霍山石斛組培苗移栽馴化過程中葉抗氧化酶活性、超微結(jié)構(gòu)及4種有效成分的變化1)

楊靜 方炎明 周則剛 王紀(jì)

(南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué))，南京,210037) (南京審計(jì)大學(xué)) (南京曉莊學(xué)院)

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霍山石斛組培苗移栽馴化過程中葉抗氧化酶活性、超微結(jié)構(gòu)及4種有效成分的變化1)

楊靜 方炎明 周則剛 王紀(jì)

(南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué))，南京,210037) (南京審計(jì)大學(xué)) (南京曉莊學(xué)院)

通過對(duì)霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)組培苗在移栽馴化過程中(0、10、30、60 d)葉的抗氧化酶活性、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及有效成分積累等特征指標(biāo)的變化研究，闡明了其移栽馴化過程中的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。結(jié)果表明：霍山石斛苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性在移栽前期均先降后升，移栽后60 d，POD的活性繼續(xù)微升，SOD、CAT活性則微降；移栽前，葉細(xì)胞內(nèi)含物不豐富，葉綠體長橢圓形，片層結(jié)構(gòu)發(fā)育不完善，移栽后10 d，細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示有所損壞，葉綠體多變?yōu)槎虣E圓形，線粒體增多，后期，葉綠體形狀趨于豐滿且結(jié)構(gòu)更加完善，基質(zhì)片層和基粒片層逐漸完整清晰，淀粉粒、嗜鋨顆粒增多，線粒體增多；葉片總蛋白、總氨基酸、多糖以及總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在前期均累積不多，后期漲幅增大，總體呈上升趨勢(shì)，移栽后60 d以上各質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比移栽前增長20.69%、25.93%、11.51%、44.44%。移栽后各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)生適應(yīng)性變化，并且后期良性發(fā)展，從而也表明了移栽條件的合適設(shè)置。

霍山石斛;組培苗;移栽;抗氧化酶;有效成分;超微結(jié)構(gòu)

To explore the adaptation ofDendrobiumhuoshanensetissue culture seedlings to field environment, we studied the changes in antioxidant enzymes activity, ultrastructure and some active components of leaves fromD.huoshanensetissue culture seedlings in the course of transplant acclimation, including 0, 10, 30 and 60 d after transplantation. The activities of SOD, POD and CAT were decreased in early stage then increased, and decreased gently after 60 d except for POD. Features for leaves cells of tissue culture seedlings were less containing, long oval chloroplasts with imperfect lamellar structure. Then after transplantation for 10 d, some cells became bad with more mitochondria and short oval chloroplasts. After 30 d, better chloroplasts together with more starch grains and osmiophilic granules were found. While leaves cells were characterized by richer contents, perfect chloroplasts with good lamellar structure and more mitochondria. Contents of protein, total amino acids, polysaccharide and total alkaloids all showed an upward trend generally, and after 60 d their growth rates were 20.69%, 25.93%, 11.51% and 44.44%, respectively, comparing with tube seedlings. Antioxidant enzymes activity, active components and ultrastructure of leaves changed adaptively and developed well, and the new environment were suitable.

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)，主產(chǎn)于安徽霍山，蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)，是藥用石斛中的珍品，主要活性成分為多糖和生物堿等，具有滋陰、益胃、潤肺止咳、增強(qiáng)免疫活性的優(yōu)良品質(zhì)[1]。而因其種子繁殖能力低，生長周期長，加之歷史上的過度采挖利用以及原生境的破壞，野生資源瀕臨枯竭[2]。供需關(guān)系的嚴(yán)重失衡，推動(dòng)霍山石斛人工培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，而當(dāng)前栽培主要采用組培苗脫瓶移栽的方式。

