劉 洋，柳 青，李 楠，劉相國，張 航，趙方方，賈 偉，韓四平，尹悅佳**

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院; 2.吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室; 3.哈爾濱師范大學(xué);4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

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轉(zhuǎn)cry1Ab/Gc基因玉米的不同轉(zhuǎn)化事件Bt蛋白表達(dá)和抗蟲性分析*

劉 洋1,2，柳 青1,2，李 楠1,2，劉相國1,2，張 航3，趙方方3，賈 偉4，韓四平1,2，尹悅佳1,2**

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院; 2.吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室; 3.哈爾濱師范大學(xué);4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))

分析不同轉(zhuǎn)化體Bt蛋白表達(dá)量和評估其抗蟲性，進(jìn)而篩選優(yōu)異轉(zhuǎn)化事件是轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育研究中的重要環(huán)節(jié).為分析轉(zhuǎn)cry1Ab/Gc基因玉米中Bt蛋白表達(dá)特性與抗蟲性的關(guān)系，篩選優(yōu)秀轉(zhuǎn)化事件，研究以三個轉(zhuǎn)化事件HG-1、 HG-2、HG-3為試驗材料，利用ELISA檢測、玉米螟生測等技術(shù)，在室內(nèi)和田間詳細(xì)分析心葉期和抽絲期玉米抗蟲蛋白表達(dá)量，并評估抗蟲性.研究結(jié)果表明，同一轉(zhuǎn)化事件不同組織或器官Cry1Ab/Gc蛋白含量存在顯著差異，均表現(xiàn)為葉>莖>根；不同時期葉片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在顯著差異，表現(xiàn)為抽絲期>心葉期；不同轉(zhuǎn)化事件間，心葉期轉(zhuǎn)化事件HG-1的葉片、抽絲期轉(zhuǎn)化事件HG-1和HG-2的莖中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明顯高于其他材料.室內(nèi)和田間亞洲玉米螟生測試驗結(jié)果表明：不同轉(zhuǎn)化事件抗蟲性差異顯著，轉(zhuǎn)化事件HG-1在心葉期和抽絲期亞洲玉米螟抗性顯著高于其他兩個玉米轉(zhuǎn)化事件，與該時期Cry1Ab/Gc蛋白高表達(dá)的試驗結(jié)果一致.本研究結(jié)果證實不同玉米轉(zhuǎn)化事件Bt蛋白表達(dá)量顯著差異，心葉期和抽絲期Bt蛋白表達(dá)量與亞洲玉米螟抗性呈正相關(guān)，可以作為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米優(yōu)秀轉(zhuǎn)化體初步篩選的重要技術(shù)指標(biāo)，具有可操作性強、技術(shù)穩(wěn)定性好、節(jié)省時間等優(yōu)勢，為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考.

Cry1Ab/Gc蛋白；轉(zhuǎn)化事件；抗蟲性

0 引言

亞洲玉米螟是我國玉米的重要害蟲，一般發(fā)生年份可使玉米減產(chǎn)10%左右，大發(fā)生年份可造成玉米產(chǎn)量損失30%以上，嚴(yán)重時甚至絕收[1].轉(zhuǎn)Bt基因玉米是通過生物技術(shù)將外源抗蟲基因插入到玉米基因組中，使其成為具備抗蟲性狀的玉米品系，為控制玉米螟危害提供了新的途徑[2].目前，已有26個國家批準(zhǔn)40余種轉(zhuǎn)Bt基因玉米事件開展商業(yè)化種植或飼料食品加工[3]，其中包括孟山都公司和先正達(dá)公司分別推出的MON810 與 Bt11、Bt176 抗蟲玉米雜交種[4].

進(jìn)入商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因材料初期通常產(chǎn)生成百至上千個不同事件，并不斷篩選事件中具有商業(yè)用途所需的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的單個事件.岳同卿[5]等從12個轉(zhuǎn)cry1Ah基因玉米事件植株中，篩選出高抗轉(zhuǎn)基因事件2個，分別為B1-1 和 B1-7.孫越等[6]從以玉米自交系9801為背景的42個轉(zhuǎn)化事件，篩選出高抗草甘膦、高抗玉米螟轉(zhuǎn)化事件3個，從以玉米自交系齊319為背景的12個轉(zhuǎn)化事件中篩選出高抗草甘膦、高抗玉米螟轉(zhuǎn)化事件3個，并發(fā)現(xiàn)抗蟲基因cry1AcM表達(dá)量的高低與玉米抗蟲性強弱成正比.

