嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、免疫力和抗病力的影響

劉 迪，董曉慧，譚北平，楊奇慧，遲淑艷，劉泓宇，章 雙

( 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料試驗(yàn)室，廣東 湛江 524088 )

嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、免疫力和抗病力的影響

劉 迪，董曉慧，譚北平，楊奇慧，遲淑艷，劉泓宇，章 雙

( 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料試驗(yàn)室，廣東 湛江 524088 )

水溫(29±3) ℃下，給體質(zhì)量約0.5 g的凡納濱對(duì)蝦投喂在基礎(chǔ)飼料中分別添加0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、1.00%的嗜酸乳桿菌的7種飼料8周。試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的存活率無顯著影響(P>0.05)，而添加嗜酸乳桿菌組的凡納濱對(duì)蝦體質(zhì)量增加率均高于對(duì)照組，0.10%組的質(zhì)量增加率顯著高于對(duì)照組，飼料系數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。0.05%、0.10%、0.20%、0.30%組凡納濱對(duì)蝦的血清超氧化物歧化酶活力高于對(duì)照組，0.10%組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各試驗(yàn)組之間過氧化氫酶活力差異顯著(P<0.05)，當(dāng)嗜酸乳桿菌添加量為0.20%時(shí)活力最高。除1.00%添加組外，其他組酚氧化酶活力均高于對(duì)照組，當(dāng)添加量為0.05%時(shí)活力明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，各處理96 h對(duì)蝦存活率無顯著差異(P>0.05)，但嗜酸乳桿菌添加組對(duì)蝦存活率皆高于對(duì)照組，表明添加嗜酸乳桿菌在一定程度上可以提高凡納濱對(duì)蝦的抗病力。

嗜酸乳桿菌；凡納濱對(duì)蝦；生長；免疫力；抗病力

凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeusvannamei)是我國重要的養(yǎng)殖蝦類，近年來養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展快速，病害頻發(fā)。人們大量使用抗生素來預(yù)防和治療蝦病，這不僅造成污染，甚至?xí)：θ祟惤】?。為確保對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，尋找合適的環(huán)保抗生素替代品成了目前的研究熱點(diǎn)[1]。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)是革蘭氏陽性益生菌[2]，可調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡[3]，促進(jìn)腸胃消化，釋放乳酸等次級(jí)代謝產(chǎn)物，抑制腸道致病菌[4]，提高機(jī)體的抗病力。雖然有關(guān)嗜酸乳桿菌的研究頗多，但不同含量的嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、免疫力和抗病力影響的研究卻很少。本研究在對(duì)蝦飼料中加入不同水平的嗜酸乳桿菌，探究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、免疫力和抗病力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)蝦苗購于湛江粵海水產(chǎn)種苗有限公司，試驗(yàn)嗜酸乳桿菌(優(yōu)貝寶)由大慶仕合源乳業(yè)有限公司提供，攻毒所用哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)飼料以魚粉、豆粕為主要蛋白源，以魚油、大豆油、卵磷脂為脂肪源，基礎(chǔ)飼料配方見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、1.00%的嗜酸乳桿菌，配制成7種飼料。飼料原料粉碎后過80目篩網(wǎng)(0.18 mm)，各常用原料按飼料配方準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，在V型立式混合機(jī)混合10 min，微量添加成分以面粉為載體逐級(jí)擴(kuò)大混勻，然后加入V型立式混合機(jī)與原料再充分混勻10 min，再加入預(yù)先混合好的魚油、大豆油和大豆磷脂油。將油脂微小顆粒搓散直至可順利通過60目篩網(wǎng)(0.25 mm)，將搓好的原料放入攪拌機(jī)中，在攪拌過程中加入氯化膽堿和適量的水，攪拌均勻后用雙螺桿擠條機(jī)加工成1 mm和1.5 mm兩種規(guī)格的飼料，60 ℃熟化30 min，風(fēng)干后用封口袋分裝，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