國內(nèi)外專家學(xué)者在霍山石斛快繁、遺傳育種等方面做了大量研究[3-10]，但組培苗移栽成活率極低，規(guī)?；耘嘁廊皇瞧款i問題，組培苗對(duì)移栽條件能否適應(yīng)是關(guān)鍵[6,8-10]。本試驗(yàn)主要研究霍山石斛組培苗移栽過程中葉抗氧化酶活性、超微結(jié)構(gòu)及所含多糖、生物堿等有效成分的變化，一方面通過葉的生長發(fā)育進(jìn)一步在一定程度上反映植株對(duì)移栽環(huán)境的適應(yīng)狀況，以深入探討組培苗移栽的生理基礎(chǔ)；同時(shí)通過幾種主要有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化，了解霍山石斛移栽苗葉的藥用價(jià)值，探索石斛除莖以外的可入藥部位，為充分開發(fā)、利用石斛藥用資源提供可行的理論支撐。

1 材料與方法

霍山石斛組培苗取自南京林業(yè)大學(xué)植物組培室，先將完整植株與容器一起轉(zhuǎn)移到半遮陰的自然環(huán)境中鍛煉5 d，打開容器口噴灑少量自來水，保持2 d，之后進(jìn)行移栽，移栽馴化基質(zhì)主要為m(腐樹皮)∶m(蘭花石)=2∶1，濕度控制在65%左右，每隔1周噴1次600倍的多菌靈溶液。分別在移栽0(即移栽前)、10、30、60 d對(duì)植株葉片進(jìn)行抗氧化酶活性、超微結(jié)構(gòu)及4種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定：采集不同移栽時(shí)間植株頂端前兩片葉，冰盒保存?zhèn)溆?。稱取葉片1.0 g，用pH值7.0的0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液冰浴研磨，提取液經(jīng)冷凍離心，上清液用于SOD、POD、CAT活性的測(cè)定，3個(gè)重復(fù)，參照張志良等[11]的方法。

葉片超微結(jié)構(gòu)觀察：選擇植株頂端前3片葉，各切取中部長×寬約1 mm×3 mm的材料3片，去主脈，迅速放入4%戊二醛進(jìn)行前固定，10 h后用pH值7.2的0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液清洗3次，再用1%鋨酸后固定，至樣品黑透，pH值7.2的0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液清洗3次，丙酮梯度脫水，Epon812包埋劑與純丙酮按比例逐級(jí)滲透，然后進(jìn)行包埋，聚合設(shè)置為35 ℃12 h—45 ℃12 h—60 ℃12 h，固化后的包埋塊在美國RMC超薄切片機(jī)上進(jìn)行切片(50 nm厚度)，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染液雙染色，使用日本電子JEM1400型透射電子顯微鏡觀察并拍照保存。

蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：取植株頂端前3片葉。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照國標(biāo)《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》(GB 5009.5-2010)[12]，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照國標(biāo)《食品中氨基酸的測(cè)定》(GB/T 5009.124-2003)[13]，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定借鑒黃曉君等[14]的方法，總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用陳乃東等[15]的方法。

數(shù)據(jù)處理：利用Excel 2007和SPSS Statistics 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 移栽馴化過程中葉片抗氧化酶活性的變化

SOD、POD、CAT等構(gòu)成生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶系統(tǒng)，是生物防御體系的關(guān)鍵酶，通常作為生物逆境反應(yīng)機(jī)理研究的重要指標(biāo)?；羯绞嚬苊珉S著移栽時(shí)間的延長葉片保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性的變化趨勢(shì)見表1。由表1中數(shù)據(jù)可知，葉片SOD、POD、CAT活性的變化較為一致，移栽后10d，均顯示下降，表明移栽初期試管苗對(duì)環(huán)境的極度不適應(yīng)，致使抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞，細(xì)胞代謝受到影響，而在30d酶活性顯著提高，防御系統(tǒng)啟動(dòng)，清除有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成的傷害并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，到60d，SOD、CAT活性分別降低0.04%和12.94%，但仍高于移栽前水平，而POD活性則稍微上升，由18.80 U·g-1·min-1增至18.85 U·g-1·min-1。結(jié)合移栽苗的生長狀況以及其他指標(biāo)的變化來看，后期SOD、POD活性略微下降并非由葉抗氧化系統(tǒng)的損壞造成，反而表明移栽苗抗逆能力在增強(qiáng)，酶活性趨于穩(wěn)定，已逐步適應(yīng)了新的生活環(huán)境。

