段先哲　李　南*　譚凱旋　謝焱石　陳　亮　胡　楊　馮志剛　韓世禮　馬　強(qiáng)

(1. 南華大學(xué)，衡陽(yáng) 421001; 2. 湖南省核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽(yáng) 421001)

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正相高效液相色譜法測(cè)定L-蘋果酸中的對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸

段先哲1,2李南1,2*譚凱旋1謝焱石1陳亮1胡楊1馮志剛1韓世禮1馬強(qiáng)1

(1. 南華大學(xué)，衡陽(yáng) 421001; 2. 湖南省核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽(yáng) 421001)

建立了測(cè)定L-蘋果酸中對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸的的正相高效液相色譜檢測(cè)方法。色譜柱為手性色譜柱CHIRALPAK-IC(4.6×250mm；5μm)，流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速為0.5mL/min，進(jìn)樣量為100μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為35℃。系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中L-蘋果酸和D-蘋果酸的理論塔板數(shù)大于5000，L-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.9。此方法檢測(cè)L-蘋果酸中的D-蘋果酸敏度高，分離度良好。溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定D-蘋果酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.78%，溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度實(shí)驗(yàn)中6次重復(fù)進(jìn)樣D-蘋果酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.59%，精密度良好。L-蘋果酸的檢出限為0.22ng。該方法可用于分離L-蘋果酸及其對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸。

L-蘋果酸對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸正相高效液相色譜法

蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，有兩種對(duì)映異構(gòu)體，即D-蘋果酸和L-蘋果酸。大自然中，蘋果酸以3種形式存在，即D-蘋果酸、L-蘋果酸及其混合物DL-蘋果酸。L-蘋果酸會(huì)在人體中自然產(chǎn)生并具有生物活性，是人體一種必須的有機(jī)酸，作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中；D-蘋果酸的生理活性低，生物體內(nèi)積累過量的 D-蘋果酸時(shí)會(huì)產(chǎn)生病變[1]；美國(guó)糧食和藥物管理局(FDA)規(guī)定DL-蘋果酸不能用于嬰兒食品添加劑[2]。在醫(yī)藥行業(yè)，蘋果酸常作為一種藥物成分添加在一些藥物制劑中，能明顯提高藥物主要成分的吸收率；蘋果酸還可以治療肝病、貧血、免疫力低下等多種疾病；在藥物研究中蘋果酸作為一種藥物成分，就必須嚴(yán)格控制其本身帶來(lái)的其它雜質(zhì)，必須嚴(yán)格控制D-蘋果酸的限度，所以對(duì)L-蘋果酸及其中的D-蘋果酸的測(cè)定方法的研究具有重大意義。目前國(guó)內(nèi)對(duì)蘋果酸含量測(cè)定的方法有酶法[2]、生物傳感器法[3]、雙波長(zhǎng)分光光度法[4]、離子色譜法[5-8]、氣相色譜法[9，10]、毛細(xì)管電泳法[11，12]和高效液相色譜法[13-22]等方法。酶法雖操作簡(jiǎn)易，但由于催化反應(yīng)的酶本身特異性不高，易于催化其它底物，使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大誤差。生物傳感器法，需要制作兩種電極，并且需要分別測(cè)定D-蘋果酸和L-蘋果酸，操作比較繁瑣。其它方法對(duì)蘋果酸的測(cè)定都只是針對(duì)D-蘋果酸和L-蘋果酸混合物的含量測(cè)定，并不能有效區(qū)分這兩種異構(gòu)體。而本研究通過采用手性色譜柱CHIRALPAK-IC和對(duì)分析方法的優(yōu)化所建立的正相高效液相色譜法，是一種分離并測(cè)定L-蘋果酸及其對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸的準(zhǔn)確、靈敏、高效、便捷的方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

島津HPLC-2010C ；CPA225D型電子天平(賽多利斯)。

L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；DL-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)； L-蘋果酸原料(中照力德化工有限公司；含量：99.31%)。

1.2色譜條件

色譜柱CHIRALPAK-IC (4.6×250mm；5μm)；進(jìn)樣量100μL ； 測(cè)定波長(zhǎng)210nm ；柱溫：35oC；流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1；流速0.5mL/min。

1.3溶液的配制

稱取一定量的DL-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品加流動(dòng)相配制成濃度為1mg/mL的DL-蘋果酸溶液；稱取一定量的L-蘋果酸原料加流動(dòng)相配制成濃度為1mg/mL的L-蘋果酸供試溶液；取L-蘋果酸供試溶液用流動(dòng)相稀釋100倍，得到其1%自身對(duì)照溶液。D-蘋果酸含量按照1%自身對(duì)照計(jì)算，其計(jì)算公式為：D-蘋果酸含量(%)=A1/A2(注：A1為供試液中D-蘋果酸峰面積，A2為1%自身對(duì)照溶液中L-蘋果酸峰面積)。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用紫外分光光度計(jì)對(duì)L-蘋果酸溶液和DL-蘋果酸溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為210nm，所以確定檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