投喂試驗(yàn)在湛江東海島廣東海洋大學(xué)海洋生物研究基地進(jìn)行。試驗(yàn)前蝦苗在室外水泥池暫養(yǎng)30 d，待體質(zhì)量約0.5 g時(shí)，挑選規(guī)格一致、體格健壯的蝦苗分為7個(gè)處理組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)一個(gè)0.3 m3的玻璃鋼桶，每桶放40尾蝦，養(yǎng)殖8周。 試驗(yàn)開始后2周內(nèi)若有蝦死亡，及時(shí)將其撈出稱質(zhì)量，并補(bǔ)回同樣體質(zhì)量的蝦；2周后若有試驗(yàn)蝦死亡，撈出稱量質(zhì)量，記錄。試驗(yàn)期間日投喂4次(7:00、11:00、17:00和21:00)，投喂量為蝦體質(zhì)量的8%～10%，并根據(jù)攝食、天氣等適當(dāng)調(diào)整。投喂1 h后觀察對(duì)蝦攝食情況，試驗(yàn)初期每?jī)商鞊Q水2/3，養(yǎng)殖結(jié)束前10 d每天換水1/2。試驗(yàn)期間鹽度27±2，水溫(29±3) ℃，溶解氧>7.0 mg/L，氨氮含量<0.03 mg/L。

表1 試驗(yàn)飼料的組成與營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

a:每千克維生素預(yù)混料含有:VA 10 g,VD350 g,VE 99 g,VK 5.0 g,VB125.50 g,VB225 g,VB650 g,VB120.1 g,泛酸鈣 61 g,煙酸101 g,生物素25 g,肌醇 153.06 g,葉酸6.25 g,纖維素389.09 g.

b:每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有:KIO40.03 g,CoCl2·6H2O 4.07 g,CuSO4·5H2O 19.84 g,檸檬酸鐵 13.71 g,ZnSO4·7H2O 28.28 g,MgSO4·7H2O 0.12 g,CaH2PO480 g,MnSO4·H2O 12.43 g,KCl 15.33 g,Na2SeO32 g,沸石粉824.19 g.

1.3 樣品采集與測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)停喂24 h后，每桶對(duì)蝦稱量質(zhì)量并記錄尾數(shù)。每桶隨機(jī)取5尾蝦，于-20 ℃冰箱中保存，用于分析體成分。另從每桶中隨機(jī)抽取15尾蝦，用 1 mL 無菌注射器自第五步足基部血竇抽血。將血液注入1.5 mL的離心管后，迅速置于盛有碎冰的冰盒中，采樣結(jié)束后于冰箱4 ℃放置過夜，次日8000 r/min 離心10 min，上清液-80 ℃下保存，用于測(cè)定酶活力。從每個(gè)處理組隨機(jī)取10尾蝦，用密度為1.27×106cfu/mL的哈維氏弧菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。通過專用注射器于對(duì)蝦第二腹節(jié)背部注射，注射后觀察對(duì)蝦96 h的存活狀況。

按下式計(jì)算：

存活率/%=(n2/n1)×100%

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

飼料系數(shù)=m3/(m2-m1)

蛋白質(zhì)效率/%=(m2-m1)/(m3×P)×100%

特定生長率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

式中，n2為試驗(yàn)終末對(duì)蝦數(shù)量(尾)，n1為試驗(yàn)初始對(duì)蝦數(shù)量(尾)；m1、m2分別為初始和終末對(duì)蝦平均體質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；m3為攝入的飼料干質(zhì)量(g)；P為飼料蛋白質(zhì)含量(%)。

試驗(yàn)飼料以及全蝦中水分、粗脂肪、粗蛋白、粗灰分含量按照國標(biāo)GB 5009.3-2010、GB/T 6433-2006、GB/T 6432-1994、GB/T 6438-2007進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)蝦血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。酚氧化酶、溶菌酶活性送血清樣品至南京建成生物工程研究所檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較法，當(dāng)P<0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響

飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響見表2。表2顯示，嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦的存活率無明顯影響(P>0.05)。0.10%嗜酸乳桿菌組的對(duì)蝦質(zhì)量增加率和特定生長率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他5組的質(zhì)量增加率和特定生長率略高于對(duì)照組，但與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。嗜酸乳桿菌的添加量為0.10%組的對(duì)蝦的飼料系數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而0.40%和1.00%組飼料系數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；0.05%、0.30%處理組對(duì)蝦的蛋白質(zhì)效率與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，0.10%處理組蛋白質(zhì)效率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，0.20%、0.40%、1.00%處理組蛋白質(zhì)效率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響

飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響結(jié)果見表3。表3顯示，各處理組對(duì)蝦的水分、粗蛋白、粗脂肪含量無明顯差異(P>0.05)；嗜酸乳桿菌添加量為0.40%處理組粗灰分含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，其他組與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。

