肖 煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，韓 玨，楊 弘

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214081)

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尼羅羅非魚(yú)不同品系間mtDNA D-loop差異分析

肖 煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，韓 玨，楊 弘*

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214081)

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得尼羅羅非魚(yú)“88品系”(XH)、“99品系”(AN)和吉富品系(GF)3個(gè)主要養(yǎng)殖品系共95尾魚(yú)的mtDNA D-loop序列，并進(jìn)行堿基測(cè)序及對(duì)比分析，探究3個(gè)品系在遺傳結(jié)構(gòu)信息、保種現(xiàn)狀和選育潛力的差異。 結(jié)果表明:①3個(gè)品系個(gè)體序列片段長(zhǎng)度為550～556 bp，包括111個(gè)變異位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換、顛換、插入/缺失數(shù)依次為65、34、12，多態(tài)位點(diǎn)比例為18.64 %。②3個(gè)品系共有27個(gè)單倍型，XH、AN、GF單倍型數(shù)依次為12、7、10，其中GF、AN共享1個(gè)單倍型，XH、GF共享1個(gè)單倍型，其他為各品系獨(dú)有。3個(gè)品系的單倍型在NJ系統(tǒng)樹(shù)上互相交叉，GF有2個(gè)單倍型在變異水平上形成獨(dú)有的進(jìn)化枝。③3個(gè)品系間遺傳分化指數(shù)均大于0.05，存在中等程度的遺傳分化，其中XH與AN、XH與GF之間遺傳漂變起主要作用，AN與GF之間基因流起主要作用。研究結(jié)果表明，目前選育的3個(gè)尼羅羅非魚(yú)品系內(nèi)遺傳多樣性水平較高；品系間存在中等程度的遺傳分化，并具備高比例的獨(dú)有單倍型， 3個(gè)品系目前仍具備較高的選育潛力。

尼羅羅非魚(yú)；養(yǎng)殖品系；遺傳結(jié)構(gòu)；mtDNA D-loop；遺傳分化

尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)隸屬于鱸形目(Perciformes)、麗魚(yú)科(Cichlidae)羅非魚(yú)屬(Oreochromis)，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)魚(yú)類。20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)數(shù)次引進(jìn)尼羅羅非魚(yú)原種群體，經(jīng)過(guò)多代選育改良，形成數(shù)個(gè)性狀優(yōu)良的養(yǎng)殖品系，作為羅非魚(yú)主要養(yǎng)殖品系在我國(guó)南方主產(chǎn)區(qū)得到推廣，推動(dòng)了我國(guó)羅非魚(yú)種業(yè)穩(wěn)步、快速的發(fā)展。羅非魚(yú)不同品系群體間因?yàn)樵N地生境隔離、人工選育方式差異等因素在生長(zhǎng)特性和抗逆性方面也存在較大差異，同時(shí)在長(zhǎng)期的選育過(guò)程中因?yàn)榉N間雜交、選育強(qiáng)度等因素易發(fā)生種質(zhì)退化等現(xiàn)象[1]，因此了解目前羅非魚(yú)主要養(yǎng)殖品系的種質(zhì)情況對(duì)羅非魚(yú)的保種選育及遺傳多樣性保護(hù)具有非常重要的意義。mtDNA D-loop是線粒體DNA中的一段非編碼區(qū)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、高度多態(tài)、母性遺傳等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用種群的進(jìn)化研究和遺傳多樣性分析[2]。Beheregaray等[3]利用mtDNA D-loop結(jié)構(gòu)分析了海洋與湖泊中的銀漢魚(yú)群(Odontesthesargentinensis)的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩者有共同的祖先，因?yàn)樯匙冞w導(dǎo)致群體間出現(xiàn)明顯的遺傳分化；Ryota等[4]對(duì)利用mtDNA D-loop序列變異解析了日本北海道和本州的杜父魚(yú)群(Cottusnozawae)的遺傳結(jié)構(gòu)，并探尋導(dǎo)致魚(yú)群遺傳分化的地理因素；Nakadate等[5]利用mtDNA D-loop序列分析對(duì)藍(lán)鰭金槍魚(yú)(Thunnusorientalis)開(kāi)展個(gè)體繁殖力比較研究，尋找繁殖能力強(qiáng)的優(yōu)異雌魚(yú)；劉紅艷等[6]對(duì)3個(gè)海南、福建、廣東 3 地的野生黃鰭鯛(Sparuslatus)種群開(kāi)展mtDNA D-loop序列分析對(duì)比，對(duì) 3 地種群親緣關(guān)系進(jìn)行了比較；張玉波等[7]利用mtDNA D-loop序列對(duì)東方鲀屬11種魚(yú)類開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育遺傳分析，并由此推測(cè)東方鲀屬魚(yú)類起源于印澳熱帶海域(東印度洋和西太平洋海域)。上述研究針對(duì)同一種魚(yú)不同地理種群或養(yǎng)殖群體，利用傳統(tǒng)的標(biāo)記分析常常很難發(fā)現(xiàn)差異，而線粒體D-loop區(qū)豐富的變異可作為種群鑒定的一個(gè)很好的工具。本研究采用PCR、克隆結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)目前國(guó)內(nèi)尼羅羅非魚(yú)3個(gè)主要養(yǎng)殖品系開(kāi)展mtDNA D-loop分析，以期根據(jù)它們的基因片段多態(tài)性來(lái)揭示尼羅羅非魚(yú)不同品系養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，了解尼羅羅非魚(yú)的種質(zhì)現(xiàn)狀，為尼羅羅非魚(yú)的保種選育工作提供參考建議。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別采自淡水漁業(yè)研究中心保種的“88品系”尼羅羅非魚(yú)(簡(jiǎn)稱XH)30尾，“99品系”尼羅羅非魚(yú)(簡(jiǎn)稱AN)30尾，吉富羅非魚(yú)(簡(jiǎn)稱GF)35尾。湘湖品系尼羅羅非魚(yú)、埃及品系尼羅羅非魚(yú)的選育是采用群體選育法，而吉富羅非魚(yú)是采用家系選育法進(jìn)行的選育。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備