2.2 移栽馴化過程中葉片超微結(jié)構(gòu)的變化

取樣的植株生長狀況如表2，整體顯示出移栽前期，植株生長受到影響，葉面積變化不明顯，葉出現(xiàn)失綠，但30 d后，葉生長得到改善，60 d后已基本適應(yīng)并且生長受到促進(jìn)，葉面積顯著增大，葉色濃綠。葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化在一定程度上能夠體現(xiàn)植物生長發(fā)育的狀況。移栽前的霍山石斛組培苗，葉色翠綠(表2)，但葉肉細(xì)胞內(nèi)容并不豐富，葉綠體、細(xì)胞核緊貼細(xì)胞壁排列，核仁清晰，葉綠體呈細(xì)長橢圓形，分布有少許淀粉粒和嗜鋨顆粒，片層結(jié)構(gòu)不明顯(圖1 A、B)。移栽10 d，由于對(duì)新環(huán)境的不適應(yīng)，葉綠體多變?yōu)槎虣E圓形(圖1 C、D)，片層可見但數(shù)量很少，部分葉綠體受到破壞，結(jié)構(gòu)變得不完整(圖1 C，箭頭所指)，細(xì)胞內(nèi)還出現(xiàn)一些黑色物質(zhì)沉積，推測(cè)可能是葉綠體或者其他細(xì)胞器的降解物質(zhì)(圖1 D，箭頭所指)，葉綠體旁邊開始明顯出現(xiàn)線粒體(圖1 D)。移栽30 d，葉綠體數(shù)目增多，形狀趨于豐滿，可見片層結(jié)構(gòu)但不清晰，少數(shù)葉綠體膨脹成近圓形(圖1 E、F)，出現(xiàn)淀粉粒(圖1 E)，嗜鋨顆粒明顯增加(圖1 F)。移栽60 d以后，葉肉細(xì)胞內(nèi)容物明顯豐富(圖1 G、H)，葉綠體結(jié)構(gòu)更加完善，形態(tài)飽滿，面向中央液泡的一面較為凸起，此變化利于細(xì)胞的氣體交換，基質(zhì)片層和基粒片層增多、排列趨向緊密(圖1 G、H)，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，數(shù)量增多，體積略微增大。葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示出細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝基礎(chǔ)的逐漸增強(qiáng)。

2.3 移栽馴化過程中葉片4種有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

中草藥含有的具有一定生物活性、能代表其功效的化學(xué)成分通常稱為有效成分。本試驗(yàn)對(duì)霍山石斛試管苗移栽過程中葉片有效成分如總蛋白、總氨基酸、多糖和總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1。隨著移栽時(shí)間的延長，葉片的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在逐漸增多，移栽10 d僅增加0.08 mg·g-1，后期增幅不斷加大，移栽60 d的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3.15 mg·g-1，比移栽前(0 d)增長20.69%；總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在移栽10 d時(shí)略微上漲，在30 d漲幅增大，比10d時(shí)增長8.51%，60 d顯著增多，比移栽前增長25.93%，每個(gè)移栽階段，葉片中均含較多的天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，并且由表3可見，隨著移栽時(shí)間的延長，5種主要氨基酸都總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中Asp、Glu增幅較大；多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直在平緩上漲，移栽60 d的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是移栽前的1.12倍，增長11.51%；總生物堿前30 d緩慢增加，移栽60 d質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇上升， 是移栽30 d的1.30倍，比移栽馴化前增長44.44%。4種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，前期由于對(duì)新環(huán)境的不適應(yīng)而增長緩慢，后期普遍漲幅較大，首先說明了移栽苗順利成活，其次表明對(duì)新環(huán)境的逐步適應(yīng)，并已具備生產(chǎn)物質(zhì)并有效積累的能力。