一般來說，表達(dá)量越高，抗蟲效果就越好.早期的轉(zhuǎn)抗蟲基因植物的殺蟲蛋白在植株上的表達(dá)量很低(占全部可溶性蛋白的 0.001%以下)，抗蟲效果不理想[7].從已有的研究結(jié)果來看，通過對cry基因的修飾、改造和密碼子優(yōu)化，不但可以有效解決昆蟲產(chǎn)生抗性問題[8]，同時轉(zhuǎn)基因植物中Bt蛋白表達(dá)量也逐步提高，獲得了多種有應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因植物.Bohorova等[9]將融合基因crylB-crylAb轉(zhuǎn)入玉米中來防治多種農(nóng)業(yè)害蟲.國內(nèi)很多通過密碼子優(yōu)化，改造合成新的基因，獲得高表達(dá)抗蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，有效提高了轉(zhuǎn)基因玉米的殺蟲活性[10-12].但對于在不同生育期玉米不同組織部位殺蟲蛋白表達(dá)量和抗蟲效果的詳細(xì)解析還未見報道.

該實驗室前期通過結(jié)構(gòu)域交換等合理化分子改造方法獲得新型抗蟲基因cry1Ab/Gc，將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體pTF101-ubi中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得216個轉(zhuǎn)化事件.經(jīng)過高壓力蟲試初步篩選，獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)異的玉米轉(zhuǎn)化事件3個，分別為HG-1、 HG-2、 HG-3.本研究通過對三個轉(zhuǎn)化事件T4代材料心葉期和抽絲期抗蟲蛋白表達(dá)量測定和抗蟲性分析，解析在玉米不同生育期兩者關(guān)系，篩選出高抗玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件，為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料 轉(zhuǎn)cry1Ab/Gc基因玉米轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2、HG-3，是將抗蟲基因cry1Ab/Gc構(gòu)建到適用于單子葉植物高效表達(dá)的植物表達(dá)載體pTF101-ubi中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化，并對216個轉(zhuǎn)基因玉米事件的T2、T3代抗蟲篩選后獲得的三個性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)化事件，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所創(chuàng)制；pTF101-ubi-cry1Ab/Gc質(zhì)粒為用于轉(zhuǎn)化到玉米中的含cry1Ab/Gc的植物表達(dá)載體質(zhì)粒，抗蟲基因cry1Ab/Gc由玉米泛素化啟動子ubi啟動，nos終止子終止.試驗中所需亞洲玉米螟蟲由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供.

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR

選取HG-1、HG-2、HG-3玉米T4代植株各三株，用CTAB法(參照 GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法》中的 CTAB-1 法)分別提取的葉片DNA，濃度稀釋為1μg/μL作為模板.pTF101.1-ubi-cry1Ab/Gc質(zhì)粒為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因玉米HiII為陰性對照，水為空白對照.根據(jù)載體上目的基因cry1Ab/Gc序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，引物序列如下：cry1Ab/Gc R: CGCCTTATTGGCAACTAC; cry1Ab/Gc F: CCTGCTACTACTGGACGAAA.使用2×EasyTaq PCR SuperMix進(jìn)行PCR反應(yīng).反應(yīng)條件為：95℃，5 min；95℃，30 sec、58℃，45sec、72℃，90 sec，共30 cycles；72℃ 10 min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測

1.2.2 ELISA

分別在心葉期、抽絲期選取三個轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2、 HG-3和非轉(zhuǎn)基因玉米HiII植株各三株，3次重復(fù)，剪取根、莖和葉片，按照Bt-Cry1Ab/1Ac ELISA Kit 試劑盒方法，測定在心葉期和抽絲期的根、莖、葉中cry1Ab/Gc基因的蛋白表達(dá)量，使用 Bio-Rad 酶標(biāo)儀測定其 OD655 值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蛋白的濃度和其 OD655值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品中 Bt 蛋白濃度.計算公式為：蛋白含量鮮重測試樣品濃度(μg/g)=測試樣品濃度(ng/ml)×稀釋倍數(shù)×抽提液(mL)/組織鮮重(g)×1000(ng/μg)

1.2.3 心葉期抗蟲性

在心葉期，將已經(jīng)黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于轉(zhuǎn)基因玉米HG-1、 HG-2、 HG-3、非轉(zhuǎn)基因玉米HiII心葉中.每種材料接蟲96株，每株接 2-3個中等大小的卵塊，于接蟲14天-21天后，調(diào)查食葉級別.參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1248.5-2006)分級標(biāo)準(zhǔn)，評價各轉(zhuǎn)化事件抗蟲性.

