李文利,劉元雪，陳舜勝，傅 駿

（1.上海豐收蟹莊食品有限公司，上海 201801；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

醉蟹生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

李文利1＊,劉元雪2，陳舜勝2，傅 駿1

（1.上海豐收蟹莊食品有限公司，上海 201801；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

本文對(duì)醉蟹生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)(PCR-DGGE)手段來(lái)評(píng)估新工藝的安全性。主要的優(yōu)化工藝為：1）必須選用腮和腸道干凈的原料蟹制備醉蟹；2）使用高濃度食用酒精預(yù)殺菌相比于臭氧殺菌更方便有效；3）原料蟹預(yù)殺菌時(shí)增加減壓處理對(duì)提高醉蟹安全性的作用明顯。通過(guò)用優(yōu)化后的工藝腌制醉蟹，不僅提高了醉蟹的食品安全性，而且縮短了腌制時(shí)間，為企業(yè)節(jié)約了成本。

醉蟹；PCR-DGGE；腸道微生物；微生物群落結(jié)構(gòu)

近年來(lái)，健康安全食品的觀念越來(lái)越被熟知和認(rèn)可，醉蟹作為一種既傳統(tǒng)又時(shí)尚的糟制食品也面臨著健康安全的考驗(yàn)。傳統(tǒng)的醉蟹加工原料選擇多隨意性，生產(chǎn)工藝僅憑經(jīng)驗(yàn)無(wú)關(guān)鍵控制點(diǎn)、無(wú)科學(xué)規(guī)范的操作規(guī)程，品質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致某些微生物指標(biāo)達(dá)不到國(guó)家相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)，醉蟹食品的安全性令人擔(dān)憂[1、2]。醉蟹一般使用完整蟹腌制，鹵料難以進(jìn)入蟹體內(nèi)，醉蟹制品中的細(xì)菌較難殺死，通常通過(guò)加大量食鹽或者食糖來(lái)控制醉蟹的微生物指標(biāo)，但是食鹽、食糖的加入會(huì)導(dǎo)致醉蟹口感和風(fēng)味的改變，同時(shí)過(guò)多的攝入食鹽、食糖不符合健康飲食的要求[3、4]。本文主要是通過(guò)優(yōu)化工藝建立科學(xué)、規(guī)范的醉蟹生產(chǎn)新工藝，同時(shí)通過(guò)科學(xué)的檢測(cè)方法嚴(yán)格監(jiān)控原料蟹的選擇、殺菌等關(guān)鍵控制點(diǎn)，從根本上提高了醉蟹的食用安全性。

1、材料與方法

1.1材料

豐收蟹莊醉蟹和原料蟹。

1.2主要試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、高濃度食用酒精、糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化公司）、2×Taq PCR MasterMix（天根生化公司）、膠回收試劑盒（康寧生物科技（吳江）有限公司）、細(xì)菌通用引物357-R和518-R、V3區(qū)擴(kuò)增引物27f和1492r等。

1.3主要儀器

單人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1G）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上?；厶﹥x器制造有限公司，DHP-9052型）、欣美臭氧發(fā)生器（青島欣美凈化設(shè)備有限公司，XM-T型）、PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，A300型）、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

2、方法

2.1 原料蟹的選擇與預(yù)處理

2.1.1原料蟹的選擇

原料蟹按照產(chǎn)地和批次進(jìn)行分組，取蟹腮顏色具有代表性的蟹進(jìn)行分組腌制。根據(jù)蟹腮的顏色對(duì)醉蟹微生物指標(biāo)的影響，選擇優(yōu)質(zhì)原料蟹。

2.1.2 原料蟹的預(yù)處理

打開(kāi)蟹臍觀察后腸顏色，根據(jù)腸道中無(wú)黑色糞便分為干凈蟹、不干凈蟹、人工擠干凈的蟹（JC）三組腌制。根據(jù)醉蟹微生物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的預(yù)處理方法。

原料蟹選擇和預(yù)處理后均按照一般工藝( general process, GB)腌制6d，檢測(cè)醉蟹的微生物指標(biāo)。

2.2 原料蟹的預(yù)殺菌

原料蟹的預(yù)殺菌后，按照一般工藝腌制6d，檢測(cè)醉蟹的微生物指標(biāo)。

2.2.1預(yù)殺菌方式的選擇

采用食用酒精和臭氧殺菌[5]兩種方式，按照特定的殺菌條件進(jìn)行處理，未經(jīng)處理的同批次原料蟹作為對(duì)照組，根據(jù)醉蟹微生物指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，選擇較有效的預(yù)殺菌方式。