2.3 飼料中嗜酸乳桿菌水平的對(duì)凡納濱蝦血清中相關(guān)酶活力的影響

飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清中相關(guān)酶活力的影響結(jié)果見表4。表4顯示， 超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性隨飼料中嗜酸乳桿菌添加量的增加而先升后降，嗜酸乳桿菌添加量為0.05%～0.30%的試驗(yàn)組過氧化氫酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在添加量為0.20%時(shí)，達(dá)到最高。嗜酸乳桿菌添加量為0.10%時(shí)，超氧化物歧化酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余各組間無顯著差異(P> 0.05)；酸性磷酸酶隨著嗜酸乳桿菌添加量的升高而逐漸升高，0.40%和1.00%組酸性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%處理組堿性磷酸酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，1.00%處理組與對(duì)照組無明顯差異；0.05%、0.30%、0.40%處理組酚氧化酶活性明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，其余組間無顯著差異；除1.00%處理組溶菌酶活性與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)外，其余各處理組溶菌酶活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病力的影響。

飼料中嗜乳酸桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病力的影響結(jié)果見表5。表5顯示，各處理組凡納濱對(duì)蝦的存活率無明顯差異(P>0.05)，但嗜乳酸桿菌添加量為0.30%時(shí)存活率最高。

表2 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響

注:同一行中上標(biāo)不同字母的平均值表示組間有顯著性差異(P<0.05).下同.

表3 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響 %

表4 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清酶活力的影響

表5 飼料中嗜酸乳桿菌水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病力的影響 %

3 討 論

3.1 嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響

嗜酸乳桿菌是動(dòng)物飼料中重要的微生態(tài)添加劑，具備良好的耐受性，能夠在動(dòng)物腸道中定殖，改善腸道酸性環(huán)境，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，降低氨等毒性物質(zhì)的積累、平衡腸道菌群、促進(jìn)動(dòng)物生長和提高免疫力、抗病力等[5-7]。 飼喂含乳酸桿菌的飼料28 d，可顯著提高肉仔雞的質(zhì)量增加率[8]。張常明等[9]在飼料中適當(dāng)添加乳酸菌，顯著提高了斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。建鯉(Cyprinuscarpiovar)幼魚的質(zhì)量增加率和攝食量隨飼料中乳酸桿菌水平的增加而顯著提高[10]。Suzer等[11]發(fā)現(xiàn)，黑鯛(Sparusmacrocephlus)幼魚攝食含有乳酸菌的飼料，存活率和質(zhì)量增加率顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加嗜酸乳桿菌可提高凡納濱對(duì)蝦的質(zhì)量增加率、特定生長率，降低飼料系數(shù)，其中添加量為0.10%時(shí)效果最好，這與王國霞等[12]的試驗(yàn)結(jié)果類似。

3.2 嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫力的影響

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶和溶菌酶是反應(yīng)動(dòng)物機(jī)體免疫力和抗病力的重要指標(biāo)。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)氧自由基過多就會(huì)攻擊正常的組織結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜等，使其產(chǎn)生氧化損傷，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞死亡。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶則主要清除體內(nèi)所產(chǎn)生的氧自由基并抑制其生成。它們可以提高機(jī)體抗氧化能力，是評(píng)價(jià)機(jī)體對(duì)外界應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)之一[13-15]。李瑞等[16]灌喂新生仔豬德氏乳桿菌(L.delbrueckii)菌液一段時(shí)間后，仔豬血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性增強(qiáng)，總抗氧化能力顯著高于對(duì)照組。王全溪等[17]在肉雞飼料中添加100 mg/kg乳酸菌時(shí)，血清中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力顯著提高。Lee等[18]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加乳酸菌PL11可顯著提高日本鰻鱺(Anguillajaponica)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力。本試驗(yàn)中，凡納濱對(duì)蝦血清超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力隨飼料中嗜酸乳桿菌含量的增加而先升后降，其原因可能是嗜酸乳桿菌或其代謝產(chǎn)物刺激了凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的非特異性免疫機(jī)制[19]，提升了超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活力，但當(dāng)嗜酸乳桿菌的含量增加時(shí)會(huì)產(chǎn)生過多的有機(jī)酸、雙乙酸、過氧化氫等代謝產(chǎn)物抑制了這兩種酶的活力。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是一類可將對(duì)應(yīng)底物水解去磷酸化的酶類，可以促進(jìn)甲殼動(dòng)物骨骼和幾丁質(zhì)外殼的形成[20]，也是重要的免疫防御體系，具有解毒功能[21]。本試驗(yàn)中，凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的酸性磷酸酶活性隨著嗜酸乳桿菌添加量的升高而逐漸升高，均高于對(duì)照組，堿性磷酸酶則呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。酚氧化酶是酚氧化酶原激活系統(tǒng)的關(guān)鍵物質(zhì)，其主要功能是免疫作用和修復(fù)機(jī)體傷口。酚氧化酶經(jīng)過一系列反應(yīng)產(chǎn)生黑色素抵御外來細(xì)菌、病毒的入侵[22]，直接體現(xiàn)甲殼類動(dòng)物的免疫力和抗病力[23-24]。溶菌酶通過吞噬細(xì)胞來殺滅細(xì)菌而消除體內(nèi)異物，發(fā)揮防御功能[25-26]。Son等[27]等報(bào)道，斜帶石斑魚(Epinephelusspcoioides)攝食加入植物性乳酸菌的飼料時(shí)，血清中溶菌酶活性顯著提高。Giri等[28]在飼料中加入乳酸桿菌VSG3，飼喂60 d后發(fā)現(xiàn)，南亞野鯪(Labeorohita)的血清中溶菌酶活力顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)中，凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的酚氧化酶和溶菌酶活力均有所提高，部分處理組顯著高于對(duì)照組，但達(dá)到最高酶活的嗜酸乳桿菌添加劑量不盡相同，說明適量添加嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的體液免疫也起到了積極作用。