表1 玉米螟對心葉為害程度的分級標(biāo)準(zhǔn)

表2 玉米抗玉米螟的抗性評價標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 抽絲期抗蟲性

抽絲期將已經(jīng)黑頭的、即將孵化的玉米螟卵塊接于HG-1、 HG-2、 HG-3、非轉(zhuǎn)基因玉米HiII.每株接2～3個中等大小的卵塊，接蟲14～21 d后調(diào)查植株被取食情況.參照國標(biāo)(農(nóng)業(yè)部953公告-10.1-2007)分級標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查玉米蛀孔數(shù)量、蛀孔隧道長度以及存活幼蟲數(shù)量，采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Tukey法和Duncan法進(jìn)行材料間指標(biāo)的多重比較.

抽絲期取轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米新鮮花絲在實驗室測定抗蟲能力.稱取玉米花絲1g，放置于鋪有潤濕的三層濾紙的培養(yǎng)皿中，將初孵玉米螟5只接于花絲上，注意保持濕度和溫度，觀察5天玉米螟取食花絲情況.

2 結(jié)果

2.1 PCR

為鑒定抗蟲基因cry1Ab/Gc已整合到三個轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2、HG-3中，對三個轉(zhuǎn)化事件玉米進(jìn)行PCR鑒定.以pTF101-ubi-cry1Ab/Gc質(zhì)粒為陽性對照，水為陰性對照.根據(jù)孟德爾遺傳分離規(guī)律，自交授粉后代表現(xiàn)3:1分離規(guī)律，隨著自交代數(shù)的增加，獲得純合體的概率越來越高，本研究選取的是T4代轉(zhuǎn)基因材料，純合度達(dá)93%以上.因此隨機選擇3株進(jìn)行檢測，由圖可以看出，質(zhì)粒和三個轉(zhuǎn)化事件玉米植株擴增出981bp條帶，陰性對照和空白對照未擴增出目的條帶，可見抗蟲基因cry1Ab/Gc在三個轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2、HG-3中穩(wěn)定遺傳.

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米PCR鑒定 M：DL2000 marker; 1：質(zhì)粒(陽性對照)；2：HiII(陰性對照)；3: 水(空白對照)；4-6：轉(zhuǎn)基因玉米HG-1；8-10：轉(zhuǎn)基因玉米HG-2；12-14：轉(zhuǎn)基因玉米HG-3

2.2 ELISA

對心葉期和抽絲期三個轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行ELISA檢測，分析不同轉(zhuǎn)化事件不同組織抗蟲蛋白Cry1Ab/Gc表達(dá)量.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品中Cry1Ab/Gc蛋白占總蛋白的鮮重.

表3 不同時期不同轉(zhuǎn)化事件不同部位Cry1Ab/Gc蛋白鮮重

結(jié)果表明：在同一時期，不同轉(zhuǎn)化事件中Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量的一致趨勢為，葉片中含量最高，莖次之，根中最低.在心葉期，轉(zhuǎn)化事件HG-1不同部位Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量均高于HG-2和HG-3；在抽絲期，轉(zhuǎn)化事件HG-1的根、葉Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)化事件HG-2和HG-3，但轉(zhuǎn)化事件HG-2的莖中Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量高于轉(zhuǎn)化事件HG-1和HG-3.

隨著轉(zhuǎn)基因玉米的生長，不同時期同一轉(zhuǎn)化事件同一部位的Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量有所變化.轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2、HG-2的葉和根、HG-2的莖中Cry1Ab/Gc含量升高.

2.3 心葉期抗蟲性

為分析三個轉(zhuǎn)化事件在Cry1Ab/Gc表達(dá)量不同的情況下的抗蟲性情況.在心葉期對非轉(zhuǎn)基因玉米和三個轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行田間玉米螟抗蟲性試驗.接初孵幼蟲14 d后，非轉(zhuǎn)基因玉米葉片出現(xiàn)大量排孔、被玉米螟蟲啃食嚴(yán)重；轉(zhuǎn)化事件HG-1葉片較少排孔，未受影響；轉(zhuǎn)化事件HG-2、 HG-3葉片出現(xiàn)一定的排孔，部分被玉米螟蟲啃食.記錄各材料玉米螟危害程度級別，計算玉米螟對各鑒定材料群體葉片食葉級別的平均數(shù).

