蘇偉鵬,徐 穩(wěn),張 昊,應(yīng)志雄,黃 強(qiáng),何進(jìn)田,張莉莉,王 恬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

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日糧亮氨酸水平與宮內(nèi)發(fā)育遲緩對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化功能的影響

蘇偉鵬,徐 穩(wěn),張 昊,應(yīng)志雄,黃 強(qiáng),何進(jìn)田,張莉莉,王 恬*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

研究日糧亮氨酸水平與宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化功能的影響。挑選16頭正常初生重(NBW)仔豬和16頭IUGR仔豬,公母各半。仔豬于14日齡斷奶,采用2×2因子設(shè)計(jì),一半NBW與IUGR斷奶仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧,剩余斷奶仔豬飼喂添加0.35%亮氨酸的實(shí)驗(yàn)日糧,即4個(gè)處理組,每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1頭仔豬。實(shí)驗(yàn)期為21 d。結(jié)果表明:與NBW斷奶仔豬相比,IUGR斷奶仔豬肝臟總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力顯著降低,丙二醛(MDA)含量顯著升高(p<0.05)。IUGR斷奶仔豬肝臟線(xiàn)粒體錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力、還原型谷胱甘肽(GSH)含量較NBW斷奶仔豬均顯著降低(p<0.05)。另外,IUGR顯著降低斷奶仔豬肝臟核轉(zhuǎn)錄因子2(Nrf2)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GPx1)mRNA表達(dá)量(p<0.05)。日糧添加0.35%亮氨酸可顯著降低斷奶仔豬肝臟MDA含量,顯著提高SOD2 mRNA表達(dá)量(p<0.05)。高亮氨酸水平日糧可顯著緩解IUGR介導(dǎo)斷奶仔豬線(xiàn)粒體GSH含量降低與肝臟SOD2和GPx1 mRNA表達(dá)下調(diào)(p<0.05)。因此,日糧添加0.35%亮氨酸,可降低斷奶仔豬肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度,一定程度緩解了IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化功能的不良影響。

亮氨酸,宮內(nèi)發(fā)育遲緩,斷奶仔豬,肝臟,抗氧化功能

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)是胎兒在母體子宮內(nèi)發(fā)育障礙的總稱(chēng),具體表現(xiàn)為胎兒初生重較低,各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)一定程度的遲緩,遺傳潛力未能得到充分發(fā)揮等[1-2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),IUGR會(huì)導(dǎo)致胎兒成年后發(fā)生代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)升高,如肥胖癥、2型糖尿病與高血壓等[3]。這可能與IUGR損傷后代肝臟功能有關(guān)。肝臟是機(jī)體內(nèi)重要的代謝器官,而諸多研究表明,IUGR可造成肝臟抗氧化功能受損,自由基產(chǎn)生增多,細(xì)胞氧化損傷加劇,最終導(dǎo)致代謝功能紊亂[4-5]。

亮氨酸(leucine,Leu)屬于支鏈氨基酸,是機(jī)體的必需氨基酸之一。近年來(lái),膳食蛋白質(zhì)和某些氨基酸,特別是亮氨酸的臨床應(yīng)用,在膳食干預(yù)代謝性疾病方面已受到廣泛關(guān)注[6]。亮氨酸作為一種新的營(yíng)養(yǎng)信號(hào)分子,在蛋白質(zhì)代謝、能量代謝、提高機(jī)體免疫力等方面具有重要作用[7-8]。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸作為食品添加劑具有潛在的抗氧化作用[9]。Katayama等[10]研究表明,支鏈氨基酸能夠提高抗氧化酶的活力,增強(qiáng)抗氧化能力。Li等[11]發(fā)現(xiàn),1.5%亮氨酸可減少高脂大鼠血清MDA含量,緩解脂質(zhì)過(guò)氧化。

