吳傳松，李耀華

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術審評中心，北京，100044）

HBV基因分型檢測試劑性能評估研究要點

吳傳松，李耀華

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術審評中心，北京，100044）

依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》和乙型肝炎病毒核酸分型試劑自身特點，提出對 HBV基因分型檢測試劑性能研究的特殊要求。對該類試劑的參考品和質控品研制、陽性／陰性參考品符合率、最低檢測限、分析特異性、精密度、基因混合型研究、攜帶污染率等方面進行了詳細解析。闡述了乙型肝炎病毒基因分型類體外診斷試劑的性能研究要點。為從事該類產品注冊申報前性能研究的行業(yè)人員提供參考。

HBV基因型； 性能研究

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因型分型檢測試劑是指利用包括分子生物學相關方法在內的核酸檢測技術，以 HBV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿等樣本中的HBV不同基因型進行體外定性檢測的試劑。結合臨床表現(xiàn)和其他實驗室指標，乙型肝炎病毒基因型分型可作為乙型肝炎感染者臨床診療的輔助指標之一。由于不同的乙型肝炎病毒基因型對現(xiàn)有藥物治療可能存在不同的治療響應，乙型肝炎病毒分型基因檢測在慢性乙型肝炎患者治療中的作用正被越來越多人所關注［1］。檢測試劑的性能優(yōu)劣直接影響檢測結果是否能夠有效反映臨床樣本的真實狀態(tài)，檢測試劑性能也是反映產品主要原材料選擇、生產工藝及反應體系等多方面因素是否合理的客觀評價指標。檢測試劑性能研究應作為研究者在研制產品時的重點關注環(huán)節(jié)，并應在產品生產和使用過程中不斷研究并改進，以期在臨床應用時，減少產品檢測過程中可能出現(xiàn)的假陰性和假陽性［2］，避免因檢測結果錯誤造成患者延誤治療或治療方案制定不當。檢測試劑性能的研究方案應結合產品的反應原理、臨床用途、使用條件等綜合因素進行設計。產品性能評估應涵蓋研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內控標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料［3］。本文主要針對目前用核酸擴增反應原理的乙型肝炎基因型分型試劑盒在申請上市前進行性能研究的過程中，應注意的常見問題進行闡述。

1 產品分析性能

1.1 最低檢測限

對不同 HBV基因型進行系列稀釋，通過對不同系列稀釋樣本檢測結果進行統(tǒng)計后，選取95%（n≥20）檢出率水平作為最低檢出限確定標準。申報試劑時，對說明書描述的所有基因型應在病毒濃度最低檢出限或接近最低檢出限的條件下進行驗證。

1.2 分析特異性

1.2.1 交叉反應 用于 HBV基因分型檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類，主要考慮與 HBV基因分型核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀的病原體，以及不同基因型之間、乙型肝炎病毒其他基因型對被檢測基因型的影響。對于難以獲得的基因型，可采用針對該基因型構建的相同靶基因序列質粒進行交叉驗證。建議用高濃度的病原體對乙型肝炎病毒核酸陰性樣本進行交叉反應的驗證。研究者還應將所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬／型別和濃度確認方法等因素納入分析特異性研究方案。

1.2.2 干擾物質 影響該類檢測試劑的潛在干擾物質主要包括內源性干擾物質和外源性干擾物質。內源性干擾物質是指樣本中常見的影響檢測結果的物質，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等；外源性干擾物質是指影響檢測結果的常用抗凝劑、常用抗病毒藥物、干擾素、保肝治療藥物，如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等。在評價干擾物質對該類試劑性能影響時，建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質的干擾影響進行檢測。干擾物濃度的范圍應覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質濃度。應注明不同干擾物質對被檢測物質無干擾的最高限值。對于不易收集的干擾物質樣本，可使用臨床模擬樣本進行調節(jié)［4］。

1.3 精密度

精密度具體實驗方法可以參考相關國外或國內有關體外診斷產品性能評估文件進行。研究者應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產品的精密度評價，用于評價的樣本濃度至少應包含陰性、弱陽性和強陽性三個水平。同時，應設置合理的精密度評價周期方案。申請人還應選擇不同環(huán)境的實驗室進行重復實驗，以對室間精密度進行評價。

1.4 陽性／陰性參考品符合率

所有基因型別的陽性參考品均應按要求檢出陽性。考慮到濃度梯度的不同，應對各水平陽性參考品設置相應PCR循環(huán)閾值（Ct值）的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下其結果均應為陰性。

2 企業(yè)內部校準品及質控品的建立

2.1 內部參考品及試劑內對照（質控品）

由于乙型肝炎病毒不易培養(yǎng)，制備相應的參考品及質控品時，建議采用滅活病毒的血清／血漿。參考品及質控品的檢測方法應與被測臨床樣本的檢測方法一致。同時，在不同級參考品及質控品體系建立過程中，應具備完成的溯源鏈體系。

企業(yè)內部參考品以及質控品的設置必須客觀合理，能夠充分評價產品的質量。應采用核酸測序方法或其他方法對企業(yè)內部參考品以及質控品中的物質成分進行確認。

2.2 陽性參考品及陽性質控品

陽性參考品應包含試劑盒所能檢測的所有基因型（所有的單基因型以及所有的重組基因型），每個基因型應設置不同濃度水平。為滿足驗證產品性能的需要，至少應設置兩個濃度水平（弱陽性、中或強陽性）。常見基因型（如B型、C型）陽性參考品設置建議采用滅活病毒的血清／血漿；其他基因型陽性參考品設置可采用模擬臨床樣本。對于陽性參考品的獲取方式，建議使用核酸測序方法或者其他能證明問題的方法進行確認。