A、B.移栽0 d；C、D.移栽10 d；E、F.移栽30 d；G、H.移栽60 d;Chl.葉綠體;ChM.葉綠體質(zhì)膜;CW.細(xì)胞壁;GL.基粒片層;M.線粒體;N.細(xì)胞核;Ne.核仁;OG嗜鋨顆粒;Sg.淀粉粒;SL.基質(zhì)片層;V.液泡。

圖1 霍山石斛組培苗移栽馴化過程中葉片超微結(jié)構(gòu)的變化

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

表2 霍山石斛移栽苗葉的生長狀況

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)將霍山石斛組培苗移栽后，葉片抗氧化酶活性呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性先下降后顯著提高，而移栽60 d時(shí)，SOD、CAT活性又略微降低。SOD、POD、CAT等抗氧化酶類具有維持活性氧自由基產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡，保護(hù)生物機(jī)體免受傷害，延緩細(xì)胞衰老等重要作用，其活性的變化能夠反映出生物體對(duì)不良條件的適應(yīng)與否。裴斌等[16]研究認(rèn)為，水分脅迫程度相對(duì)較輕時(shí)，沙棘(Hippophaerhamnoides)葉片的SOD、POD 和CAT活性顯著升高，自由基清除能力增強(qiáng)，從而起到保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用，但當(dāng)嚴(yán)重脅迫時(shí)，抗氧化酶活性發(fā)生明顯下降。何潔等[17]研究重金屬對(duì)翅堿蓬(Salineseepweed)抗氧化酶系統(tǒng)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)<100 mg·kg-1時(shí)，植物體內(nèi)SOD、POD、CAT 活性均升高，Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥200 mg·kg-1時(shí)，SOD、POD和CAT活性減弱。本試驗(yàn)中移栽前期，苗從養(yǎng)分、水分以及溫、濕度均適宜的環(huán)境突然轉(zhuǎn)入自然環(huán)境，體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的平衡被打破，自由基在體內(nèi)大量積累，造成膜脂過氧化作用加劇，抗氧化系統(tǒng)暫時(shí)遭到損壞。自由基積累過多，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能破壞，損害細(xì)胞代謝，進(jìn)而降低植物葉片的光合能力[18]，所以移栽前期，葉相應(yīng)表現(xiàn)出發(fā)育不良，隨著植株對(duì)新環(huán)境的逐步適應(yīng)，抗氧化系統(tǒng)活性提高，在抵抗氧化脅迫和消除自由基損傷時(shí)開始有效地發(fā)揮作用，保證了細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行，長勢(shì)漸好。移栽60 d，葉SOD、CAT活性出現(xiàn)少許下降，結(jié)合植株當(dāng)時(shí)以及后續(xù)的生長狀況，推測(cè)是移栽苗對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)性應(yīng)答，而并非由于抗氧化系統(tǒng)遭到破壞所致。