但有關(guān)亮氨酸緩解IUGR后代機(jī)體氧化應(yīng)激方面的報(bào)道較少,特別是在出生后早期這一敏感階段。豬和人在解剖學(xué)、生理學(xué)以及代謝特點(diǎn)方面均有較好的相似性,IUGR豬已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于預(yù)防和治療人類(lèi)IUGR具有重要的參考意義[12]。因此,本研究以IUGR斷奶仔豬為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討亮氨酸對(duì)IUGR斷奶仔豬肝臟抗氧化功能的影響,為改善IUGR新生胎兒肝臟抗氧化功能提供新的方法,同時(shí)為亮氨酸在IUGR后代日常飲食中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-亮氨酸(純度98%) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)分型試劑盒、總蛋白定量測(cè)定(BCA法)試劑盒 南京建成生物工程研究所;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM定量試劑盒 日本TaKaRa生物科技股份有限公司。

勻漿機(jī)(Bio-Gen Series PRO 200) 美國(guó)PRO Scientific公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5804R) 德國(guó)eppendorf公司;數(shù)顯電子恒溫循環(huán)水浴鍋(HH-4) 常州國(guó)華電器有限公司;醫(yī)用低溫保存箱(DW-25L262) 青島海爾特種電器有限公司;-80 ℃超低溫冰箱(8925)，Real-Time PCR儀(QuantStudio?5) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在體況相似、胎次接近、品種相同(長(zhǎng)白×大白)的母豬所產(chǎn)的16窩新生仔豬(杜洛克×長(zhǎng)白×大白)中,每窩各選擇1頭正常初生重(normal birth weight,NBW)仔豬((1.52±0.06) kg)和1頭IUGR仔豬((0.87±0.04) kg),公母各半,分成NBW組和IUGR組。IUGR仔豬的挑選標(biāo)準(zhǔn)參照Xu等[13]的方法,計(jì)算平均初生重以及標(biāo)準(zhǔn)差,將初生重低于該豬場(chǎng)仔豬平均初生重2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的仔豬定為IUGR仔豬。出生后12小時(shí)內(nèi)分別寄養(yǎng)于體況相似、胎次相同的4頭母豬,自然哺乳,母豬日糧滿(mǎn)足NRC(2012)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[14]。所有仔豬于14日齡斷奶,隨后采用2×2因子設(shè)計(jì),一半NBW與IUGR斷奶仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧,剩余的NBW與IUGR斷奶仔豬飼喂添加0.35%亮氨酸的實(shí)驗(yàn)日糧,即4個(gè)處理組,每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1頭仔豬。實(shí)驗(yàn)期為21 d。日糧配制參照NRC(2012)豬的營(yíng)養(yǎng)需要[14],日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)豬飼養(yǎng)在環(huán)境衛(wèi)生良好的豬舍中,實(shí)驗(yàn)豬均單欄飼養(yǎng)(1.0 m×0.6 m),自由采食和飲水。每天清掃和消毒豬舍,豬舍溫度和相對(duì)濕度分別控制在25～28 ℃和50%～70%之間。仔豬的免疫按照豬場(chǎng)常規(guī)的免疫措施進(jìn)行,飼養(yǎng)管理嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生防疫制度。

1.4 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),在實(shí)驗(yàn)豬耳靜脈注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg體重)麻醉后處以安樂(lè)死,迅速打開(kāi)腹腔取出肝臟,并在相同部位選取5 g左右樣本置于液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 肝臟勻漿液制備與指標(biāo)測(cè)定 稱(chēng)取0.2 g左右肝臟組織樣品,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水,冰水浴條件下機(jī)械勻漿,3000 r/min,離心10 min,取上清即10%肝臟組織勻漿液,放置于-20 ℃冰箱保存待用。肝臟線(xiàn)粒體的提取參考Tang等[15]的方法。BCA法測(cè)定蛋白濃度,嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。肝臟組織勻漿液中T-SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定[16];CAT活力采用鉬酸銨法測(cè)定[17];GSH-Px活力和GSH含量采用2-硝基苯甲酸法測(cè)定[18];GR活力采用還原型輔酶Ⅱ法測(cè)定[19];MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[20];PC含量采用2,4-二硝基苯肼法測(cè)定[21]。肝臟線(xiàn)粒體中錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定[16],Mn-SOD活力為T(mén)-SOD活力與銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase,Cu/Zn-SOD)活力的差值;GSH-Px活性和GSH含量采用2-硝基苯甲酸法測(cè)定[18]。以上指標(biāo)均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

