朱穎

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，天津300211）

論著

pH/溫度雙重響應(yīng)抗腫瘤藥物微球的制備和研究

朱穎

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，天津300211）

目的：制備能夠在人體正常生理溫度及腫瘤細(xì)胞內(nèi)部酸性環(huán)境中，可實(shí)現(xiàn)pH/溫度雙重刺激響應(yīng)性控制釋藥的抗腫瘤藥物微球。方法：采用蒸餾-沉淀聚合法合成球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的載藥微球，在表面沉積金納米粒子，并用氯金酸還原法，將沉積在微球上的氯金酸中Au3＋還原為Au°，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該微球的毒性。結(jié)果：成功合成聚合物微球P（MAA-MBA）－EDA-FAAuNP，發(fā)現(xiàn)其pH/溫度的可控釋藥特性以及在高濃度下仍然保持較低毒性。結(jié)論：初步評(píng)價(jià)了P（MAA-MBA）－EDA-FA-AuNP聚合物微球作為抗腫瘤藥物輸送體系的潛力和優(yōu)勢(shì)。

蒸餾沉淀聚合；pH；溫度；可控藥物釋放

近年來(lái)，隨著靶向抗腫瘤藥物的研究與發(fā)展，多重刺激響應(yīng)性藥物載體應(yīng)運(yùn)而生，其制備和應(yīng)用為攻克腫瘤帶來(lái)了新機(jī)遇[1-2]。然而，如何實(shí)現(xiàn)該類(lèi)藥物載體的可控制備及確保其隨環(huán)境因素（如pH[3-5]、溫度[6]、氧化還原電位[7-8]和光[9]等）改變而精準(zhǔn)協(xié)調(diào)地調(diào)整釋藥仍是研究者面臨的兩大挑戰(zhàn)。目前納米藥物載體的腫瘤靶向大都依賴(lài)實(shí)體瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention，EPR效應(yīng)）原理，顆粒大小應(yīng)設(shè)計(jì)在10～300 nm之間。葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是應(yīng)用較早的腫瘤靶向分子，且FA受體在大腸癌、卵巢癌和乳腺癌等上皮惡性腫瘤中有過(guò)表達(dá)[10-12]。經(jīng)FA修飾的載體可以通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被FA受體高表達(dá)的細(xì)胞高效攝取[13]。阿霉素（doxorubicin，DOX）由于靶向性差，臨床應(yīng)用受到限制[14]。若將DOX組裝于納米載體，既可以提高DOX靶向性，又可以延長(zhǎng)其體內(nèi)滯留時(shí)間，提高藥物療效[15]。金納米粒子（gold nanoparticles， AuNP）是直徑介于1～100 nm的金顆粒，具有生物相容性好、組織滲透性強(qiáng)、表面易于修飾等優(yōu)點(diǎn)[16]。有研究表明：AuNP本身具有抗腫瘤血管生成作用[17]。另外，AuNP可以通過(guò)物理吸附、離子鍵結(jié)合、共價(jià)結(jié)合等方式結(jié)合抗腫瘤藥物，組成AuNP載藥系統(tǒng)[18]?；谝陨侠碚?，本實(shí)驗(yàn)將FA、DOX和AuNP有效結(jié)合，制備大小合適的載藥微球，既可以抗腫瘤血管生成，又可以抗腫瘤本身，發(fā)揮多靶點(diǎn)抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 甲基丙烯酸MAA（天津化學(xué)試劑公司）；N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺MBA（天津化學(xué)試劑公司）；偶氮二異丁腈AIBN（南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)）；甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA（上海阿拉丁試劑有限公司）；乙腈CN（天津杰爾正化工貿(mào)易有限公司）；甲醇（天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；乙二胺EDA（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；葉酸FA（南京博全科技有限公司）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺NHS（上海阿拉丁試劑有限公司）；氯金酸HAuCl4（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），所有藥品均為分析純。阿霉素DOX（上海浩然生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM （HyCloneTM公司）；胎牛血清FBS（HyCloneTM公司）；青/鏈霉素（GibcoTM）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（1×）（生命科技公司）；二甲基亞砜DMSO（Sigma-Aldrich）；水溶性四唑鹽WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.2 儀器 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BS124S）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500DB）；離心機(jī)（Eppendorf，centrifuge 5810R）；磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司，85-1）；透射電鏡（Hitachi，HT7700）；紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀（JASCO，V-570）；元素分析儀（Perkin Elmer 2400）；酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司，PHS-25）；透析袋（MWCO=7000）（天津市聯(lián)星生物技術(shù)有限公司）；純水儀（MillipakOR40 （Millipore））；高壓滅菌鍋（Hirayama）；三用恒溫水箱（金怡儀器廠(chǎng)）；SW-CJ-1FD型單人單面凈化臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備儀器廠(chǎng)）；培養(yǎng)瓶（Corning）；2.0 mL凍存管（Corning）；微量移液器（Eppendorf）；CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific）；低溫冰箱（Haier公司）；酶標(biāo)儀（PromegaTM，GloMax?-Multi）；離心機(jī)（Eppendorf，centrifuge 5810R）；96孔板（Costar）；2470自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)器（Perkin Elmer公司）；CRC-25活度計(jì)（美國(guó)CAPINTEC.INC公司）；Scientific CL31R低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備聚合物微球

