現(xiàn)代核磁共振技術教學研究及其在分析檢測中的應用

呂玉光　宋　笛　于莉莉　王偉娥　王朝興

杜夢圓1　杜浩然1　高蕻冰1　 石春卉3

(1.佳木斯大學 藥學院，佳木斯 154007；2.佳木斯大學 國際教育學院，佳木斯 154007；3.佳木斯大學 臨床醫(yī)學院，佳木斯 154002)

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現(xiàn)代核磁共振技術教學研究及其在分析檢測中的應用

呂玉光1宋笛1于莉莉2王偉娥1王朝興1

杜夢圓1杜浩然1高蕻冰1石春卉3

(1.佳木斯大學 藥學院，佳木斯 154007；2.佳木斯大學 國際教育學院，佳木斯 154007；3.佳木斯大學 臨床醫(yī)學院，佳木斯 154002)

核磁共振儀主要面向科研工作者, 因此該儀器的開放對象為經(jīng)常使用該儀器的本院教師和在讀研究生。在教學和科研方面, 目的是提高學生的實踐能力和創(chuàng)新能力，使學生成為高素質的應用型、創(chuàng)新型人才；培養(yǎng)一批熟悉儀器設備的性能、工作條件、操作方法的人才，為他們將來步入工作崗位適應社會的發(fā)展和需求打下良好的基礎。同時也培養(yǎng)一大批具有實際操作技能和管理經(jīng)驗的專門人才，以滿足社會對高素質應用型人才的需求。因此，現(xiàn)代核磁共振技術教學和科研研究方面應用非常廣泛。

核磁共振技術教學研究分析檢測應用研究

核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)由于可以廣泛應用于化學、化工、醫(yī)藥、生物、醫(yī)學、材料等研究領域的樣品測試，受到了高等院校的青睞，隨著我國中央和各級地方政府對高等辦學經(jīng)費和科研項目投入的增加，目前國內擁有核磁共振儀器的高等學校和科研院所非常普遍，有的單位還擁有不止一臺。但是由于該儀器價格昂貴，操作及維護比較復雜，一般有專人負責管理、維護和使用，一般的本科生、研究生無法實際操作，也沒有針對本科生或研究生的實驗課程。核磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy, MRS)是利用磁共振成像設備, 獲得物質的磁共振波譜信息, 并探測其含量變化的新技術。核磁共振波譜是由化學位移、J-耦合裂分的波形及頻率成分按其內在規(guī)律排列組合而成的, 可用于測定分子中某些原子的數(shù)目、類型和相對位置。

本文結合核磁共振技術近年來取得新成果, 介紹核磁共振波譜在分析檢測中的應用。例如，體內藥物分析是對生物體內藥物及其代謝物的分析。由于體內樣品具有藥物及其代謝物在大量的體液中濃度很低; 存在著內源性干擾物質; 取樣量受限制; 樣品不重復性這些特點。而NMR在體內藥物分析中有明顯的優(yōu)點, 即簡便性、無損傷性、連續(xù)性、高分辨性和多目標性, 使其在體內藥物分析中有較廣泛的應用。近年來NMR譜技術發(fā)展到對整體生物系統(tǒng)進行體內藥物分布、代謝監(jiān)測。因此，現(xiàn)代核磁共振技術在分析檢測中的具有重要的作用和意義[1-6]。

1　 國內外研究現(xiàn)狀分析

自1946年美國斯坦福大學的F. Bloch教授和哈佛大學的EM. Purcell教授領導的兩個實驗室首次獨立地觀察到核磁共振(NMR)現(xiàn)象以來, 已有10位科學家因在核磁共振技術領域的卓越貢獻而榮獲諾貝爾獎, 由此可見這門技術所發(fā)揮作用的重要性。核磁共振波譜是利用磁共振成像設備, 獲得物質的磁共振波譜信息, 并探測其含量變化的新技術。由化學位移及J-耦合裂分的波形及頻率成分按其內在規(guī)律排列組合而成的, 它可以由自由感應衰減信號或自旋回波信號轉換成振幅與頻率的函數(shù)而獲得。