表1 日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平

Table 1 The composition and nutrient content of diets

原料(%)基礎(chǔ)日糧實(shí)驗(yàn)日糧營(yíng)養(yǎng)水平(計(jì)算值，%)基礎(chǔ)日糧實(shí)驗(yàn)日糧玉米40003965消化能(Mcal/kg)340340碎米15001500粗蛋白20202020發(fā)酵豆粕10001000鈣085085去皮豆粕600600總磷070070血漿蛋白500500賴(lài)氨酸145145乳清粉700700蛋氨酸+胱氨酸079079魚(yú)粉400400蘇氨酸081081白糖450450色氨酸023023葡萄糖300300異亮氨酸074074豆油150150纈氨酸089089L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽(98%)030030亮氨酸145180L-蛋氨酸015015L-蘇氨酸020020L-色氨酸005005L-異亮氨酸005005L-纈氨酸005005L-亮氨酸000035食鹽030030石粉110110磷酸氫鈣080080預(yù)混料?100100合計(jì)1000010000

注*:預(yù)混料為每kg全價(jià)料提供:維生素A,15000 U;維生素D3,3000 U;維生素E,150 mg;維生素K3,3 mg;維生素B1,3 mg;維生素B2,6 mg;維生素B6,5 mg;維生素B12,0.03 mg;煙酸,45 mg;維生素C,250 mg;泛酸,9 mg;葉酸,1 mg;生物素,0.3 mg;氯化膽堿,500 mg;鐵,170 mg;銅,150 mg;碘,0.90 mg;硒,0.20 mg;鋅,150 mg;鎂,68 mg;錳,80 mg;鈷,0.30 mg。

1.5.2 肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量測(cè)定 從-80 ℃超低溫冰箱中取出肝臟組織樣品200～300 mg,采用Trizol溶液提取總RNA。檢測(cè)所有樣品RNA濃度和提取完整性,并用0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理水將各樣品RNA濃度調(diào)整一致。采用相同濃度的總RNA樣品按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),加入總RNA 2.0 μL、20×RT Enzyme Mix 4.0 μL、Nuclease-free H2O 14.0 μL,按照下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):37 ℃,15 min;85 ℃,5 s。反應(yīng)結(jié)束后所得的cDNA原液用超純水進(jìn)行1∶4稀釋。按照Takara SYBR? Premix Ex TaqTM定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,依次往定量PCR管中加入以下試劑(20 μL體系):cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物 0.4 μL、下游引物 0.4 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、超純水 6.8 μL,混勻離心后在Real-time PCR儀上反應(yīng)檢測(cè)。反應(yīng)程序如下:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 45 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。選擇β-actin作為內(nèi)參基因,利用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量,將NC組基因mRNA表達(dá)量定為1,其余各組的基因mRNA表達(dá)量以相對(duì)于NC組基因mRNA表達(dá)量的比值得出。各目的基因引物序列見(jiàn)表2。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線(xiàn)性模型(general liner model,GLM)進(jìn)行主效應(yīng)(初生重和日糧亮氨酸水平)及互作效應(yīng)的差異顯著性檢驗(yàn)。p值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，p值介于0.05到0.10之間時(shí)認(rèn)為有差異顯著的趨勢(shì)。當(dāng)互作效應(yīng)的p值小于0.05時(shí)，各處理組采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化酶活性和GSH含量的影響

由圖1可知,與NBW組相比,IUGR組仔豬肝臟中T-SOD活力顯著降低(p<0.05),GSH-Px活力有降低趨勢(shì)(p=0.086),CAT活力、GR活力和GSH含量均無(wú)顯著差異(p>0.05)。與基礎(chǔ)日糧組相比,添加0.35%亮氨酸有提高T-SOD活力的趨勢(shì)(p=0.090),對(duì)CAT活力、GSH-Px活力、GR活力和GSH含量均無(wú)顯著影響(p>0.05)。

