李英夫，宣兆博，廉曉宇

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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欖香烯誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡和對細(xì)胞周期各時相的影響

李英夫，宣兆博，廉曉宇*

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞在欖香烯誘導(dǎo)下形態(tài)的變化。方法：采用用流式細(xì)胞儀檢測人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞在欖香烯誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變。結(jié)果：欖香烯可以抑制體外培養(yǎng)的SHG-44細(xì)胞的生長，并且不同濃度的欖香烯對SHG-44細(xì)胞的抑制作用程度是不相同的，隨著欖香烯濃度的增加，SHG-44細(xì)胞的凋亡率升高，呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論：欖香烯對SHG-44細(xì)胞有非常明顯的增殖抑制作用，可以加速SHG-44細(xì)胞的凋亡，具有抗腫瘤活性。

欖香烯；SHG-44細(xì)胞；凋亡；細(xì)胞周期

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是位于神經(jīng)外胚層的腫瘤，屬于顱內(nèi)腫瘤的一種，一般手術(shù)治療難以徹底治愈，臨床手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)率非常高。現(xiàn)在我國神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物治療方面，一些新的化療藥物對穿透患者的血腦方面沒有突破，如何對神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行治療是醫(yī)學(xué)界一直的研究課題之一[1]。

欖香烯是從抗癌藥物莪術(shù)中提練出來的抗癌活性成分，呈揮發(fā)油類，通過進(jìn)行動物實驗和臨床實踐證明對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。

本文分析了欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡和對細(xì)胞周期各時相的影響，旨在為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供有益的理論依據(jù)。通過欖香烯對體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞誘導(dǎo)分化，對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44進(jìn)行體外培養(yǎng)，經(jīng)過不同濃度的欖香烯作用后，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變。結(jié)果顯示欖香烯可以抑制體外培養(yǎng)的膠體瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞生長，不同濃度的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44有著不同的抑制作用。對照組人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的存活率明顯的高于實驗組，隨著欖香烯濃度的增加，觀察組的細(xì)胞殺傷力越來越高,并呈劑量依賴性。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑

欖香烯；細(xì)胞培養(yǎng)基；胎牛血清；以上試劑由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供。

1.2 方法

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44由北京大學(xué)放射生物實驗室提供，在培養(yǎng)基里放入10%的胎牛血清，培養(yǎng)基中的溫度保持在35℃左右，在CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。運用比色法對欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行測定，移除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶，消化掉貼壁細(xì)胞，隨后加入10 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度，細(xì)胞培養(yǎng)液的濃度分別設(shè)置為0.05、0.15、0.25 mol/L，在每個孔里放入20 μL的噻唑藍(lán)，培養(yǎng)完成后將培養(yǎng)液移除。

測試完成后對吸光度的值進(jìn)行計算，并計算細(xì)胞增殖抑制率。用比色法對欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞殺傷作用進(jìn)行測定時，在每個孔里加入人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44。用流式細(xì)胞儀對欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行測定，在24孔平地培養(yǎng)板中，培養(yǎng)不同濃度的欖香烯，測定人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡壞死率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SSPS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率進(jìn)行比較，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

欖香烯抑制SHG-44細(xì)胞增殖效果明顯，不同濃度的欖香烯制劑與SHG-44細(xì)胞共同孵育24 h，相關(guān)顯微鏡下觀察細(xì)胞呈多邊形貼壁生長，細(xì)胞的數(shù)目較多。不同濃度的欖香烯組SHG-44細(xì)胞，浮著的細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞數(shù)目減少，隨著濃度的增加細(xì)胞的殺傷性越強。不同濃度的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44會有不同的抑制作用，0.25 mol/L的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的抑制作用大于0.05 mol/L的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的抑制作用。不同濃度的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的抑制作用見表1。

表1 不同濃度的欖香烯對SHG-44細(xì)胞周期及調(diào)亡率的影響

2.2 流式細(xì)胞術(shù)的試驗結(jié)果

不同濃度的欖香烯對SHG-44細(xì)胞的周期各時相變化都有影響，隨著欖香烯濃度的升高，作用效果越來越明顯。見表2。

2.3 透射電鏡的觀察結(jié)果

0.05 mol/L欖香烯組中SHG-44細(xì)胞的線粒體腫脹，細(xì)胞內(nèi)有空泡形成，0.25 mol/L欖香烯組中的SHG-44細(xì)胞染色質(zhì)靠邊緣進(jìn)行凝集，導(dǎo)致細(xì)胞核破碎，可以明顯看到凋亡現(xiàn)象。

表2 不同濃度的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的抑制作用及調(diào)亡率的影響

3 討論

通過對欖香烯誘導(dǎo)SHG-44細(xì)胞凋亡和對細(xì)胞周期各時相的影響進(jìn)行試驗，用欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞殺傷率進(jìn)行測試，采用的是MTT法中的比色法，用流式細(xì)胞儀對欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44細(xì)胞調(diào)亡進(jìn)行測試，不同濃度的欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44周期各時相均有影響。欖香烯使人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的G1期受阻細(xì)胞堆積，不能快速的進(jìn)入S期，使G2/M期的細(xì)胞數(shù)量相對較多，是由于細(xì)胞受到了損傷。

隨著藥物的濃度越來越高，患者細(xì)胞的殺傷作用逐漸增強，凋亡率在升高，組間的比較差異非常顯著。也說明了腫瘤是一種細(xì)胞的周期疾病，細(xì)胞的周期調(diào)整控制異常，是與細(xì)胞的癌變情況有關(guān)系的[2-4]。對照組人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44存活率明顯高于實驗組，而且實驗組中的每個組別隨著欖香烯濃度的增加，抑制作用在前期短暫的耐藥反應(yīng)之后一直在持續(xù)升高。欖香烯不僅可以抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44的增殖和調(diào)亡，也可以誘導(dǎo)調(diào)亡的抗腫瘤活性?？傊?，欖香烯有非常確度的抗腫瘤作用，毒副作用較小，抗癌譜廣，對SHG-44細(xì)胞有非常明顯的增殖抑制作用，可以加速SHG-44細(xì)胞的凋亡，同時也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤活性，其作用機理有待于進(jìn)一步的研究。

[1] 朱迎君，周莉，樊永平，等.基于數(shù)據(jù)挖掘的中醫(yī)藥治療膠質(zhì)瘤組方用藥規(guī)律探討[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2016,44(3):12-15.

[2] 吉宏明.Β-欖香烯抑制膠質(zhì)瘤兔角膜移植模型血管生成的實驗研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,36(4):38-40.

[3] 柳影,陳儇,郭杰,等.氯化甲基汞對人SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗腫瘤活性的體外實驗研究[J].中國實驗診斷學(xué),2010,14(4):475-478.

[4] 郭云寶,韓斌,楊洪發(fā).三氧化二砷對人腦SHG-44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的體外實驗研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2013,30(4):365-368.

理 論 探 討

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(No.2014-222)

李英夫(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：膠質(zhì)瘤的綜合治療。

廉曉宇*(1964-)，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)內(nèi)鏡在臨床中的應(yīng)用，膠質(zhì)瘤的綜合治療。

2016-06-07

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0011-02

修回日期：2016-07-05