陽性質控品應包含目標靶基因，用于監(jiān)控整個檢測過程。陽性質控品作為單獨檢測過程，目的是模擬患者樣本，用于與患者樣本進行同時檢測。

2.3 陰性參考品及陰性質控品

可采用經確認無目標靶基因序列的樣本。陰性參考品及陰性質控品用于反映非特異擴增或檢測過程，當不存在目標序列時不應有相關信號。陰性參考品設置建議采用滅活的血清／血漿。陰性質控品應參與樣本核酸的平行提取，對假陽性結果進行質量控制。

2.4 靈敏度參考品（檢測限參考品）

靈敏度參考品是評價產品檢測能力的重要工具，對于定性產品來說，其設計的合理性顯得非常重要。在基因型設置方面，應包括試劑盒所包含的所有基因型；在濃度設置方面，應采用核酸定量的方法對該參考品進行定量檢測，明確被測物的具體量值，設置濃度應接近產品最低檢出限。

2.5 精密度參考品

精密度參考品應反映產品檢測的重復性以及重復檢測的穩(wěn)定性。該部分參考品應采用臨床樣本作為精密度參考品，需包括陰性、弱陽性、中或強陽性三個濃度水平的精密度驗證。

2.6 內對照（內標）

與目標靶基因平行提取、擴增，用于對檢測管內抑制物造成的假陰性結果進行質量控制。內對照（內標）可采用競爭性或非競爭性的引物設置［5］。

2.7 其他需要注意問題

如單個產品的檢驗原理為兩種方法學或多種方法學聯(lián)合檢測，應對產品中每種方法學均設置參考品及質控品，用于對不同種方法學的質量監(jiān)控，例如：檢測原理為 PCR-雜交方法聯(lián)用，在這種情況下，不僅需在PCR環(huán)節(jié)設置參考品及質控品對擴增過程進行質量控制，同時在基因探針雜交環(huán)節(jié)也必須設置質控程序對雜交過程進行質量控制。

3 其他

3.1 基因混合型的研究

該部分研究主要包括兩個目的：第一是研究申報試劑檢測不同濃度混合型的能力，申請人應設置不同濃度比例的混合型進行驗證；第二是研究申報試劑在判讀結果時，是否能夠有效的區(qū)分基因重組型和基因混合型，申請人應設置不同濃度的基因重組型與不同混合比例的基因混合型進行驗證。

因理想的不同濃度比例基因混合型樣本在臨床單位中難以收集，申報人可以使用臨床模擬樣本進行驗證。建議該部分樣本用核酸測序明確樣本中包含的所有基因型序列，同時應使用核酸定量的方法確定不同基因型的濃度。如申報產品的結果判讀無法有效區(qū)分基因混合型與基因重組型，應在產品說明書中進行注明。

3.2 HBV核酸分離純化

病毒DNA提取的主要目的是富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除 PCR抑制物，這是決定PCR成敗的重要因素之一。研究者都應對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細的驗證。

3.3 交叉污染和攜帶污染研究

該類產品是用于檢測乙型肝炎病毒感染人群。在臨床檢測中發(fā)現(xiàn)，部分臨床樣本會出現(xiàn)高濃度的乙型肝炎病毒載量。這部分臨床樣本在提取過程中會增加交叉污染及攜帶污染的可能性。在核酸提取過程中，陰性樣本可能因為被強陽性樣本污染，導致最終檢測結果為假陽性。

如采用自動提取設備提取 DNA，在攜帶污染試驗中，建議將高濃度陽性樣本與陰性樣本在同一待提取反應板中連續(xù)交替排列，并應進行多輪上述提取研究。建議試驗使用的高陽性樣本水平調整在接近該產品檢測能力的上限，將鄰近高陽性樣本的陰性樣本的檢測結果與未鄰近高陽性樣本的陰性樣本的檢測結果比較，以評估攜帶和交叉污染對檢測結果造成的影響。

［1］劉錫光，白東亭，賈繼東.乙型肝炎和丙型肝炎實驗診斷與致癌機制.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：170-190.

［2］徐偉文.體外診斷試劑研制常用技術指標之分析性能評估.分子診斷與治療雜志，2010，3（2）：140-144.

［3］呂允鳳.乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑性能評價要點.中國藥事，2013.9（10）：1072-1074.

［4］FDA.Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens［EB／OL］.（2005-12-08）［2012-08-10］http：／／www.fda.gov／cdrh／oivd／guidance／1560.html

［5］李金明.實時熒光PCR技術.北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：190-199.

（張增武編輯）

Registration Performance Evaluation Requirement for the Hepatitis B Virus Genotyping Detection Reagent

WU Chuan-song，LI Yao-hua
（Center for Medical Devices Evaluation of CFDA，Beijing 100044，China）

In accordance with IVD Registration Regulation and the Hepatitis B Virus Genotyping Detection Reagent’s own characteristics，the special requirements for the product performance evaluation were analyzed.Detailed analysis such reagents reference materials and quality control materials，positive／negative reference product compliance rate，the lowest sensitivity，analytical specificity，precision，hybrid genetic research and carry-over study were carried out.The main points of product performance of the hepatitis B virus genotype detection reagents were discussed.The results provided the reference information for the relevant personnel conducting performance evaluation study before submitting the registration application.

Hepatitis B Virus Genotype； Performance evaluation

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.033

2015-03-03；

2015-05-18

吳傳松，男，碩士，助理研究員，從事醫(yī)療器械技術審評。