PCR反應(yīng)所用的Taq-DNA聚合酶、dNTPs、250 bp-ladder Marker等試劑均購(gòu)于TaKaRa生物公司。電泳儀為BIO-BAD PowerPac Universal；PCR儀為Eppondorf Mastercycler Gradient；成像儀為Gene Company Limited G-box型凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 基因組DNA的制備和檢測(cè)

尾靜脈取全血(ACD抗凝)，50 μl血液加裂解液(0.5 %十二烷基肌氨酸鈉、0.02 %蛋白酶K、10 mmol/L EDTA) 200 μl，50 ℃溫育2 h (其間不時(shí)搖動(dòng)混勻)，酚-氯仿法抽提DNA，無(wú)水乙醇-20 ℃過(guò)夜沉淀1次，70 %酒精洗滌1次，干燥后加0.1×TE 50 μl溶解DNA，50倍稀釋后即為模板用于PCR擴(kuò)增0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，稀釋至100 ng/μl，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 mtDNA D-loop區(qū)的PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)擬擴(kuò)增并測(cè)定羅非魚(yú)mtDNA D-loop區(qū)的序列，參考吳長(zhǎng)敬等[8]選擇了用于擴(kuò)增尼羅羅非魚(yú)mtDNA D-loop序列的1對(duì)引物344F與PHE1R，引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。引物序列為344F:5′-CTATTACTGGCATCTGGTTCC-3′和PHE1R:5′-ACATCTTCAGTGTTACGCTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與目的片段的測(cè)序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物用0.8 %瓊脂糖膠電泳，5 V/cm電泳0.5 h左右，G-Box記錄電泳結(jié)果，將確定為目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行正反向測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

先對(duì)正、反向序列進(jìn)行重疊區(qū)拼接，除去多余的堿基片段(Contig-Express軟件)。再對(duì)序列進(jìn)行編輯校正(BioEdit軟件)；之后進(jìn)行BLAST分析(GenBank)，確認(rèn)PCR得到的序列是羅非魚(yú)mtDNA D-loop區(qū)部分序列。對(duì)編輯校正后的序列進(jìn)行比對(duì)分析(ClustalX2軟件)。分析序列特征，統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成和變異情況，用Kimura2-parameter模型計(jì)算遺傳距離，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(MEGA5軟件)。統(tǒng)計(jì)品系的遺傳多樣性參數(shù)H單倍型多樣度、K平均核酸差異數(shù)、Pi核苷酸多態(tài)性、Fst遺傳分化指數(shù)以及品系間的基因流Nm值(DnaSPv5軟件)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚(yú)mtDNA D-loop區(qū)部分序列結(jié)構(gòu)特征

mtDNA D-loop序列片段在對(duì)比除去引物序列后，堿基序列長(zhǎng)度為550～556 bp，部分序列出現(xiàn)堿基插入/缺失現(xiàn)象，導(dǎo)致序列出現(xiàn)長(zhǎng)度的多態(tài)性。序列堿基組成見(jiàn)表1，3個(gè)品系的堿基組成基本一致，無(wú)顯著差異。A、G、T、C 4個(gè)堿基的平均含量分別