2.2.2 減壓預(yù)殺菌

在預(yù)殺菌方式的基礎(chǔ)上，再通過(guò)特定設(shè)備對(duì)原料蟹進(jìn)行減壓處理(decompression process, DP)，增加原料蟹與殺菌介質(zhì)的接觸面積，從而提高原料蟹預(yù)殺菌的殺菌效果。

2.3 醉蟹腌制過(guò)程中微生物動(dòng)態(tài)變化

微生物數(shù)量變化：按照不同工藝生產(chǎn)的醉蟹，從生產(chǎn)完成后每隔1天對(duì)微生物指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，觀察微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。

微生物種類變化：參考祭仲石等的方法[6]，利用基因手段PCR-DGGE對(duì)活蟹和醉蟹中的微生物種類進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)PCR-DGGE指紋圖譜觀察腌制前后螃蟹微生物種類多樣性的變化。

2.4 微生物檢測(cè)方法

微生物指標(biāo)根據(jù)GB 4789系列檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定測(cè)定，判定標(biāo)準(zhǔn)（judgment standard, JS）根據(jù)GB 10136制訂，菌落總數(shù)(aerobic bacterial count, ABC)≤5000cfu/ g、大腸菌群（MPN）≤30MPN/100g。

3、結(jié)果與討論

3.1 原料蟹的選擇與預(yù)處理

原料蟹蟹腮的顏色對(duì)醉蟹微生物指標(biāo)影響顯著。2003年開(kāi)始實(shí)施的《水產(chǎn)養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理規(guī)定》規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖用水的標(biāo)準(zhǔn)，蟹腮的顏色與其生存的環(huán)境密切相關(guān)，干凈的蟹腮有點(diǎn)灰白色，污染的蟹腮深黑色或者其他顏色，通過(guò)蟹腮的顏色判斷它所處的生長(zhǎng)環(huán)境，初步選擇河蟹污染與否，污染蟹腌制成的醉蟹微生物指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于干凈蟹（圖1）。

圖1 原料蟹腮顏色對(duì)醉蟹微生物指標(biāo)的影響Fig．1 The effect of material crab gills color on the drunken crabs microbiological indicator

蟹后腸道的潔凈程度對(duì)醉蟹微生物指標(biāo)也有明顯影響。醉蟹菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：腸道不干凈（ZC）＞腸道擠干凈(JC)＞腸道干凈(GC) （圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示必須通過(guò)暫養(yǎng)將原料蟹的腸道排空減少帶菌量，同時(shí)可以通過(guò)人工擠壓的方法降低蟹腸道初始細(xì)菌菌落總數(shù)。腸道微生物中分為兩種一種是“常住菌”和“過(guò)路菌”，其中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等均為過(guò)路菌，可隨糞便排出體外[7]。大腸菌群檢測(cè)結(jié)果顯示，不管怎么處理蟹腸道，醉蟹的大腸菌群指標(biāo)均超過(guò)730MPN/100g，可能是因?yàn)榇竽c菌群附著在腸壁上無(wú)法徹底清除。

圖2 蟹后腸潔凈程度對(duì)對(duì)醉蟹微生物指標(biāo)的影響Fig．2 The effect of after intestinal cleanliness on the drunken crabs microbiological indicator

3.2 原料蟹的預(yù)殺菌處理

醉蟹中常用的殺菌方式主要有化學(xué)殺菌和物理殺菌兩種方式?；瘜W(xué)殺菌有通過(guò)添加醉蟹寶[9]等食品防腐劑達(dá)到殺菌的效果，醉蟹制作工藝中利用白酒中的酒精度殺菌也屬化學(xué)殺菌。物理殺菌主要是通過(guò)改變溫度、改變壓力來(lái)達(dá)到殺菌的效果，但這些方法不適用于醉蟹生產(chǎn)；現(xiàn)應(yīng)用于醉蟹殺菌的物理殺菌方法是輻照殺菌[8]，其主要是利用原子能射線的輻照能量對(duì)食品殺菌處理來(lái)保存食品，但該殺菌方式需要特定設(shè)備，所以應(yīng)用不廣泛。

臭氧具有特殊氣味的藍(lán)色氣體，可以通過(guò)氧化作用破壞微生物膜結(jié)構(gòu)來(lái)達(dá)到殺菌的效果，其殺菌效果好且無(wú)殘留[10]。高濃度食用酒精殺菌效果也很好也無(wú)殘留之虞。本研究著重對(duì)酒精預(yù)殺菌和臭氧預(yù)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明食用酒精和臭氧均具有一定的殺菌效果，但高濃度食用酒精比臭氧的殺菌效果好，且處理時(shí)間短、簡(jiǎn)便（圖3）。因此選擇高濃度食用酒精進(jìn)行殺菌。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酒精預(yù)殺菌時(shí)同時(shí)輔以減壓處理，可再明顯提高預(yù)殺菌的效果，減壓預(yù)殺菌組（JY）與對(duì)照組（Control）、高濃度食用酒精組（JS）相比，大大降低了醉蟹中的微生物含量（圖4）。主要原因可能是減壓處理增加蟹腮、蟹殼內(nèi)與高濃度食用酒精的接觸面積，從而提高原料蟹的預(yù)殺菌效果。