核磁共振法以其重現(xiàn)性好、特征性強等優(yōu)點已成為藥物研究的重要手段。特別是最近發(fā)展起來的擴散排序核磁共振法、二維和三維氫譜、碳譜數(shù)學解譜、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術為研究藥物有效成分、分析物質化學結構、創(chuàng)建合理的藥物/臨床療效結構模式等方面帶來了廣闊前景。利用該法還可進行痕量、無損、非分離等在線分析,為有效地研究藥物有效成分帶來了巨大幫助。由于核磁共振具有指紋圖譜特點, 因而近來創(chuàng)建的中成藥核磁共振指紋圖譜鑒定分析法為中成藥的分析鑒別帶來了快速、有效、可靠的途徑。同時隨著天然藥物生產(chǎn)領域的發(fā)展,核磁共振作為質量控制的手段已得到重視,并逐漸地應用于實踐?？傊? 核磁共振無疑會給分析檢測研究帶來巨大的推動作用[7-14]。

2　研究步驟和創(chuàng)新方法

目前國內多數(shù)擁有核磁共振儀的單位對有關核磁共振的教學主要以理論教學為主，注重理論知識的講解，結合演示實驗，或以虛擬軟件為平臺進行模擬實驗，學生基本無法上機操作。甚至根本不開設實驗課，只講述理論課，這與國內日益增長的對大型儀器的管理維護人才的需求不相適應。國外的大學一般對研究生開放，研究生經(jīng)過培訓并考核合格后可以獨立上機操作。核磁共振理論課內容比較深奧，學生尤其是本科生普遍反映課程枯燥，知識難于掌握，如果在理論課程講述過程中增加儀器介紹以及開設相應的實驗課，比如介紹儀器的起源，簡單的工作原理，最新應用技術的進展，并結合直觀的上機實驗操作，使學生充分了解核磁共振的最新功能和技術，可以大大激發(fā)學生的學習熱情和動手操作的欲望，對最終達到拓展視野、學以致用、學會創(chuàng)新、掌握技能的教學目的具有很好的促進作用。實驗教學是培養(yǎng)學生綜合素質和創(chuàng)新能力的不可替代的平臺，是鞏固理論教學，培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要環(huán)節(jié)。探討如何結合核磁共振的新功能和新技術，對實驗教學內容進行改革和創(chuàng)新，改變以往實驗課依附于理論課，滯后于新知識、新技術發(fā)展的實驗教學模式，對提高學生的學習興趣意義重大。實驗教學不僅僅是理論聯(lián)系實際的重要環(huán)節(jié)，更重要的是其本身就是培養(yǎng)學生自己動手解決實際問題的能力、自我學習能力、培養(yǎng)創(chuàng)新精神和創(chuàng)造能力的重要途徑。事實表明，高等學校的實驗室是學生提高動手能力，發(fā)展創(chuàng)新的重要基地。尤其是大型儀器設備，是高等學校的優(yōu)質資源，是培養(yǎng)高層次人才、發(fā)展高科技的重要工具。因此加強實驗教學、重視學生能力的培養(yǎng)已越來越受到各高校的重視。傳統(tǒng)的實驗教學方式常常束縛了學生的主動性和創(chuàng)造性，不利于培養(yǎng)學生分析和解決問題的能力，更不利于創(chuàng)新精神和實踐能力的培養(yǎng)和提高。為培養(yǎng)學生實踐能力、創(chuàng)新精神、創(chuàng)新能力和科學素養(yǎng)，核磁共振可以考慮開設原理性和研究性兩類實驗課程。原理性實驗課可以幫助學生建立和鞏固核磁共振波譜的基本概念和基本理論，培養(yǎng)科學素養(yǎng)，研究性實驗(創(chuàng)新實踐課程，學生可獨立設計實驗方案，以實現(xiàn)預期實驗目標)可以鍛煉學生的綜合技能，為“大學生創(chuàng)新科技計劃”、“挑戰(zhàn)杯”、“新苗人才計劃”提供技術支撐與科研平臺。為了既培養(yǎng)學生的實驗能力，又保護核磁共振儀器設備，使用者必須經(jīng)過嚴格的操作培訓，熟悉儀器設備的性能、工作條件、操作方法及注意事項，考核合格，經(jīng)授權后方可上機操作。使用時應該填寫“大型精密儀器設備使用記錄”，未經(jīng)授權的任何人都不得使用或不得單獨使用該儀器設備。