表1 尼羅羅非魚(yú)3個(gè)品系mtDNA D-loop序列堿基組成

為29.1 %、15.6 %、35.0 %、20. 2 %，可見(jiàn)其中堿基T的含量最高，堿基G的含量最低。A+T(平均為64.1 %)的含量明顯高于G+C(平均為35.9 %)的含量。

2.2 羅非魚(yú)不同品系的遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)Mega 5軟件統(tǒng)計(jì)控制區(qū)序列變異位點(diǎn)在不同選育品系中的分布，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，3個(gè)品系的轉(zhuǎn)換數(shù)>顛換數(shù)>插入/缺失數(shù)，總體轉(zhuǎn)換/顛換比率為1.91。95尾羅非魚(yú)共檢測(cè)出27個(gè)單倍型，其中GF、AN共享1個(gè)單倍型(GF02與AN01相同)，XH、GF共享1個(gè)單倍型(XH03與GF08相同)，其他單倍型分別為各群體獨(dú)有。

表2 尼羅羅非魚(yú)3個(gè)品系mtDNA D-loop區(qū)序列變異

XH01～13:XH的13種單倍型；GF01～10:GF的10種單倍型；AN01～07:AN的7種單倍型；點(diǎn)(.)表示與第1條序列相同，短橫線(-)表示插入或缺失XH01-13:the thirteen haplotypes of XH；GF01-10:the ten haplotypes of GF；AN01-07:the seven haplotypes of AN; Identity with the first sequence is denoted by dots(·) and insertion/deletion position is denoted by short horizontal lines(-)圖1 尼羅羅非魚(yú)3個(gè)品系mtDNA D-loop區(qū)部分序列變異Fig.1 Variations of partial sequence of D-loop region in three strains of tilapia

以27個(gè)單倍型的D-loop序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹(shù)及其在3個(gè)選育品系中的分布如圖2所示。單倍型在3個(gè)養(yǎng)殖品系中的分布可以看出，各品系都已形成自己特有的單倍型類群，其中XH品系中XH02單倍型出現(xiàn)頻率最高，包括9個(gè)個(gè)體；GF品系中GF05單倍型出現(xiàn)頻率最高，包括12個(gè)個(gè)體；AN品系中AN01單倍型出現(xiàn)頻率最高，包括18個(gè)個(gè)體。3個(gè)品系中AN01(GF02)單倍型出現(xiàn)頻率最高，共23個(gè)。由拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以看出，27種單倍型形成3大分支，3個(gè)選育品系的單倍型在NJ系統(tǒng)樹(shù)上互相交叉，其中GF品系出現(xiàn)的單倍型(GF01、GF09)形成單獨(dú)的一個(gè)進(jìn)化枝，尼羅羅非魚(yú)3個(gè)養(yǎng)殖品系在控制區(qū)序列變異水平上有各自的特點(diǎn)。

圖2 27個(gè)單倍型的NJ系統(tǒng)樹(shù)及其在尼羅羅非魚(yú)各品系中的分布Fig.2 NJ phylogenetic tree of twenty-seven haplotypes and its distribution in different strains of tilapia

品系Strains單倍型多樣度H平均核苷酸差異數(shù)K核苷酸多態(tài)性PiXH0.87120.130.0375GF0.83420.730.0380AN0.62821.800.0399

表4 3個(gè)品系間的基因交流Nm值(左下)和遺傳分化Fst值(右上)

表5 3個(gè)品系間遺傳距離(下三角)和標(biāo)準(zhǔn)差(上三角)

2.3 品系群體遺傳多樣性參數(shù)的統(tǒng)計(jì)

單倍型多樣度大小依次排列為GF>XH>AN；平均核酸差異數(shù)大小依次為AN>GF>XH；核苷酸多態(tài)性(Pi)是衡量一個(gè)品系養(yǎng)殖群體mtDNA遺傳多樣性的重要指標(biāo)，其大小排列依次為AN>GF>XH，其中AN品系多樣性最高為0.399。