1.2.1.1 P（MAA-MBA）微球的制備:在250 mL的圓底燒瓶中，吸取單體MAA1.00 mL，然后加入交聯(lián)劑MBA（交聯(lián)度為10%）0.1765g和溶劑乙腈80mL，超聲使其完全溶解，然后加入引發(fā)劑AIBN 0.023 5 g（其中，交聯(lián)劑的量占單體量的15%，引發(fā)劑占單體量的2%）。圓底燒瓶上面依次連接刺型蒸餾管，蒸餾頭，直型冷凝管，牛角管，磨口錐形瓶。冷凝管通水，將圓底燒瓶置于磁力攪拌電熱套中加熱，使反應(yīng)體系在反應(yīng)開(kāi)始20 min時(shí)沸騰，30 min時(shí)有乙腈從牛角管口滴入錐形瓶，繼續(xù)反應(yīng)60 min終止反應(yīng)。反應(yīng)終止時(shí)，末端錐形瓶中有約40 mL乙腈液體。待反應(yīng)體系自然降溫后，產(chǎn)物離心（12 000 r/min，10 min）獲得，用乙腈洗3次，在真空干燥箱中干燥至恒重。

1.2.1.2 P(MAA-MBA)-EDA-FA微球的制備:向無(wú)水甲醇（6 mL）中加入P(MAA-MBA)聚合物微球0.04 g，超聲使其分散，加入EDA（3 mL），25℃下攪拌2 d，離心得到P(MAA-MBA)-EDA聚合物微球，用無(wú)水甲醇洗3次，在真空干燥箱中干燥至恒重。取FA（0.04 g，0.09 mmol）超聲溶于DMSO（4 mL）中，加入活化劑EDC（0.035g，0.18mmol）和NHS（0.021g，0.18 mmol），溶解，37℃下攪拌60 min，活化。將前一步得到的P(MAA-MBA)-EDA微球（0.04 g）加入該黃色透明液體中，繼續(xù)避光攪拌3～4 d，離心得到P （MAA-MBA）-EDA-FA聚合物微球，用DMSO和水洗至紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀檢測(cè)不到上清中的FA分子。在真空干燥箱中干燥至恒重。

1.2.1.3 P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球的制備:取P(MAA-MBA)-EDA-FA聚合物微球0.08 g，溶于40 mL去離子水中，超聲使其分散，依次加入0.4 mL 1%檸檬酸鈉，0.2 mL 1%HAuCl4，之后，在劇烈攪拌下，緩慢逐滴滴加羥胺NH2OH（80 mmol·L-1，0.2 mL），繼續(xù)磁力攪拌，其間用超聲分散，防止其聚集，反應(yīng)30 min后，產(chǎn)物離心（12 000 r/min，10 min），得到P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP聚合物微球，用去離子水洗3遍。產(chǎn)物在真空干燥箱中干燥至恒重。