為強化學生的實踐能力，充分利用儀器，建立開放實驗室是未來大型儀器教學與管理改革的方向。建立完善的大型儀器的開放實驗室管理制度，不僅可以將管理人員從繁重的樣品測試中解脫出來，還可以大大提高儀器利用率，更重要的是提高學生的實踐能力和創(chuàng)新能力，使得學生成為高素質的應用型、創(chuàng)新型人才，同時也培養(yǎng)了一批熟悉儀器設備的性能、工作條件、操作方法的人才，為他們將來步入工作崗位適應社會的發(fā)展和需求打下良好的基礎，在以上工作的基礎上，參考國外先進經(jīng)驗，我們準備利用校園網(wǎng)與儀器相結合，建設核磁平臺網(wǎng)絡化開放管理系統(tǒng)，包括建立核磁平臺主頁、網(wǎng)上機時預訂系統(tǒng)、數(shù)據(jù)傳遞系統(tǒng)、儀器的遠程監(jiān)控系統(tǒng)、網(wǎng)絡安全防護系統(tǒng)、電子門禁卡等多個子系統(tǒng)，實現(xiàn)全天候為研究人員、研究生開放服務。儀器管理人員可實現(xiàn)對儀器的遠程監(jiān)控，經(jīng)過培訓并上機操作考核通過的研究生或教師，可以獲得獨立上機操作資格證，可憑證預訂機時，獨立上機操作測試樣品。核磁譜儀實驗室安裝門禁電子鎖，實驗人員預訂機時后憑本人門禁卡就能夠進入實驗室進行樣品測試。實驗結束后可在自己的實驗室中通過網(wǎng)絡下載并處理數(shù)據(jù)、查看、打印譜圖，節(jié)約了用戶占用核磁譜儀上機時間，實現(xiàn)全年全天候開放服務。這種通過網(wǎng)上預約、門禁刷卡進入、自行上機操作完成測試任務的完全開放形式，不僅可以培養(yǎng)更多的人才，也節(jié)省了專人測試的操作人員，同時促進了大型儀器的開放使用，提高了大型儀器使用效率。在分析檢測中的應用如下：

在天然藥物分析中的應用, 天然藥物成分紛繁復雜, 隨著分析技術的快速發(fā)展,越來越多的技術被應用于天然藥物研究，核磁共振以其獨特的優(yōu)點得到越來越多的重視。天然藥物的研究, 由于其特殊性存在諸多特點。天然藥物有效成分含量偏低且存在多種相似物質對分析產(chǎn)生干擾, 以往的分析手段在鑒別相似有機物質時缺乏手段。核磁共振光譜是指紋波譜的一種, 它能夠彌補其它分析方法的不足, 在分析天然藥物的有效成分、鑒別藥物偽劣、分析產(chǎn)物產(chǎn)地、研究栽培和野生藥物成分差別以及藥物質量控制等方面, 發(fā)揮重要作用。天然藥物中成分十分復雜, 而有效物質只有一種或數(shù)種, 因此這對藥物質量的檢測提出了很高的要求。傳統(tǒng)的方法是對中藥進行色譜分析, 而隨著多項研究表明, 核磁共振圖譜可以很好的表征化學成分特征和相對含量的差異, 且非?？煽? 可以很好地應用于質量檢測。德國光譜分析試驗室的Bernd Diehi博士等將H-NMR用于蘆薈質量檢測, 結果表明H-NMR在檢測質量方面是非常有效的。野生和栽培藥物在成分上總體是相似的,但往往有效成分存在著諸多微小差異。這些微小差異由于理化性質非常相似, 所以普通的分析方法難以區(qū)別它們。核磁共振是指紋圖譜中的一種,它在鑒定天然藥物的優(yōu)越性和可靠性方面是獨特的。它可以有效地鑒別藥材真?zhèn)魏推焚|優(yōu)劣。在氘代試劑使用方面，一般使用氘代的H2O、DMSO、CDCl3和CH3OH，對天然藥物成分沒有影響，且可以完全回收樣品。

2.1NMR與生物分子的定量分析

積分曲線高度與引起該組峰的核數(shù)呈正比關系。這不僅是對化合物進行結構測定的重要參數(shù)之一, 而且也是定量分析的重要依據(jù)。用NMR技術進行定量分析的最大優(yōu)點是: 不需引進任何校正因子或繪制工作曲線, 即可直接根據(jù)各共振峰的積分高度的比值求算該自旋核的數(shù)目。