2.4 品系間遺傳分化及遺傳距離

從品系間遺傳分化指數(shù)Fst和基因流Nm的角度對(duì)品系間的遺傳分化進(jìn)行分析(表4)，3個(gè)品系群體之間的遺傳分化指數(shù)均大于0.05，已經(jīng)產(chǎn)生了中等程度的遺傳分化。GF和AN之間Nm>1，基因流在遺傳分化中起了主要作用；XH與AN、GF之間Nm<1，遺傳漂變?cè)谶z傳分化起重要作用。

用Kimura 2-parameter 模型計(jì)算基于控制區(qū)部分序列差異的3個(gè)品系群體間遺傳距離的D值(表5)。群體間的堿基序列的差異反映的是親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。由表5可知，群體間的遺傳距離以 XH與GF之間的值相對(duì)較大(0.070)，而GF與AN遺傳距離較近(0.047)，XH與GF、AN之間的遺傳距離顯著大于GF與AN之間的遺傳距離。

3 討論與結(jié)論

人工選育過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)不確定因素，如近交機(jī)率增加、有效群體容量不斷減少等，有可能導(dǎo)致遺傳多樣性降低，從而降低遺傳效應(yīng)[9-10]，同時(shí)選育過(guò)程中群體純度的提高又可以將優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀穩(wěn)定遺傳到下一代中，具備極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此了解不同品系的尼羅羅非魚(yú)的遺傳信息結(jié)構(gòu)對(duì)于尼羅羅非魚(yú)的種質(zhì)改良和選育潛力挖掘等方面具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的3個(gè)品系養(yǎng)殖群體的mtDNA D-loop區(qū)序列中，A、G、T、C 4個(gè)堿基的平均含量分別為29.1 %、15.6 %、35. 0 %、20. 2 %，由各堿基的含量可以看出，控制區(qū)序列的堿基組成呈現(xiàn)出很強(qiáng)的偏向性，在4 種堿基中，G的含量最低，T的含量最高；此外，尼羅羅非魚(yú)控制區(qū)中A+T的含量(64.1 %)明顯高于G+C的含量(35.9 %)，與脊椎動(dòng)物線粒體DNA序列的堿基組成特點(diǎn)相符合[11]。在3個(gè)品系共檢測(cè)到111個(gè)變異位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換65個(gè)，顛換34個(gè)，有12個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，可見(jiàn)堿基的轉(zhuǎn)換數(shù)明顯大于顛換數(shù)，符合動(dòng)物線粒體DNA堿基變異的特點(diǎn)，轉(zhuǎn)換在近親種間比較容易頻繁的發(fā)生，顛換則在較遠(yuǎn)源種間逐漸顯現(xiàn)。

Pi核苷酸多態(tài)性是分子遺傳學(xué)中評(píng)價(jià)遺傳多樣性的靈敏指標(biāo)，可用來(lái)衡量不同養(yǎng)殖品系的遺傳多樣性的高低。本研究中，3個(gè)選育群體的Pi值分別為0.0375、0.0380、0.0399，相比太湖鰱魚(yú)(Hypophthalmichthysmolitrix)的平均Pi值為0.0124[12]，養(yǎng)殖刀鱭(Coilianasus)的平均Pi值為0.0099[13]，黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)的平均Pi值為0.0061[14]，本研究中的尼羅羅非魚(yú)各品系養(yǎng)殖群體間mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)性比較豐富。95個(gè)樣本共檢測(cè)出27個(gè)單倍型，在NJ系統(tǒng)樹(shù)中27種單倍型形成了3大分支，推斷這些單倍型可能來(lái)源于3個(gè)不同母系祖先。尼羅羅非魚(yú)原產(chǎn)于非洲，其中XH、AN 2個(gè)品系是20世紀(jì)80～90年代我國(guó)從非洲尼羅河不同流域引進(jìn)的原始群體，并在國(guó)內(nèi)通過(guò)多代群體選育；而GF品系是由FAO通過(guò)對(duì)4個(gè)非洲原產(chǎn)地直接引進(jìn)的尼羅羅非魚(yú)品系(埃及、加納、肯尼亞、塞內(nèi)加爾)和4個(gè)在亞洲廣泛養(yǎng)殖的尼羅羅非魚(yú)品系(以色列、新加坡、泰國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣)進(jìn)行家系選育而成[15]。尼羅河羅非魚(yú)分布在尼羅河周邊了維多利亞湖、艾伯特湖等多個(gè)水系，由于一定的地理因素使得不同生境的尼羅羅非魚(yú)可能具有不同遺傳背景的母系來(lái)源[16-17]，而吉富羅非魚(yú)又是多個(gè)品系雜交而成，母本來(lái)源更加復(fù)雜，單倍型結(jié)果分析也較好地印證了以上因素。