1.2.2 載藥性能研究 考察P（MAA-MBA）-EDAFA-AuNP聚合物微球的藥物負(fù)載和釋放性能，選用的是傳統(tǒng)化療藥物阿霉素DOX。具體做法如下：將一系列不同初始濃度的DOX溶液分別與相同量的P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球（0.5 mg·mL-1）混合均勻，置于搖床上，室溫條件下避光搖晃24 h。離心得到負(fù)載DOX的聚合物微球，并通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀測(cè)定其上清在480 nm處的吸收值，代入DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到上清中DOX的濃度。初始溶液中DOX的總量與負(fù)載后上清溶液中DOX的量之差即為負(fù)載在該聚合物微球上的DOX藥量。聚合物微球的載藥量和包封率由以下公式計(jì)算得到：

其中，Wadministered dose指初始溶液中DOX的總量，Wresidualdoseinsolution指負(fù)載后上清溶液中DOX的殘余量，Wmicrospheres指用于載藥微球的量。

1.2.3 體外釋藥研究 根據(jù)載藥性能研究的結(jié)果，選擇載藥DOX溶液初始濃度為9.135×10-4g·mL-1P（MAA-MBA）-EDA-FA-AuNP微球（5×10-4g·mL-1），分別在不同pH值的磷酸緩沖溶液（50 mmol·L-1，pH 5.5或7.4）中和不同溫度（25℃或37℃）下進(jìn)行體外釋藥研究。具體做法如下：載藥微球超聲分散于12 mL水中，等分為4份，分別置于截留分子量為7 000的透析袋中，再將透析袋分別置于4個(gè)不同條件（pH和溫度）下的60 mL磷酸緩沖溶液中，在釋藥容器內(nèi)連續(xù)攪拌進(jìn)行釋藥，每個(gè)條件平行做3組。在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)均從釋藥容器內(nèi)取出2.0 mL緩沖溶液，測(cè)定其在480 nm處的吸收，計(jì)算得到其中DOX的濃度。為保持藥物釋放體系的體積不變，每次取樣后向容器內(nèi)補(bǔ)加相同條件的等量新鮮的磷酸鹽緩沖鹽溶液。以停止釋藥實(shí)驗(yàn)時(shí)穿過(guò)透析膜釋放的藥物分子總量表示累積釋放藥量。

1.2.4 聚合物微球的細(xì)胞毒性研究

1.2.4.1 聚合物微球的細(xì)胞毒性檢測(cè):人乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清FBS和1%青/鏈霉素的細(xì)胞DMEM培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)后用0.25%胰酶消化，以1∶3傳代。按約5 000個(gè)細(xì)胞每孔的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔終體積為0.2 mL，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，按1、10、100、500、1 000、2 000 μg·mL-1的濃度分別加入P（MAA-MBA）-EDAFA-AuNP微球。微球事先經(jīng)過(guò)Co60照射滅菌，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，吸棄96孔內(nèi)的培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液洗3次，并向孔板內(nèi)加入新鮮的DMEM基本培養(yǎng)基0.1 mL和WST顯色劑0.01 mL。培養(yǎng)1 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光值，以未加載體的孔作為對(duì)照孔，以空白孔作為調(diào)零孔，按公式計(jì)算上述培養(yǎng)基中的相對(duì)細(xì)胞存活率：

其中，W為相對(duì)細(xì)胞存活率，A為實(shí)驗(yàn)孔吸光值，A0為空白孔吸光值，A1為對(duì)照孔吸光值。

1.2.4.2 載DOX聚合物微球和游離DOX的細(xì)胞毒性比較:根據(jù)P（MAA-MBA）-EDA-FA-AuNP微球?qū)OX的負(fù)載量，向經(jīng)Co60照射滅菌的載體溶液中加入已知濃度的DOX溶液，混合均勻后置于搖床上，避光溫和地?fù)u晃24 h，使DOX負(fù)載于載體之上，制備載藥P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球溶液。按照1.2.4.1的方法，將MCF-7細(xì)胞傳代于96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，按0.01、0.1、1、10、100 μg·mL-1的DOX濃度分別加入載藥微球溶液，以相同濃度的游離DOX溶液處理組作為對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后吸棄96孔內(nèi)的培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液洗3次，并向孔板內(nèi)加入新鮮的DMEM基本培養(yǎng)基0.1 mL和WST顯色劑0.01 mL。培養(yǎng)1 h后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)，測(cè)定方法同上。