2.2色譜條件的優(yōu)化

取上述DL-蘋果酸溶液按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比了各條件下D-蘋果酸和L-蘋果酸的保留時(shí)間和分離情況，見表1。流速變化測(cè)定結(jié)果比較表明，流速越高，D-蘋果酸和L-蘋果酸保留時(shí)間越短，色譜柱壓力越大，在流速為1.0mL/min時(shí)色譜柱壓力為3.4MPa，其值較高，所以為了延長(zhǎng)色譜柱的壽命，選擇流速為0.5mL/min。通過調(diào)整流動(dòng)相三相的比例得知，異丙醇濃度越大，保留時(shí)間越短，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度越小，當(dāng)流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=90∶10∶0.1時(shí)，保留時(shí)間太長(zhǎng)；當(dāng)流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=70∶30∶0.1時(shí)，保留時(shí)間太短，D-蘋果酸和L-蘋果酸的出峰時(shí)間間隔太短，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6；當(dāng)流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1時(shí)，保留時(shí)間合適， D-蘋果酸峰無(wú)雜質(zhì)干擾，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為3.2，分離度良好；取L-蘋果酸供試液進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量50μL和100μL對(duì)比結(jié)果顯示，100μL時(shí)，D-蘋果酸峰高比較合適。所以最終確定的色譜條件：進(jìn)樣量100uL， 測(cè)定波長(zhǎng)210nm，柱溫35℃，流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速0.5mL/min。

表1　色譜條件的優(yōu)化

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取空白溶劑、L-蘋果酸供試溶液在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，空白溶劑對(duì)樣品測(cè)定不產(chǎn)生干擾，L-蘋果酸的保留時(shí)間為11.90min，D-蘋果酸的保留時(shí)間為13.52min， L-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.9，理論塔板數(shù)大于5000，此方法檢測(cè)L-蘋果酸中的D-蘋果酸敏度高，分離度良好。

表2　方法的系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.4溶液穩(wěn)定性

配制1mg/mL L-蘋果酸供試溶液、1%自身對(duì)照溶液，按照上述色譜方法分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h進(jìn)樣，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定D-蘋果酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.78%，溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

表3　溶液穩(wěn)定性結(jié)果

注：A為峰面積

2.5精密度

配制1mg/mL L-蘋果酸供試溶液、1%自身對(duì)照溶液，按照上述色譜方法重復(fù)進(jìn)樣6針，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，6次重復(fù)進(jìn)樣D-蘋果酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.59%，精密度良好。

表4　精密度結(jié)果

注：A為峰面積

2.6方法的檢出限

配制1mg/mL的L-蘋果酸供試溶液，按照上述色譜方法，不斷的稀釋進(jìn)樣，當(dāng)信噪比S/N為3時(shí)，即為L(zhǎng)-蘋果酸的檢出限，經(jīng)計(jì)算得出檢出限為0.22ng。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單有效的測(cè)定L-蘋果酸中的其對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明此方法檢測(cè)L-蘋果酸中的D-蘋果酸靈敏度高，分離度良好。溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，在24小時(shí)內(nèi)測(cè)定D-蘋果酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.78，溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度實(shí)驗(yàn)中6次重復(fù)進(jìn)樣D-蘋果酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.59，精密度良好。L-蘋果酸的檢出限為0.22ng。該方法簡(jiǎn)便、快速、有效、靈敏、具有良好的精密度，可作為L(zhǎng)-蘋果酸中的對(duì)映異構(gòu)體D-蘋果酸的定量分析方法。

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Determination of enantiomer D-malic acid in L-malic acid by normal-phase high performance liquid chromatography.

Duan Xianzhe1,2, Li Nan1, 2*, Tan Kaixuan1, Xie Yanshi1, Chen Liang1, Hu Yang1, Feng Zhigang1,Han Shili1, Ma Qiang1

(1.UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China; 2.CooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment,Hengyang421001,China)

The chromatographic column was CHIRALPAK-IC ( 4.6×250mm；5um)；the mobie phase was N-hexane∶isopropyl alcohol∶trifluoroacetic acid (80:20:0.1), the flow rate was 0.5ml/min, the injection volume was 100μL, the detection wavelength was at 210 nm, and the column temperature was 35℃. In the suitability experiment, the theoretical plate number of L-malic and D-malic acids were more than 5000, the resolution between L-malic acid and its adjacent peak was 2.6, and the resolution between D-malic acid and its adjacent peak was 2.9, indicating that this method had a high sensitivity and good resolution. In the solution stability experiment, the relative standard deviation of D-malic acid concentration was 5.78% within 24 hours, demonstrating that the solution was stable within 24 hours. In the precision experiment, the relative standard deviation of the D-malic acid concentrations in six repeated sampling was 3.59%, showing a satisfactory precision of this method. The detection limit of L-malic acid was 0.22ng. This method could be used for quantitative determination of D-malic acid in the L-malic acid.

L-malic acid; enantiomer; D-malic acid; high performance liquid chromatography

國(guó)家自然科學(xué)基金(41503016)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(15B201)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M582334)；南華大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2014XQD08)；國(guó)防基礎(chǔ)科研計(jì)劃項(xiàng)目(B3720110004)；南華大學(xué)“蒸湘學(xué)者計(jì)劃”。

段先哲，男，1985年出生，博士，主要從事地球化學(xué)、儀器分析等方面的研究工作。

李南，女，1985年出生，碩士，主要從事分析化學(xué)、儀器分析等方面的研究工作，E-mail：linan19851018@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.006