李曉玲，王紅艷，瞿 偉，朱蓋山，劉 超

宿州學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽宿州，234000

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鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶相互作用的光譜研究

李曉玲，王紅艷，瞿 偉，朱蓋山，劉 超

宿州學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽宿州，234000

采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法研究了生理酸度條件下鹽酸頭孢吡肟(cefepime hydrochloride )與胃蛋白酶(pepsin)之間的相互作用，結(jié)果表明鹽酸頭孢吡肟對胃蛋白酶具有強(qiáng)烈的猝滅作用。用Stern-Volmer方程處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)鹽酸頭孢吡肟對胃蛋白酶的熒光猝滅過程主要由熒光猝滅體系完成的，且為靜態(tài)猝滅。并計(jì)算出了不同溫度下的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間的作用力主要是氫鍵和范德華力，且ΔG<0，同時(shí)證實(shí)它們之間的作用是自發(fā)進(jìn)行的。按照Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶結(jié)合時(shí)給體-受體之間的距離r=1.380 nm。

鹽酸頭孢吡肟;胃蛋白酶;熒光猝滅;自發(fā)

蛋白質(zhì)在生命中充當(dāng)著非常重要的角色[1]，它不僅是人體主要的營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)人體組織的生長、更新和修復(fù)，而且可以承擔(dān)著各種重要的生理功能等[2]。鹽酸頭孢吡肟屬于頭孢類抗生素[3],它的工人合成已取得重大的進(jìn)展[4]，目前已用于多種細(xì)菌感染疾病的治療[5-7]。鹽酸頭孢吡肟屬于電中性的兩性離子，具有良好的水溶性，對β-內(nèi)酰胺酶親和力較低[8]，抗菌穩(wěn)定性較強(qiáng)[9]。 同時(shí)病人用藥后，不影響心電圖、心率和血壓以及腸蠕動，也不改變紅細(xì)胞脆性和凝血參數(shù)[10]。

胃蛋白酶被定義為消化性蛋白酶[11]，由胃粘膜主細(xì)胞分泌，主要作用是分解蛋白質(zhì)為小的肽片段讓機(jī)體更容易吸收。鹽酸頭孢吡肟具有激活胃蛋白質(zhì)酶原[12]，為胃蛋白酶提供酸性環(huán)境，幫助人體消化等功能。本文采用熒光光譜、紫外吸收光譜研究胃蛋白酶和鹽酸頭孢吡肟之間的相互作用，旨為鹽酸頭孢吡肟的藥理學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

儀器:U-3310紫外可見分光光度計(jì)(日本日立公司)；F-4500熒光分光光度計(jì)(日立高新技術(shù)公司)；HH-1恒溫水浴鍋(上海啟前電子科技有限公司)；pHS-23型精密PH計(jì)(上海尚闊有限公司)；分析天平(常州市天之平儀器設(shè)備有限公司)。

藥品:鹽酸頭孢吡肟(齊魯制藥有限公司)，使用時(shí)配制成濃度為2.0×10-4mol·L-1的溶液；胃蛋白酶(鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司)，使用時(shí)配制成濃度為2.0×10-4mol·L-1的溶液；BR緩沖溶液(pH=2.0)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取10支10 mL比色管，分別加入1.0 mL 2.0×10-4mol·L-1胃蛋白酶溶液和2.0 mL pH=2.0的BR緩沖液，再依次加入0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 mL 2.0×10-4mol·L-1的鹽酸頭孢吡肟溶液，然后加水定容至10 mL，搖勻后放置20 min。分別記錄293 K、298 K、310 K條件時(shí)，波長為300～450 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜(設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長285 nm)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 胃蛋白酶的熒光猝滅光譜

圖1為胃蛋白酶和鹽酸頭孢吡肟發(fā)生熒光猝滅的光譜圖。由圖1(a)可知，在溫度為293 K時(shí)，胃蛋白酶在350 nm處有熒光最大發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度達(dá)到283.3；由圖1(b)可知，在溫度為298 K時(shí)，胃蛋白酶在350 nm處有熒光最大發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度達(dá)到311.9；由圖1(c)可知，在溫度為310 K時(shí)，胃蛋白酶在350 nm處有熒光最大發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度達(dá)到308.3。綜合圖1(a)、1(b)和1(c)可知，在同一溫度下，當(dāng)胃蛋白酶保持一定濃度時(shí)，隨著鹽酸頭孢吡肟濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，說明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間發(fā)生猝滅作用而發(fā)出內(nèi)源熒光，生成一種新型的復(fù)合物。

圖1 胃蛋白酶和鹽酸頭孢吡肟發(fā)生熒光猝滅光譜圖

2.2 熒光猝滅機(jī)理

動態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅均屬于熒光猝滅[13]。在動態(tài)猝滅過程中，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大。在靜態(tài)猝滅過程中，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小。為了研究鹽酸頭孢吡肟和胃蛋白酶的猝滅類型，運(yùn)用Stern-Volmer方程[14]處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以便作出準(zhǔn)確判斷