2 結(jié)果

2.1 聚合物微球的表征

2.1.1 TEM表征 取各步驟制得的聚合物微球，分別制備樣品，吸取一滴滴在碳膜銅網(wǎng)上，待自然晾干后于透射電鏡下觀(guān)測(cè)并攝片記錄（圖1）。TEM圖片表明，各步所得微球均為單一分散、大小均勻的球形聚合物，且最后制得的P（MAA-MBA）-EDAFA-AuNP聚合物微球平均粒徑大小約230 nm。

圖1 聚合物微球透射電鏡圖片F(xiàn)ig 1 TEM images of polymer microspheres

2.1.2 UV光譜檢測(cè) 采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(UV-siv)分別檢測(cè)FA修飾前的P（MAA-MBA）微球和FA修飾后的P（MAA-MBA）-EDA-FA微球的紫外吸收光譜圖。分別將樣品分散于蒸餾水中，稀釋至適當(dāng)濃度，加入比色池中掃描樣品，扣除蒸餾水的吸收后得到樣品的紫外吸收曲線(xiàn)（圖2）。由圖2可以看出，F(xiàn)A修飾后的微球（分散于蒸餾水中）在約283 nm出現(xiàn)一個(gè)吸收峰（b），與游離的FA分子在280 nm處的強(qiáng)吸收（c）表現(xiàn)一致。這說(shuō)明FA被成功連接到聚合物微球上。

圖2 聚合物微球紫外吸收?qǐng)D譜Fig 2 UV absorbance spectra of polymer microspheres

2.1.3 Zeta電位測(cè)試 將聚合物微球分別超聲分散于蒸餾水中，采用激光粒度分析儀分別檢測(cè)各聚合物微球的Zeta電位。其中，P（MAA-MBA）-EDA用磷酸鈉鹽緩沖溶液調(diào)至pH 4。聚合物微球P （MAA-MBA）、P（MAA-MBA）-EDA和P（MAAMBA）-EDA-FA的Zeta電位值（mV）分別為-48.3、-3.4、-46.6。這說(shuō)明加入EDA引入氨基，聚合物帶電性明顯正向移動(dòng)。

2.1.4 元素分析 取適量聚合物微球P（MAAMBA）、P（MAA-MBA）-EDA和P(MAA-MBA)-EDA-FA，分別測(cè)定其N(xiāo)含量為2.72%、3.78%、4.38%。

2.2 微球載藥性能研究 等量的P（MAA-MBA）-EDA-FA-AuNP微球分別與一系列不同初始濃度的DOX溶液混合，其載藥量和包封率如圖3所示。在一定范圍內(nèi)，P（MAA-MBA）-EDA-FA-AuNP微球的載藥量隨著DOX溶液初始濃度的增加而不斷增大，而包封率則隨著DOX溶液初始濃度的增加而不斷減小。當(dāng)DOX溶液的初始濃度為1206μg·mL-1時(shí)，微球的載藥量為198.4%，包封率為82.3%。此時(shí)，P（MAA-MBA）-EDA-FA-AuNP微球的載藥量達(dá)到飽和，不再隨初始DOX的量的增加而增大。

圖3 不同初始濃度DOX溶液下P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球的載藥量和包封率Fig 3 The drug loading capacity and encapsulation efficiency of P (MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP microspheres at different initial DOX concentrations