參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1248.5-2006)分級標(biāo)準(zhǔn)，HG-1蟲害級別為1級，抗性為高抗(HR)，HG-2和HG-3蟲害級別為3，抗性為抗(R)，HiII蟲害級別為9，抗性為感(S).綜上，田間心葉期抗蟲性高低依次為HG-1> HG-2>HG-3.

表4 心葉期轉(zhuǎn)cry1Ab/Gc基因玉米抗蟲性評價

圖2 心葉期轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲性鑒定 A：HiII； B：HG-1；C：HG-2；D: HG-3

2.4 抽絲期抗蟲性

為進(jìn)一步評價三個轉(zhuǎn)化事件抗蟲性，在抽絲期接蟲后統(tǒng)計植株被害情況.參照國標(biāo)(農(nóng)業(yè)部953公告-10.1-2007)分級標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查玉米蛀孔數(shù)量、蛀孔隧道長度以及存活幼蟲數(shù)量(表5)，結(jié)果表明:抽絲期轉(zhuǎn)基因玉米HG-1、HG-2抗蟲性高于HG-3，且明顯高于對照HiII，抗性級別依次為高抗、高抗、抗、感.

表5 抽絲 期轉(zhuǎn)cry1Ab/Gc基因玉米抗蟲性評價

表中不同小寫字母間5%水平上差異顯著，表中數(shù)值為Mean±SE.

同時，在轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米抽絲期選擇新鮮花絲在實驗室測定抗蟲能力，如圖3所示.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組玉米螟前三天生長良好，第4、5天出現(xiàn)死亡，花絲已全部吃光，只剩深褐色的糞便和廢屑；轉(zhuǎn)基因玉米HG-1、HG-2抗性良好.它們的花絲被取食非常少，接蟲3天以后玉米螟死亡率在80%以上，5天以后大部分轉(zhuǎn)化系上玉米螟死亡率到達(dá)100%.HG-3被部分取食.因此，轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2室內(nèi)花絲抗蟲性級別較高.

圖3 室內(nèi)抗蟲性測定A：空白對照；B：HiII；C：HG-1；D：HG-2；E：HG-3

3 討論

培育轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米是解決玉米蟲害的有效方法.從已有的研究結(jié)果來看，通過對cry基因的修飾與改造，轉(zhuǎn)Bt基因的作物可以獲得較好的抗蟲效果[13-14].該實驗室在前期通過合理化定向分子改造出新型抗蟲基因cry1Ab/Gc，通過遺傳轉(zhuǎn)化到玉米中獲得216 個轉(zhuǎn)化事件.經(jīng)過高壓力抗蟲性初步篩選，獲得目標(biāo)性狀優(yōu)異的玉米轉(zhuǎn)化體3個，分別為HG-1、HG-2、 HG-3.

為分析不同轉(zhuǎn)化體Bt蛋白表達(dá)量和評估抗蟲性.首先對轉(zhuǎn)化事件HG-1、HG-2、HG-3的T4代的玉米進(jìn)行PCR鑒定，確定陽性植株.采用ELISA方法分別對三個轉(zhuǎn)化事件陽性轉(zhuǎn)基因玉米心葉期和抽絲期的根、莖、葉中Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量進(jìn)行了測定，研究表明(1)在同一時期，不同轉(zhuǎn)化事件中Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量的一致趨勢為，葉片中含量最高，莖次之，根中最低；這種現(xiàn)象與李蔥蔥等[15]對先正達(dá)公司轉(zhuǎn)cry1Ab玉米中Cry1Ab蛋白、楊麗麗[16]對抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米Bt799中mCry1A蛋白在各組織部位表達(dá)量趨勢一致；(2)不同時期葉片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在顯著差異，表現(xiàn)為抽絲期>心葉期，與劉金洋等[17]對抗蟲玉米的Bt蛋白表達(dá)特征分析趨勢一致；(3)不同轉(zhuǎn)化體間，心葉期轉(zhuǎn)化事件HG-1的葉片、抽絲期轉(zhuǎn)化事件HG-1和HG-2的莖中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明顯高于其他材料.以上趨勢可能由于外源基因cry1Ab/Gc插入玉米中不同的位點、目的基因拷貝數(shù)等因素不同所致；也可能當(dāng)外源基因整合到生長發(fā)育相關(guān)的基因附近，生長發(fā)育基因的調(diào)控序列也會影響外源基因的表達(dá).外界環(huán)境因子、植株不同組織中碳水化合物和總蛋白含量不同等因素也能引起外源基因表達(dá)量的差異，其機理有待深入研究.