F0/F=1+Kq0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0為不加鹽酸頭孢吡肟情況下系統(tǒng)中熒光強(qiáng)度的值，F(xiàn)為加入鹽酸頭孢吡肟情況下系統(tǒng)中熒光強(qiáng)度的值,KSV為猝滅常數(shù)，[Q]為鹽酸頭孢吡肟濃度，Kq為動態(tài)猝滅常數(shù)，τ0(10-8s-1)為胃蛋白酶的平均熒光壽命。實(shí)驗(yàn)中，分別在293、298和310 K條件，用F0/F對[Q]作圖，如圖2所示。

圖2 鹽酸頭孢吡肟-胃蛋白酶體系中F0/F對[Q]所作的線性關(guān)系圖

由圖2可知，固定濃度梯度的鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶相互反應(yīng)的Stern-Volmer曲線在一定溫度下表現(xiàn)出一定的線性關(guān)系。Stern-Volmer為猝滅常數(shù)，Ksv是直線斜率。由猝滅常數(shù)公式Ksv=Kqτ0可以得到Kq=Κsv/τ0,從而求出猝滅過程中速率常數(shù)Kq的值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表1中，由表1可知，猝滅常數(shù)Ksv的大小隨溫度的升高而逐漸降低，因?yàn)樗俾食?shù)Kq值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)的值(2.0×1010L·mol-1·s-1)，由此可以推出鹽酸頭孢吡肟對胃蛋白酶的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶相互作用的猝滅常數(shù)

2.3 鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的測定

運(yùn)用(2)式可以計(jì)算出靜態(tài)猝滅過程中鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間作用的結(jié)合常數(shù)Ka。

(2)

式中，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù)[15]。以log[(F0-F/F)]為Y軸，以log[Q]為X軸作log[(F0-F/F)]對log[Q]的直線圖，如圖3所示。由圖3可知,結(jié)合常數(shù)n和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Ka的值，即運(yùn)用(2)式可求出鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶系統(tǒng)在不同溫度下的Ka與n值。

根據(jù)圖3并結(jié)合常數(shù)公式可以看出，通過直線截距可以得到鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間的結(jié)合常數(shù)Ka,由直線的斜率可得出鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。在293、298、310K三個(gè)溫度下所得的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)見表2。由表2可以看出，溫度逐漸升高，Ka的值逐漸減小，即溫度提高，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶結(jié)合的作用力減弱；鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶作用時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1個(gè)。同時(shí)還可以看出，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶間結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n是下降的，這也說明隨著溫度的提高，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶間的結(jié)合能力減弱。由此可以證明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間的猝滅類型是靜態(tài)猝滅。

圖3 log[(F0-F/F)]對log[Q]所作的線性圖

表2 鹽酸頭孢吡肟和胃蛋白酶在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)

2.4 反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算與作用力類型的判定

在一定的溫度條件下，一個(gè)化學(xué)反應(yīng)的焓變ΔH可以看作是一個(gè)常數(shù)，并由下式(3)算出它的值，吉布斯自由能變(ΔG)和熵變(ΔS)可由式(4)和(5)求得。

ln(K2/K1)=-ΔH/R(1/T2-1/T1)

(3)

lnK=-ΔH/(KT)+ΔS/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中，R是摩爾氣體常數(shù)，K是結(jié)合常數(shù)，求得的熵變ΔS、吉布斯自由能變ΔG、焓變ΔH見表2。結(jié)合作用力[16]和熱力學(xué)參數(shù)之間關(guān)系(表3)，根據(jù)熱力學(xué)規(guī)律，ΔH<0、ΔS<0時(shí)，反應(yīng)結(jié)合力類型為氫鍵和范德華力;ΔH≤0、ΔS>0 時(shí)，反應(yīng)結(jié)合力類型是靜電引力；ΔH>0、ΔS>0時(shí)，反應(yīng)結(jié)合力類型是疏水作用力;根據(jù)表2，ΔG<0，表明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的反應(yīng)是一系列自發(fā)過程。在溫度293、298與310 K時(shí)，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶反應(yīng)中的ΔH<0，ΔS<0，故其間的作用力是氫鍵與范德華力。

表3 結(jié)合作用力和熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

2.5 結(jié)合位置計(jì)算

根據(jù)Forster轉(zhuǎn)移理論[17]，當(dāng)供體的熒光光譜與受體的紫外光譜部分重疊時(shí)，說明受體和供體間產(chǎn)生了非輻射能量的轉(zhuǎn)移[18]，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶間的距離非常小，當(dāng)最大距離R≤7nm時(shí)，說明鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶之間產(chǎn)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。

在溫度為298K,pH=2.0時(shí)，鹽酸頭孢吡肟與胃蛋白酶的濃度均為2.0×10-5mol·L-1，在濃度比為1∶1的條件下，胃蛋白酶的熒光光譜和鹽酸頭孢吡肟的紫外-可見吸收光譜有一部分發(fā)生重疊，如圖4所示。

2016-08-26

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目“含氮/氧芳香雜環(huán)后過渡金屬配合物的組裝及催化C-C、C-N鍵形成反應(yīng)研究”(KJ2016A772)；宿州學(xué)院一般科研項(xiàng)目“頭孢類藥物及納米材料與蛋白質(zhì)相互作用的研究”(2014yyb09)。

李曉玲(1980-)，女，安徽宿州人，碩士，助教，主要研究方向：藥物分析與化學(xué)分析。

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.11.033

R285.0

A

1673-2006(2016)11-0124-04