表2 RT-PCR引物序列

Table 2 The primer sequences used in the real-time PCR

項(xiàng)目登錄號(hào)序列(5′-3′)長(zhǎng)度(bp)Nrf2NM＿0011851521F-GGACAGCAGAAGTGATCCCCR-CAAAACCGTATCACTGGCCG97SOD1NM＿0011904221F-AGGGAGAGAAGACAGTGTTAGTR-GTACACAGTGGCCACACCAT224SOD2NM＿2141272F-CAAGAAGGGGCACCACGTTR-CTCAGGGGACGCAAGAACTG70CATNM＿2143012F-TGTACCCGCTATTCTGGGGAR-TCACACAGGCGTTTCCTCTC119GPx1NM＿2142011F-CCTCAAGTACGTCCGACCAGR-GTGAGCATTTGCGCCATTCA85β-actinDQ8451711F-TCATGGACTCTGGGGATGGGR-GCAGCTCGTAGCTCTTCTCC273

圖1 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化酶活性和GSH含量的影響Fig.1 Effect of leu and IUGR on antioxidant enzyme activities and glutathione concentration in the liver of weaned piglets注:NC:NBW仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧,NL:NBW仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧添加0.35%亮氨酸,IC:IUGR仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧,IL:IUGR仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧添加0.35%亮氨酸;同行小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。下同。

機(jī)體在正常的新陳代謝過(guò)程中會(huì)不斷地產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),但細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在著清除ROS的抗氧化防御系統(tǒng)[22]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多或清除ROS的能力降低時(shí),會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷,進(jìn)而引起機(jī)體氧化應(yīng)激[23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),IUGR斷奶仔豬肝臟T-SOD活力顯著下降,GSH-Px活力有下降趨勢(shì)。T-SOD是清除ROS的金屬酶,可特異性地捕捉體內(nèi)生成的ROS[24]。GSH-Px同時(shí)分布于胞漿和線(xiàn)粒體中,負(fù)責(zé)清除有機(jī)氫過(guò)氧化物和過(guò)氧化氫[25]。何進(jìn)田等[26]研究發(fā)現(xiàn),IUGR導(dǎo)致哺乳仔豬肝臟SOD與GSH-Px活力降低。由此可見(jiàn),IUGR仔豬可能會(huì)加劇肝臟氧化應(yīng)激程度,降低機(jī)體抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)日糧添加亮氨酸有提高IUGR斷奶仔豬肝臟T-SOD的趨勢(shì)。袁雪薇等[27]給高脂大鼠飼喂高濃度亮氨酸可提高肝臟T-SOD活力和GSH-Px活力,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.2 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟MDA和PC含量的影響

由圖2可知,與NBW組相比,IUGR組仔豬肝臟中MDA含量顯著升高(p<0.05),PC含量無(wú)顯著差異(p>0.05)。與基礎(chǔ)日糧組相比,添加0.35%亮氨酸顯著降低仔豬肝臟中MDA含量(p<0.05),PC含量無(wú)顯著差異(p>0.05)。

圖2 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟MDA和PC含量的影響Fig.2 Effect of leu and IUGR on malondialdehydeand protein carbonyl concentrations in the liver of weaned piglets

研究發(fā)現(xiàn),IUGR與氧化應(yīng)激密切相關(guān),易加劇機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化的程度[28]。MDA是ROS作用于生物膜中的不飽和脂肪酸所產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,常用來(lái)表示機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞的受損程度[29]。通過(guò)PC含量的測(cè)定可以反映機(jī)體蛋白質(zhì)氧化損傷的情況[30]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),IUGR斷奶仔豬肝臟MDA含量顯著升高。李博等[31]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),23日齡IUGR仔豬肝臟MDA含量顯著升高,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。Kamath等[28]證實(shí),IUGR新生胎兒氧化應(yīng)激嚴(yán)重,導(dǎo)致MDA含量顯著升高。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)日糧添加亮氨酸可顯著降低肝臟MDA含量。另外,Li等[11]發(fā)現(xiàn),1.5%亮氨酸可減少高脂大鼠血清MDA含量,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

2.3 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟線(xiàn)粒體抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖3可知,與NBW組相比,IUGR組仔豬肝臟線(xiàn)粒體中Mn-SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量均顯著降低(p<0.05)。與基礎(chǔ)日糧組相比,添加0.35%亮氨酸有提高GSH-Px活力的趨勢(shì)(p=0.087),對(duì)Mn-SOD活力和GSH含量均無(wú)顯著影響(p>0.05)。GSH含量受初生重和亮氨酸互作效應(yīng)的影響,日糧添加亮氨酸顯著緩解了IUGR造成的線(xiàn)粒體GSH含量降低(p<0.05)。