2.2NMR與代謝物的動態(tài)變化

通過測定和分析在一定時間內依次收集的尿樣、血清或其它生物樣品,就可以得到器官內代謝物的動態(tài)變化模式。利用NMR可以在不做任何物理分離(無損傷性,不破壞樣品的結構和性質)和化合物定性分析的條件下, 可在一定的溫度和緩沖范圍內進行生理條件或接近生理條件的實驗, 表征和研究海量的代謝信息及其變化規(guī)律(代謝組學), 從而得到豐富生理、藥理和毒理等生物學信息。

2.3NMR成象技術與臨床檢測

NMR成像技術以其無輻射損傷、無破壞性、無試劑侵入、能獲得全立體圖像等突出優(yōu)點很快就受到科學界的重視, 技術發(fā)展非常迅速。其幾乎集各種醫(yī)學成像的優(yōu)勢于一身, 很快就在臨床定位、診斷和治療監(jiān)視中發(fā)揮了重要作用。對學生有序開放核磁共振波譜儀等大型儀器不僅培養(yǎng)了學生學習與科研的興趣，更為學生提供了實踐學習的條件，又可充分發(fā)揮實驗室現(xiàn)有資源的作用，提高儀器設備的利用率和使用效益，同時也培養(yǎng)了一大批具有實際操作技能和管理經(jīng)驗的專門人才，以滿足社會對高素質應用型人才的需求。

利用核磁譜研究蛋白質，已經(jīng)成為結構生物學領域的一項重要技術手段。不過核磁常局限于35kDa以下的小分子蛋白，盡管隨著技術的進步，稍大的蛋白質結構也可以被核磁解析出來。蛋白質分子量大，結構復雜，一維核磁譜常顯得重疊擁擠而無法進行解析，使用二維，三維甚至四維核磁譜，并采用13C和15N標記可以簡化解析過程，但同時也使解析譜圖過程復雜化。

另外核磁共振與紫外可見光譜和紅外光譜相比，靈敏度和精確度相對較低，與傳統(tǒng)檢測技術的競爭以及設備昂貴測試成本高等原因，核磁共振技術在藥物鑒定中的使用頻率遠不及色譜和質譜等分析技術。通過提高磁場強度，用高靈敏度探頭，對譜儀和實驗方法進行改進。

3　教學方法改進

目前，藥學院藥學化學實驗中心已經(jīng)同黑龍江省高校和科研院所等單位的有關實驗室建立了良好的合作科研關系，承擔了以上單位所主持國家項目，產(chǎn)品研發(fā)中的分析測試任務。

第一步：應用現(xiàn)代分析化學方法把教學與核磁共振儀器分析技術相結合，突出核磁共振儀器測定技術應用的知識的重要性，結合實例，使其向熟悉掌握大型現(xiàn)代儀器操作步驟方向過渡。

第二步：核磁共振教學與產(chǎn)品質量控制技術相結合，加強理論知識的同時，注重核磁共振儀器分析方法在實踐中應用的介紹，使學生對現(xiàn)代核磁共振儀器分析有初步的了解。

第三步：通過反饋信息，對教學方法進行總結與歸納，使其形成成熟的理論。為了適應教學的要求,我們將編輯一本淺顯易懂的現(xiàn)代儀器分析方法教材，這將對我們在的分析化學教學工作中提供非常有利的方便條件。學院積極支持核磁共振教學工作，為了使這項工作順利進行，學院首先鼓勵教師申報教學課程及立項工作，組織教師進行研討，制定教學方案，并在教學過程中組織學生進入實驗室與學生進行交流。教師和學生反饋效果非常好。

綜上所述，教研室和實驗室老師教學經(jīng)驗豐富，教學理念與課程目標明確，教學理念先進、注重培養(yǎng)學生綜合素質的能力，還有學院與學校對教學政策的支持，為教學方法改進的順利實施提供良好的技術支持。

4　核磁共振實驗教學探索

基于以上思路，參考國外先進經(jīng)驗，近幾年對我校的400MHz核磁共振儀的教學(主要是實驗教學)與管理方式進行以下探索。

4.1在本科生和研究生培養(yǎng)方案中增加核磁共振原理性實驗課程

原理性實驗課程作為本科生的選修課，主要開展核磁共振氫譜的實驗課程；研究生作為必修課，開展核磁共振氫譜、碳譜和DEPT譜的實驗課程，安排固定時間上機操作。有專門的教師負責培訓，講解基本操作要求、注意事項，并指導學生完成樣品測試，數(shù)據(jù)處理，獲得完整的譜圖。課后學生結合理論課知識對譜圖進行解析、鑒定樣品的化學結構并完成實驗報告。主要目的是讓學生了解核磁共振儀器的構造及基本工作原理，初步掌握一維譜圖的操作及數(shù)據(jù)處理方法，用實驗結果對理論進行驗證，加深對理論知識的理解，培養(yǎng)學生對科學研究的興趣。