由單倍型在3個(gè)品系養(yǎng)殖群體中的分布可以看出，GF品系與AN、XH品系分別共享1個(gè)單倍型，其他25個(gè)單倍型均為3個(gè)品系獨(dú)有。NJ系統(tǒng)樹(shù)上3個(gè)品系的單倍型在互相交叉，但同時(shí)GF品系中GF01、GF09單倍型形成獨(dú)有的進(jìn)化枝，說(shuō)明GF品系在控制區(qū)序列變異水平上具備獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)。從群體遺傳分化指數(shù)Fst對(duì)品系間的遺傳分化進(jìn)行分析，Wright[18]認(rèn)為，遺傳分化指數(shù)Fst<0.05表示群體間無(wú)遺傳分化發(fā)生，3個(gè)選育品系之間的遺傳分化指數(shù)均大于0.05，說(shuō)明它們之間已經(jīng)產(chǎn)生了中等程度的遺傳分化。而理論上Nm< 1時(shí)，遺傳漂變是群體間遺傳分化的主要因素；Nm> 1，基因流為主要作用[19]。XH與GF、AN之間基因流均小于1，遺傳漂變?cè)谶z傳分化中起了主要作用；而GF與AN之間基因流大于1，在遺傳分化中起了主要作用，阻止了由遺傳漂變引起的遺傳分化。同時(shí)在遺傳距離方面還是Fst方面，XH品系與AN、GF品系間遺傳距離大于AN與GF之間的遺傳距離，說(shuō)明相比XH品系A(chǔ)N與GF親緣關(guān)系較近。遺傳結(jié)構(gòu)研究表明3個(gè)選育品系目前仍具備較高的選育潛力，研究結(jié)果為后續(xù)的尼羅羅非魚(yú)的種質(zhì)改良和選育潛力挖掘積累了遺傳背景信息，為羅非魚(yú)選育工作提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Genetic Variation of Mitochondrial DNA D-loop Sequences from Different Strains of Nile tilapia,Oreochromisniloticus

XIAO Wei, LI Da-yu, ZOU Zhi-ying, ZHU Jing-lin, HAN Jue, YANG Hong*

(Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Jiangsu Wuxi 214081, China)

The mitochondrial DNA D-loop sequences of ninety-five individuals from three dominated tilapia culture strains [Nile tilapia ‘88 strain’(XH), ‘99 strain’(AN) and GIFT strain(GF)]were studied to understand the differences of the genetic structure, breeding effect and genetic potential of the three strain populations. The results showed that:(i)The length of their region sequences from three populations was 550-556 bp, including 111 variable sites, of which the transition, transversion and insert/deletion sites number were 65, 34 and 12, respectively, polymorphic loci occupying 18.64 % in total sites.(ii)There were 27 haplotypes in three strain populations, which was 12 for XH strain, 7 for AN strain and 10 for GF strain, respectively, of which GF and AN shared a haplotype, XH and GF shared another haplotype, and others were exclusive to each strain. The haplotypes of three strains crossed each other in the NJ tree but two special haplotypes of GF formed a unique clade. (iii)TheFstvalues among three strain populations were all more than 0.05, which indicated that the genetic differentiation among them was moderate, of which the genetic drift played a major role between XH and AN, XH and GF, otherwise the gene flow played a main role between AN and GF. It was concluded that there was a high level of genetic diversity in three Nile tilapia strain populations, and there were moderate genetic differentiation and a high proportion of unique haplotypes among three strain populations, which indicated that the three tilapia strains still had a full potentiality in breeding selection.

Nile tilapia; Aquaculture strains; Genetic structure; Mitochondrial DNA D-loop; Genetic differentiation

1001-4829(2016)11-2752-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.044

2015-11-14

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-49)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2015JBFM18)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃(2130106)

肖 煒(1982-)，男，江蘇宜興人，助理研究員，主要從事羅非魚(yú)遺傳育種研究，E-mail xiaow@ffrc.cn，*為通訊作者，E-mail yangh@ffrc.cn。

S917.4

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