圖3 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟線(xiàn)粒體抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.3 Effect of leu and IUGR on mitochondrial antioxidant system in the liver of weaned piglets

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化以及形成ATP的主要場(chǎng)所,能為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供所需能量。同時(shí),線(xiàn)粒體也是機(jī)體內(nèi)源性ROS的主要來(lái)源,容易受到ROS的攻擊。因此,線(xiàn)粒體在真核細(xì)胞的生存和凋亡中起著關(guān)鍵的作用[32-33]。Lee等[34]表明,線(xiàn)粒體功能損傷會(huì)降低肝臟抗氧化能力,使ROS含量增加。Park等[35]研究發(fā)現(xiàn),IUGR會(huì)通過(guò)線(xiàn)粒體途徑損害后代抗氧化系統(tǒng),導(dǎo)致氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)中,IUGR斷奶仔豬肝臟線(xiàn)粒體Mn-SOD活力、GSH-Px活力和GSH含量均顯著降低。Mn-SOD特異性的存在于線(xiàn)粒體內(nèi)[36],是生物體內(nèi)重要的ROS清除劑。可見(jiàn),IUGR肝臟線(xiàn)粒體氧化損傷是導(dǎo)致其氧化應(yīng)激的另一重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),日糧添加亮氨酸改善斷奶仔豬肝臟氧化損傷可能與緩解IUGR介導(dǎo)線(xiàn)粒體GSH含量降低有關(guān)。GSH是細(xì)胞內(nèi)最豐富的非蛋白巰基化合物,在GSH-Px作用下負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫,參與體內(nèi)ROS的代謝調(diào)節(jié)[37]。

2.4 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖4可知,與NBW組相比,IUGR組仔豬肝臟中Nrf2、SOD1、SOD2、GPx1 mRNA表達(dá)量均顯著降低(p<0.05),CAT mRNA表達(dá)量差異不顯著(p>0.05)。與基礎(chǔ)日糧組相比,添加0.35%亮氨酸顯著提高SOD2 mRNA表達(dá)量(p<0.05),有提高SOD1 mRNA表達(dá)量的趨勢(shì)(p=0.084),對(duì)Nrf2、CAT、GPx1 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(p>0.05)。SOD2、GPx1 mRNA表達(dá)量受初生重和亮氨酸互作效應(yīng)的影響,日糧添加亮氨酸顯著緩解了IUGR對(duì)SOD2、GPx1 mRNA表達(dá)的抑制作用(p<0.05)。

圖4 Leu與IUGR對(duì)斷奶仔豬肝臟抗氧化基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of leu and IUGR on mRNA expressions of antioxidant genes in the liver of weaned piglets