玉米螟初孵幼蟲取食偏好嫩葉、抽穗后的秸稈，破壞植物組織，阻礙玉米養(yǎng)分的輸送，進(jìn)而造成減產(chǎn)，因此心葉期和抽絲期是玉米螟危害的主要時期.本研究參照國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)分級標(biāo)準(zhǔn)，對心葉期、抽絲期三個轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行抗蟲性評價.在心葉期，轉(zhuǎn)化事件HG-1抗蟲性級別為高抗，轉(zhuǎn)化事件HG-2和HG-3抗蟲性級別為抗；抽絲期的田間和室內(nèi)抗蟲性試驗結(jié)果表明抽絲期 HG-1和HG-2抗蟲性級別為高抗，HG-3抗性級別為抗.這與心葉期轉(zhuǎn)化事件HG-1葉中、抽絲期轉(zhuǎn)化事件HG-1葉中、HG-2葉和莖中Cry1Ab/Gc蛋白表達(dá)量相對較高的趨勢一致.說明轉(zhuǎn)基因玉米對亞洲玉米螟的毒性強弱與其所表達(dá)的毒蛋白含量高低相吻合[6].根據(jù)殺蟲晶體蛋白的作用機制，Bt蛋白被昆蟲攝入并活化后，與昆蟲中腸上皮細(xì)胞的受體結(jié)合，造成離子通道或形成孔洞，引起滲透壓失衡，最終導(dǎo)致昆蟲死亡[18].轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲性是殺蟲蛋白與特異性受體結(jié)合的過程.ELISA技術(shù)的基礎(chǔ)就在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，具有高效、靈敏、特異、穩(wěn)定、可靠等特點.Wang等[19]已利用此技術(shù)篩選出高抗二化螟蟲的轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19b.本研究通過ELISA方法測定心葉期和抽絲期不同轉(zhuǎn)化體的根、莖、葉中抗蟲蛋白Cry1Ab/Gc表達(dá)量，并對轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲性進(jìn)行評價，明確了心葉期和抽絲期Bt蛋白表達(dá)量與亞洲玉米螟抗性呈正相關(guān)，選育出高表達(dá)抗蟲蛋白高抗亞洲玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米HG-1.因此對轉(zhuǎn)基因作物中外源基因的表達(dá)水平進(jìn)行個案分析，可作為優(yōu)秀抗蟲轉(zhuǎn)化體初步篩選和評估的重要技術(shù)指標(biāo)，為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考.

[1] 王振營, 魯新, 何康來, 等. 中國亞洲玉米螟的研究歷史、現(xiàn)狀和展望[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000, 31(5): 402 -412.

[2] Hilbeck A, Baumgartner M, Fried PM, et al. Effects of transgenic Bacillus thuringiensis corn-fed prey on mortality and development time of immature Chrysoperla carnea (Neuroptera: Chrysopidae) [J].EnvironmentalEntomology, 1998, 27: 480-487.

[3] 呂霞, 王慧, 曾興, 等. 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米研究及應(yīng)用[J]. 作物雜志, 2013, 2:7-12.

[4] 劉桂玲, 陳舉林, 李平海. 轉(zhuǎn)基因玉米的研究進(jìn)展與展望[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué), 2004, 20 (4): 36-38

[5] 岳同卿, 郎志宏, 王延鋒, 等. 轉(zhuǎn)Bt cry1Ah 基因抗蟲玉米的獲得及其遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2010, 18(4):638-644.

[6] 孫越, 劉秀霞, 李麗莉, 等. 兼抗蟲除草劑干旱轉(zhuǎn)基因玉米的獲得和鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015,48(2):215-228.

[7] 喬光明. 抗蟲基因Bt的研究進(jìn)展[J]. 西南科技大學(xué)學(xué)報, 2005,20(2): 75-78.

[8] 李晨, 劉博林. 轉(zhuǎn) Bt 基因抗蟲作物培育現(xiàn)狀及 Bt 蛋白的改造和聚合策略的利用[J]. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(1): 53-64.