圖3 不同殺菌方式的殺菌效果Fig．3 The bactericidal effect of different sterilization methods

圖4 減壓殺菌的殺菌效果Fig．4 The bactericidal effect of decompression

3.3 醉蟹腌制過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化

3.3.1 微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

醉蟹腌制過(guò)程中，無(wú)論是一般工藝還是優(yōu)化得到的減壓工藝，醉蟹的微生物數(shù)量均隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，同時(shí)可以明顯看出減壓工藝比一般工藝更加有效（圖5、圖6）。減壓工藝制作而成的醉蟹，菌落總數(shù)在腌制6d時(shí)達(dá)到國(guó)家食品安全性標(biāo)準(zhǔn)，而一般工藝需要8d；大腸菌群在腌制8d后達(dá)到國(guó)家食品安全性標(biāo)準(zhǔn)，而一般工藝需要超過(guò)8d。

圖5 菌落總數(shù)在醉蟹腌制過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化Fig．5 The dynamic changes of aerobic bacterial count inthe process of drunk crab

圖6 大腸菌群在醉蟹腌制過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化Fig．6 The dynamic changes of coliform inthe process of drunk crab

3.3.2微生物種類的動(dòng)態(tài)變化

圖7為醉蟹和原料蟹腸道微生物的DGGE指紋圖譜及分析示意圖，DGGE指紋圖譜中條帶的位置不同代表微生物種類的不同；條帶的亮度的不同代表微生物的相對(duì)數(shù)量的不同，亮度越亮代表該種類微生物在整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)中的數(shù)量越多[11]。從圖7可以看出，醉蟹與原料蟹相比，微生物的種類和數(shù)量都明顯減少。從圖7中可以看出，泳道1、2的條帶分別是15和8，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)減壓工藝腌制而成的醉蟹，微生物種類和數(shù)量均明顯少于一般工藝腌制而成的醉蟹；泳道3、4的條帶分別是22和21，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：原料蟹蟹腮、后腸干凈與否對(duì)醉蟹的微生物群落結(jié)構(gòu)影響不顯著。從表1中可以看出，泳道1、泳道2與泳道4的相似度分別為0.263和0.185，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明原料蟹經(jīng)過(guò)腌制過(guò)程后，醉蟹中細(xì)菌種類明顯減少。

圖7 蟹腸道微生物16S rDNA變性梯度凝膠電泳（DGGE）指紋圖譜及其分析示意圖Fig．7 Crab gut microbes 16 s rDNA modified gradient gel electrophoresis (DGGE) fingerprint diagram and its analysis

表1 蟹腸道微生物DGGE圖譜的相似系數(shù)Table.1 The similarity coefficient of crab gut microbes DGGE graph

4 、總結(jié)

以醉蟹為代表的醉制品，微生物指標(biāo)是品質(zhì)的根本與關(guān)鍵。本文對(duì)醉蟹生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)(PCR-DGGE)手段對(duì)微生物狀況進(jìn)行了全面評(píng)估，優(yōu)化得到更加科學(xué)、規(guī)范的新工藝。具體優(yōu)化工藝如下：必須選用腮和腸道干凈的蟹作為腌制醉蟹的原料；使用高濃度食用酒精對(duì)原料蟹預(yù)殺菌效果好且方便；原料蟹預(yù)殺菌時(shí)增加減壓處理。在此工藝條件下，不僅大大降低了醉蟹中微生物數(shù)量和種類，提高了醉蟹的食品安全性，而且縮短了腌制時(shí)間，為企業(yè)節(jié)約了成本。

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The study optimized manufacture process of drunken crabs and evaluated its food safety by traditional microbiological methods and PCR-DGGE. The main process conditions were as follows:1) it is necessary that the cheek and intestinal of raw crab were clean enough. 2) the presterilization of with high concentation alcohol was more effective than ozone sterilizaton.3) hypobaric treatment with presterilization could obviously improve the food safety of drunken crabs. Drunken crabs producted by the new process improved its food safety,and the sousing time was shorten which save the costs for the companies.

drunken crabs, PCR-DGGE, enteric microorganism, microbial community structure