3.3 嗜酸乳桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病力的影響

曾地剛等[29]通過鏈球菌(Streptococcus)攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攝食含有乳酸菌飼料的羅非魚(Oreochromisspp)存活率顯著提高。Rengpipat等[30]發(fā)現(xiàn)，在用含有乳酸菌的飼料飼喂尖吻鱸(Latescalcarifer)一段時(shí)間后，對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的抵抗力提高。本試驗(yàn)中，通過哈維氏弧菌攻毒試驗(yàn)96 h后，雖然發(fā)現(xiàn)各組之間存活率無明顯差異，但添加嗜酸乳桿菌的試驗(yàn)組存活率皆比對(duì)照組高，其原因可能是嗜酸乳桿菌刺激腸黏膜免疫表達(dá)，提高了血清中抗超氧陰離子自由基的含量，使凡納濱對(duì)蝦的抗染病能力增強(qiáng)[31]。其中0.30%添加組存活率最高，與0.30%添加組的酚氧化酶和溶菌酶的活力相對(duì)較高相吻合。

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EffectsofLactobacillusacidophilusonGrowthPerformance,ImmunityandDiseaseResistanceinPacificWhiteLegShrimpLitopenaeusvannamei

LIU Di,DONG Xiaohui,TAN Beiping,YANG Qihui,CHI Shuyan,LIU Hongyu,ZHANG Shuang

( Laboratory of Aquatic Animal Nutrition and Feed,Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China )

Pacific white leg shrimpLitopenaeusvannameiwith body weight of 0.5 g were fed the experimental diets containing 0%,0.05%,0.10%,0.20%,0.30%,0.40% and 1.00% of bacteriumLactobacillusacidophilusat water of (29±3) ℃ for 8 weeks.The results showed that survival rate was not significantly affected by the probiotics (P>0.05).There were higher weight gain in the shrimp fed the diets containingL.acidophilusthan that in the control group,significantly higher in the 0.10% group than that in the control group (P<0.05),with significantly lower food conversion ratio than that in the control group(P<0.05).The shrimp fed the diets containing 0.05%,0.10%,0.20%,and 0.30% of the probiotics had higher activity of superoxide dismutase (SOD) than that in the control group,especially significantly higher in the 0.10% group than that in the control group (P<0.05).The catalase(CAT) activity was found to be significantly different among all groups(P<0.05),the maximal value in 0.20% group.Except for 1% group,the activity of phenoloxidase (PO) was higher in the other groups than that in the control group,significantly higher in 0.05% group than that in the control group (P<0.05).No differences in survival rate were observed in the shrimp injected withVibrioharveyiin 96 h,even though higher in the shrimp fed the diets containingL.acidophilusthan that in the control group,indicating that dietryL.acidophiluscould increase the disease resistance in Pacific white leg shrimp.

Lactobacillusacidophilus;Litopenaeusvannamei; growth; immunity; disease resistance

S968.22

A

1003-1111(2016)01-0037-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.007

2015-09-23；

2015-10-31.

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201003020).

劉迪(1991-)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料.E-mail：liudi_gdou@163.com.通訊作者：董曉慧(1970-)，女，教授；研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料.E-mail：dongxiaohui2003@163.com.