2.3 體外釋藥研究 本研究選擇負(fù)載DOX的P (MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球（載藥量為173.0%），在不同pH值（pH 5.5或7.4）和不同溫度（25℃或37℃）下對(duì)其釋藥行為進(jìn)行考察，其藥物累積釋放率對(duì)時(shí)間的折線(xiàn)圖見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在pH為7.4、溫度為25℃的緩沖液中，DOX的累積釋放率很低，僅約為18%；在pH為5.5溫度為37℃的緩沖液中DOX的累積釋放率最大，約為81%。當(dāng)溫度相同時(shí)pH為5.5的DOX累積釋放率均大于pH為7.4的DOX累積釋放率，當(dāng)pH相同時(shí)，37℃的DOX累積釋放率均大于25℃的DOX累積釋放率。由此說(shuō)明，在人體正常生理溫度條件下，載藥聚合物微球的釋放速率和累積釋放率大于室溫，且在內(nèi)環(huán)境為偏酸性的腫瘤細(xì)胞中的釋放速率和累積釋放率均大于其在內(nèi)環(huán)境偏堿性的人體正常細(xì)胞中的釋放速率和累積釋放率。

2.4 聚合物微球的細(xì)胞毒性研究

圖4 載DOX的P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球在不同pH和不同溫度下的藥物釋放曲線(xiàn)Fig 4 The controlled release of DOX from DOX-loaded P(MAAMBA)-EDA-FA-AuNP microspheres under different pH values,and at different temperatures

2.4.1 聚合物微球的細(xì)胞毒性檢測(cè) WST-1試驗(yàn)結(jié)果表明，P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球在高濃度（2 000 μg·mL-1）下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)依然無(wú)明顯影響，具備低毒性，見(jiàn)圖5。

圖5 P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球處理后MCF-7細(xì)胞的相對(duì)生存率Fig 5 Relative cellular viability of MCF-7 cells after treatment with P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP microspheres

2.4.2 載DOX聚合物微球和游離DOX的細(xì)胞毒性比較 本研究繼續(xù)采用WST-1實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估負(fù)載DOX（載藥量為173.0%）的P（MAA-MBA）-EDA-FA-AuNP微球?qū)δ[瘤細(xì)胞MCF-7的殺傷作用，以等量的DOX處理組作為對(duì)照。結(jié)果表明，載DOX微球與等量DOX具有相近的細(xì)胞毒性，見(jiàn)圖6。

圖6 游離DOX和負(fù)載DOX的P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP微球處理后MCF-7細(xì)胞的相對(duì)生存率Fig 6 Relative cellular viability of MCF-7 cells after treatment with free DOX and DOX-loaded P(MAA-MBA)-EDAFA-AuNP microspheres

3 討論

本課題用蒸餾-沉淀聚合法制備了一種表面光滑大小均一且具有腫瘤靶向性的藥物載體。該載體可以有效運(yùn)載抗腫瘤藥物DOX到達(dá)腫瘤部位，并通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將其運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)部，并在人體正常生理溫度及腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的酸性環(huán)境中實(shí)現(xiàn)pH/溫度雙重響應(yīng)性控制釋藥，提高DOX對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的同時(shí)降低了對(duì)正常組織和細(xì)胞的毒副作用。本課題初步評(píng)價(jià)了P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP聚合物微球作為抗腫瘤藥物輸送體系的潛力和優(yōu)勢(shì)。

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（2015-12-28收稿）

Preparation and application of pH/temperature double-responsive polymer microspheres on delivery of anti-tumor drugs

ZHU Ying
（Department of Pharmacy,The Second Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China）

Objective:To prepare pH/temperature dual stimuli responsive polymer microspheres on controlled release of anti-tumor drugs at normal human body temperature and in acid environment for tumor cells.Methods:The drug carrier microspheres with spherical mesh structure were synthesized via distillation-precipitation polymerization.Gold nanoparticles were deposited on the surface of obtained microspheres,and then the Au3+was reduced to Au°by chloroauric acid reduction method.Finally,the toxicity of microspheres was tested using cell experiments.Results:The polymer microspheres P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP were successfully synthesized,which showed pH/temperature controlled drug release characteristic and low toxicity even at high concentration.Conclusion:The advantages of polymer microspheres P(MAA-MBA)-EDA-FA-AuNP may function as a potential anti-tumor drug delivery system.

distillation-precipitation polymerization;pH;temperature;controlled drug release

1006－8147（2016）04-0354-05

R94

A

朱穎（1987-），女，藥師，碩士在讀，研究方向：藥劑學(xué)；E-mail:576195126@qq.com。