為進(jìn)一步研究其機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)對(duì)抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,IUGR斷奶仔豬肝臟Nrf2、SOD1、SOD2、GPx1 mRNA表達(dá)量顯著降低。Yin等[38]研究發(fā)現(xiàn),氧化損傷會(huì)造成新生仔豬Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)途徑受損,導(dǎo)致抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量下降及抗氧化酶活性降低。另有研究表明,IUGR降低斷奶仔豬肝臟SOD1、GPx1 mRNA表達(dá)量[39-40]。上述研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。有研究報(bào)道,支鏈氨基酸提高抗氧化酶表達(dá)的機(jī)制可能與上調(diào)Keap1/Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)中亮氨酸未顯著影響Nrf2 mRNA的表達(dá),其對(duì)Keap1/Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),向高脂日糧模型大鼠長(zhǎng)期飼喂1.5%亮氨酸可抑制高脂日糧造成的肝臟SOD2 mRNA表達(dá)量升高,并降低血清MDA水平,其機(jī)制可能與亮氨酸改善線(xiàn)粒體功能有關(guān)。D’Antona等[41]報(bào)道,日糧添加支鏈氨基酸可提高小鼠心肌與骨骼肌線(xiàn)粒體生物合成,降低ROS產(chǎn)生。SOD2編碼線(xiàn)粒體Mn-SOD蛋白,其負(fù)責(zé)清除線(xiàn)粒體ROS。細(xì)胞抗氧化功能正常情況下,Mn-SOD表達(dá)受ROS水平的正向調(diào)節(jié)作用。而本實(shí)驗(yàn)中,日糧添加亮氨酸提高了斷奶仔豬肝臟SOD2 mRNA的表達(dá)量,這與Li等[11]結(jié)果不同,說(shuō)明亮氨酸對(duì)線(xiàn)粒體抗氧化酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能受物種、飼喂方式以及機(jī)體狀態(tài)等因素的影響。Mn-SOD轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)一定程度解釋了日糧添加亮氨酸緩解IUGR斷奶仔豬肝臟線(xiàn)粒體氧化損傷的作用機(jī)制。同時(shí),高亮氨酸水平日糧可顯著緩解IUGR介導(dǎo)斷奶仔豬肝臟GPx1 mRNA表達(dá)下調(diào),這可能與線(xiàn)粒體GSH含量升高導(dǎo)致的底物誘導(dǎo)效應(yīng)有關(guān)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IUGR導(dǎo)致斷奶仔豬肝臟MDA含量顯著升高,抗氧化酶活性和相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平降低。日糧添加0.35%亮氨酸可顯著降低斷奶仔豬肝臟MDA含量,并顯著緩解IUGR介導(dǎo)斷奶仔豬線(xiàn)粒體GSH含量降低與肝臟SOD2和GPx1 mRNA表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果提示,IUGR可導(dǎo)致斷奶仔豬肝臟氧化損傷,破壞抗氧化防御系統(tǒng);日糧添加0.35%亮氨酸可通過(guò)改善斷奶仔豬肝臟抗氧化功能,緩解IUGR導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化。本研究進(jìn)一步豐富了亮氨酸在抵抗動(dòng)物機(jī)體氧化應(yīng)激方面的積極作用,也為建立IUGR胎兒早期營(yíng)養(yǎng)策略提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of dietary concentrations of leucine and intrauterine growth retardation on antioxidant function in the liver of weaned piglets

SU Wei-peng,XU Wen,ZHANG Hao,YING Zhi-xiong,HUANG Qiang,HE Jin-tian,ZHANG Li-li,WANG Tian*

(College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Toinvestigatetheeffectofdietaryconcentrationsofleucineandintrauterinegrowthretardation(IUGR)onantioxidantfunctionintheliverofweanedpiglets.Sixteennormalbirthweight(NBW)andsixteenIUGRnewbornpigletswereselected.Allpigletsweanedat14dofpostnatalageandfedeitheracontroldietoracontroldietsupplementedwith0.35%leucinefor21days.Therefore,one2×2factorialexperimentaldesignwasusedandeachgrouphadeightreplications,withonepigletperreplication.ComparedwithNBWpiglets,IUGRpigletshadlowertotalsuperoxidedismutase(T-SOD)activitywhereasincreasedmalondialdehyde(MDA)contentinliver(p<0.05).ThereweresignificantdecreasesintheactivitiesofMn-superoxidedismutase(Mn-SOD)andglutathioneperoxidase(GSH-Px),andthecontentofglutathione(GSH)inthehepaticmitochondrialofIUGRpigletsthanthoseintheNBWpiglets(p<0.05).Inaddition,IUGRdecreasedthemRNAexpressionlevelsofnucleartranscriptionfactor2(Nrf2),superoxidedismutase1(SOD1),superoxidedismutase2(SOD2)andglutathioneperoxidase1(GPx1)inliver(p<0.05).Dietarysupplementationof0.35%leucinesignificantlydecreasedMDAcontentbutincreasedSOD2mRNAabundanceinliver(p<0.05).AhigherleucineinclusionalleviatedthedecreasedmitochondrialGSHcontentandthedown-regulatedSOD2andGPx1mRNAabundancesinliver(p<0.05).Thus,dietarysupplementationof0.35%leucineattenuatesthehepaticlipidperoxidationinducedbyIUGR,whichmaybeassociatedwiththepartiallyimprovedantioxidantcapacityintheliverofpiglets.

leucine;intrauterinegrowthretardation;weanedpiglets;liver;antioxidantfunction

2016-04-05

蘇偉鵬(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：weipengsu@126.com。

*通訊作者:王恬(1958-)，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：twang18@163.com。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB124703)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)19-0345-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.059