014NG004)。

劉丹丹(1985- )，女，山東兗州人，講師，博士，從事園藝作物農(nóng)藥殘留檢測(cè)研究。*通訊作者，副教授，博士，從事咖啡質(zhì)量檢測(cè)研究。

2016-09-12

S 571.2

A

0517-6611(2016)32-0092-02