[9] Bohorova N, Frutos R, Royer M, et al. Novel synthetic Bacillus thuringiensis CryIB gene and the CrylB-CrylAb translational fusion confer resistance to southwestern corn borer,sugarcane borer and fall armyworm in transgenic tropical maize[J].TheoreticalandAppliedGenetics, 2001, 103: 817-826.

[10] 賴錦盛, 董永彬, 宋偉彬, 等. 人工合成用于轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的 Bt殺蟲基因. 中國, 200910082840.6[P].2009-11-18.

[11] 李圣彥, 郎志宏, 朱莉, 等. 利用密碼子優(yōu)化提高Bt cry1Ah基因在轉(zhuǎn)基因玉米(Zea maysL.)中的表達(dá)[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2012, l3(6): 20-26.

[12] 李新海, 鐵雙貴, 岳潤清, 等. 編碼殺蟲蛋白基因cry1Ab-Ma其表達(dá)載體及應(yīng)用[P]. 中國,CN102094030A,2011-06-15.

[13] Walters FS, de Fontes CM, Hart H, et al. Lepidopteran-active variable-region sequence imparts coleopteran activity in eCry3.1Ab，an engineeredBacillusthuringiensishybrid insecticidal protein[J]. Appl Environ Microbiol，2010，76 (10) : 3082-3088.

[14] Naimov S, Dukiandjiev S, de Maagd RA. A hybridBacillusthuringiensisdelta-endotoxin gives resistance against a coleopteran and a lepidopteran pest in transgenic potato[J]. Plant Biotechnol J，2003, 1 (1) : 51-57.

[15] 李蔥蔥, 劉娜, 康嶺生, 等. 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量的研究[J]. 玉米科學(xué), 2006, 14(3): 40-41.

[16] 楊麗麗, 董姍姍, 劉燕, 等.mCry1Ac基因在抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米 Bt799 中的表達(dá)特征[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報, 2014, 30(5): 670-673.

[17]劉金洋, 姜海洋, 趙陽, 等. 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米轉(zhuǎn)育株Bt蛋白的表達(dá)特征分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 41(5):725-730.

[18] Schnepf E, Crickmore N, VanRie J, et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal Proteins[J],JMicrobiolMolBiolRev, 1998, 62: 775-806.

[19] Wang YN, Ke KQ, Li YH, et al. Comparison of three transgenic Bt rice lines for insecticidal protein expression and resistance against a target pest, Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae).InsectScience, 2016, 23, 78-87.

(責(zé)任編輯：季春陽)

Analysis of Bt Protein Expression and Insect Resistance in Different Transgeniccry1Ab/GcMaize

Liu Yang1,2, Liu Qing1,2,Li Nan1,2;Liu Xiangguo1,2;Zhang Hang3, Zhao Fangfang3, Jia Wei4, Han Siping1,2,Yin Yuejia1,2

(1.Jilin Academy of Agricultural Sciences; 2. Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Jilin Province; 3. Harbin Normal University; 4. Jilin Agricultural University)

It’s an important key to analysis of Bt protein expression and insect resistance in different transgenic maize for new variety breeding. To analysis of relationship between Bt protein expression and the insect resistance of transgeniccry1Ab/Gcmaize, three transformants, HG-1, HG-2, HG-3 as experimental materials are selected, and the expression of different transformants in different tissues at different periods are detected by using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, the insect resistance of transgenic maize at whorl stage and silking stage are evaluated. The results show that the order ofCry1Ab/Gcprotein expression in different tissues at the same period was leaf > stem > root with significant differences andCry1Ab/Gcprotein expression in transgenic leaf at different periods is silking stage > whorl stage;Cry1Ab/Gcprotein expression of HG-1 maize leaf in whorl stage and HG-1、HG-2 stem at silking stage is significantly higher than that of other materials. The laboratory and field test at whorl stage and silking stage show that the Asian corn borer resistant of HG-1 is significantly higher than that of the other transformants, in accord with the high expression ofCry1Ab/Gcprotein in leaf and stem of HG-1. The results of this study demonstrate that the expression of Bt protein is related to the Asian corn borer resistance at whorl stage and silking stage. The expression of Bt protein can be an important technical index as selecting excellent insect resistant transgenic maize, with operability, stability, saving time and other advantages.

Cry1Ab/Gcprotein expression; Transformants; nsect resistance

2016-05-22

*吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程資助(吉財教[2012]1072)；吉林省科技發(fā)展計劃項目資助(20160520060JH)

Q78

A

1000-5617(2016)03-0087-06

**通訊作者:yyjqishi@163.com