表3 移栽過程中葉中5種主要氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

葉是植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著霍山石斛組培苗移栽馴化時(shí)間的延長，葉的生長發(fā)育狀況日趨理想，葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)由破壞嚴(yán)重至逐步恢復(fù)，并且葉綠體逐漸發(fā)育完善，面向液泡排列，形態(tài)豐滿，嗜鋨顆粒增多。文獻(xiàn)報(bào)道植株對(duì)周圍環(huán)境因子的變化響應(yīng)也會(huì)明顯體現(xiàn)在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上[19]，葉綠體是植物進(jìn)行光合的重要場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)的變化會(huì)直接影響葉的光合功能[20]，當(dāng)葉綠體具備了完整的片層結(jié)構(gòu)，能夠保證最大的光合作用面積，使光反應(yīng)及有關(guān)光合作用電子傳遞高效進(jìn)行[21-22]，并且葉綠體由緊靠細(xì)胞壁、一面凸起的狹長型變?yōu)槊嫦蛑醒胍号荨⒁幻嫱蛊鸬呢S滿型，這種變化有利于與外界進(jìn)行有效的氣體交換[23]，濮曉珍等[24]在研究鐵皮石斛移栽馴化時(shí)也有類似的發(fā)現(xiàn)。同時(shí)報(bào)道認(rèn)為嗜鋨小體的產(chǎn)生可提高細(xì)胞質(zhì)濃度、降低滲透勢(shì)、保證水分和無機(jī)鹽類營養(yǎng)的吸收[25]。所以移栽后期葉面積明顯增大，葉色濃綠，長勢(shì)較好。葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的系列變化與葉的表觀生長相呼應(yīng)，由此可見，二者相結(jié)合一定程度上可反映植株對(duì)新環(huán)境的響應(yīng)情況。

中草藥的有效成分主要包括蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、生物堿、微量元素、菲類化合物等。本試驗(yàn)對(duì)霍山石斛移栽苗葉中一些有效成分，如總蛋白、總氨基酸、多糖、總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行跟蹤測(cè)定，結(jié)果表明，移栽后期由于植株對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)，各種代謝恢復(fù)正常甚至受到促進(jìn)，葉片逐漸積累較多物質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)含有的氨基酸主要為天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，而鐵皮石斛也主要含有這5種氨基酸[26]，因此，它們與石斛藥效價(jià)值的關(guān)系值得深入探討。植物多糖和生物堿因在抗腫瘤、提高機(jī)體免疫、抗衰老、抗輻射等方面的顯著療效而日益受到關(guān)注[27-29]，研究認(rèn)為，多糖和生物堿是石斛主要的活性成分，這兩大功能化合物關(guān)系著石斛的品質(zhì)和藥效[28,30-32]，并且含有生物堿種類豐富，如石斛堿、石斛次堿、石斛胺等，其各部位分布規(guī)律由大到小的順序?yàn)槿~、成熟莖≈根[33]。結(jié)合本試驗(yàn)對(duì)霍山石斛葉內(nèi)4種有效成分的測(cè)得數(shù)據(jù)，推測(cè)葉的藥用價(jià)值或許值得開發(fā)，如若得到利用將能緩解霍山石斛供需嚴(yán)重不平衡的局面。

通過對(duì)霍山石斛葉的抗氧化酶活性、超微結(jié)構(gòu)以及4種有效成分積累的變化研究，發(fā)現(xiàn)設(shè)置的移栽條件不僅能夠保證組培苗的順利成活并且對(duì)其生長發(fā)育有著良好的促進(jìn)作用。希望結(jié)合筆者系列研究的其他成果，能為霍山石斛組培苗的規(guī)?；耘嗉叭晁幱脙r(jià)值研究提供有效的科學(xué)參考。

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Changes in Antioxidant Enzymes Activity, Ultrastructure and Four Kinds of Active Components of Leaves fromDendrobiumhuoshanenseTissue Culture Seedlings during Transplantation//

Yang Jing, Fang Yanming; Zhou Zegang

(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China)(Nanjing Audit University); Wang Ji(Nanjing Xiaozhuang University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：69-73.

Dendrobiumhuoshanense; Transplantation; Tissue culture seedlings; Antioxidant enzymes; Active components; Ultrastructure

1)江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目(lysx[2013]07)、國家自然科學(xué)基金(31200233)。

楊靜，女，1980年8月生，南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué))、南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院、南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測(cè)試中心，博士研究生。E-mail:yjnjfu@126.com。

方炎明，南方現(xiàn)代林業(yè)創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué))、南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，教授 。E-mail:jwu4@njfu.com.cn。

2016年3月2日。

Q945.51

責(zé)任編輯：任 俐。