4.2針對本科生，開設研究性創(chuàng)新實驗課程

在滿足日常測試和原理性實驗課需要的基礎上，安排研究性創(chuàng)新實驗課程。為“大學生創(chuàng)新科技計劃”、“挑戰(zhàn)杯”、“新苗人才計劃”提供技術支撐與科研平臺。研究性創(chuàng)新實驗課程每學期公布開放教學機時，接受自由報名申請。學生自行制定實驗內容和實驗方案，專業(yè)教師對申報的實驗方案進行審核，確定后統(tǒng)一安排時間，在管理人員的指導下由學生自行上機操作，實現(xiàn)開放式管理。學生自行制定實驗報告、分析實驗結果、論證實驗過程，并詳細記錄實驗過程中儀器使用方面出現(xiàn)的問題或異常情況并反饋給儀器管理人員，以便與實驗室管理人員形成良好的互動和促進，完善儀器的管理。

4.3針對研究生，進行不定期的短期的操作培訓，考核合格可獨立進行樣品測試

部分研究生在科研過程中，具有一定的使用儀器設備的需求，對他們專門開展有針對性的培訓。一般每學期至少1次，內容主要是一維和常用二維譜測試的實際操作訓練，所有參加培訓學生均經(jīng)過嚴格的考核，考核合格后獲得培訓合格證書，為研究生自己上機測試奠定基礎。核磁共振儀主要面向科研工作者, 因此該儀器開放對象為經(jīng)常使用該儀器的本院教師和在讀研究生, 不對偶爾測試者開放使用。教學需要時, 儀器管理者更需要把磁體室管好, 組織好教學秩序, 確保在非常安全的情況下開始講授課程。

目前國內已經(jīng)有一些單位和學校建立了比較成熟的核磁共振技術操作培訓以及儀器網(wǎng)上預約，儀器管理制度，我們向北京大學、中國科學院化學所和知名專家咨詢一些好的建議和經(jīng)驗。制定了相應儀器管理制度，采取了專人管理和網(wǎng)上預約。

3年來, 400兆液體核磁共振儀的開放使用極大地提高了各課題組利用該儀器開展分 析測試的積極性。學校每年所發(fā) 表的論文中大多數(shù)都 得到基金資助, 儀器得到充分使用, 儀器的運行和維護有一定的經(jīng)費保障, 這極大地調動了儀器管理人員的積極性, 也為其他大型儀器的開放做出了榜樣。我們正在加強核心技術隊伍建設, 激發(fā)技術人員鉆研技術的積極性, 使儀器開放工作做得更加完善。

5　致謝

感謝國家自然科學基金項目(21346006), 黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2015 10222035), 黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541783), 佳木斯大學交叉學科類科學研究項目(JC2014-005)和佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新重點項目(LZR2015_021)對本課題的支持。

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Teaching research on modern nuclear magnetic resonance technique.

Lü Yuguang1, Song Di1,Yu Lili2, Wang Wei’e1, Wang Chaoxing1, Du Mengyuan1, Du Haoran1, Gao Hongbing1, Shi Chunhui3

(1.CollegeofPharmacy,JiamusiUniversity.Jiamusi154007,China;2.InternationalEducationInstitute,JiamusiUniversity.Jiamusi154007,China;3.ClinicalMedicalSchool,JiamusiUniversity.Jiamusi154002,China)

This paper described the purpose of teaching research on modern nuclear magnetic resonance technique and proposed the improving methods.

nuclear magnetic resonance technique; teaching research; analysis and detection; application research

黑龍江省教育科學研究“十二五”規(guī)劃重點課題(GBB1212070)； 佳木斯大學校長創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金(xzyf2014-18)；佳木斯大學教育科研項目 (JKA2014-042)。

呂玉光, 博士, 教授, 主要研究方向藥物分析和光譜分析，E-mail: yuguanglv@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.013

2015-10-18