兩株芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解特性研究

雒曉芳，溫文靜，譚麗嬋，王 嬋，張 巍，熊 梅，龍子楊

（1.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

兩株芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解特性研究

雒曉芳1，溫文靜2，譚麗嬋2，王 嬋2，張 巍2，熊 梅2，龍子楊2

（1.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

目的：研究枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌在不同pH、溫度和鹽度條件下對多環(huán)芳烴萘、菲、芘的降解.方法：將多環(huán)芳烴萘、菲、芘做為惟一碳源，以活性炭為吸附載體，通過實驗測定菌株對萘、菲、芘的降解能力和脫氫酶活性大小，為進一步研究多環(huán)芳烴的降解提供理論依據(jù).結果：兩株芽孢桿菌在不同的溫度、pH、鹽度下培養(yǎng)48h后，得到各單因素的最適降解條件為溫度在35℃（pH＝7.0、鹽度為80mmol／L）時，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率和脫氫酶活性達到最高.在溫度為30℃（pH＝7.0、鹽度為40mmol／L）時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率和脫氫酶活性達到最高.結論：枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌在不同的溫度、酸度和鹽度條件下對萘、菲、芘的降解能力和脫氫酶活性各不相同，其中，酸度對枯草芽孢桿菌的影響最大，溫度對蘇云金芽孢桿菌的影響最大.而在相同條件下，兩種菌株對萘、菲的降解能力和脫氫酶活性均大于對芘的降解能力和脫氫酶活性，可見萘和菲的降解效果比芘的降解效果好.

枯草芽孢桿菌；蘇云金芽孢桿菌；降解率；脫氫酶活性

多環(huán)芳烴是指分子中的苯環(huán)含有2個以上所組成的碳氫化合物，如萘、蒽、菲、芘、三聯(lián)苯等［1］.許多多環(huán)芳烴都具有生物毒性以及難降解性，并且還具有生物累積性［2］，對人類和動物的生存及健康造成了很大的威脅.絕大多數(shù)的多環(huán)芳烴［3］是一種呈淡黃色或者無色的結晶，只有少數(shù)呈深色，具有較高的熔沸點，并且具有很小的蒸汽壓，在水中很難溶解.多環(huán)芳烴能夠使人發(fā)生畸變、導致人類發(fā)生癌變、致基因突變，對人類健康的危害極大［4］.土壤中的多環(huán)芳烴污染，是國外最早的研究方向.這個項目主要研究的是多環(huán)芳烴的來源、土壤中的遷移特性，環(huán)境行為的物理和化學的關系［5］.有研究表明，多環(huán)芳烴降解后產(chǎn)生的脫氫酶量、脫氫酶活性表現(xiàn)出同步變化關系，并隨著污染物的降解環(huán)境因素變化生物降解效率改變［6］，因而可以通過抑制降解菌的生長而影響、考察生物降解過程［7］.環(huán)境因素會影響微生物的活性，進而影響降解效果［8］.影響的因素有溫度、氧氣、水分、pH值等.多環(huán)芳烴具有相對穩(wěn)定的性質，雖然微生物有自然降解的能力，但是速度會變的非常慢.因此，需要通過人工的手段，來改變微生物的生活環(huán)境.加強微生物降解的能力，加快降解多環(huán)芳烴的速度，達到減少環(huán)境中多環(huán)芳烴的影響［9］.

本實驗主要以枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率和脫氫酶活性作為評價指標，研究在不同的pH值、溫度和鹽度條件下，兩株菌降解萘、菲、芘的能力，進而掌握兩株菌在不同因素作用下對萘、菲、芘的最適降解條件，對微生物降解多環(huán)芳烴的實際應用提供理論依據(jù).

1 菌種來源

實驗中使用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是由西北民族大學實驗中心微生物實驗室分離得到.

1.1 主要試劑

萘、菲、芘、活性炭、環(huán)己烷（以上試劑均為分析純）、氫氧化鈉、鹽酸、氯化三苯基四氮唑、甲苯、濃硫酸.

1.2 主要培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）.

2 實驗方法

2.1 實驗準備

取若干個50mL的錐形瓶，在錐形瓶中分別加入10g活性炭和0.5g萘、菲、芘.往錐形瓶中加入適量環(huán)己烷溶液將物質溶解，待環(huán)己烷完全揮發(fā)備用.

2.2 不同培養(yǎng)條件下菌株對萘、菲、芘的降解率及脫氫酶活性

加入10mL的菌液在處理好的萘、菲、芘三角瓶中，根據(jù)表1在相應的因素及水平條件下分別振蕩培養(yǎng)48h后，測定萘、菲、芘的降油率和脫氫酶活性，并作圖比較.

表1 試驗因素及水平

2.3 萘、菲、芘標準曲線的繪制

萘、菲、芘標準曲線的繪制參照汪如婷等的標準曲線的計算方法進行［10］.

3 結果與分析

3.1 不同培養(yǎng)條件下菌株對萘、菲、芘的降解

圖中A、B分別表示枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌.

圖1 不同pH條件下枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘降解率的影響

由圖1（a－b）可知，pH值對多環(huán)芳烴的降解率具有較大的影響.當pH不同時，菌株對同一底物在不同pH條件下的降解效果差異很大.當pH＜7.0時，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲和芘降解率隨之降低.當pH＝7.0時兩株芽孢桿菌對三種不同的多環(huán)芳烴降解效果最好 .枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率分別為：25.5%、33.7%、22.5%.蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率分別為：15.3%、14.6%、12.2%.當pH＞7.0時，隨著pH的升高，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率也隨之降低.因此，兩種菌株對多環(huán)芳烴降解的最佳pH為7.0，且枯草芽孢桿菌對同種多環(huán)芳烴的降解效果優(yōu)于蘇云金芽孢桿菌.

圖2 不同溫度條件下枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘降解率的影響

由圖2（a－b）可知，溫度對枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌降解多環(huán)芳烴具有較大的影響.隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株對萘、菲、芘的降解效果均上升.當溫度為35℃時，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率分別為：24.3%、28.2%、20.5%.在溫度為30℃時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率分別為：18.75%、16.3%、12.1%.當培養(yǎng)溫度在繼續(xù)升高時，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率也隨之降低.因此，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對多環(huán)芳烴降解的最佳溫度分別為35℃和30℃，且枯草芽孢桿菌對同種多環(huán)芳烴的降解效果優(yōu)于蘇云金芽孢桿菌.

圖3 不同溫度條件下枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘降解率的影響

由圖3（a－b）可知，鹽度對枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌降解多環(huán)芳烴具有較大的影響，且兩種菌株對萘、菲、芘的最適降解鹽度有所不同.隨著鹽度的升高，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解均上升.當鹽度為80mmol／L時對多環(huán)芳烴的降解率達到最大，對萘、菲、芘的降解率分別為：24.2%、27.1%、21.3%.當鹽在繼續(xù)升高時，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率將隨之降低.鹽度為40mmol／L～80 mmo／L時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率比較穩(wěn)定.當鹽度為40mmol／L時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率分別為：16.6%、15.1%、12.2%.當鹽度繼續(xù)升高時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的降解率隨之降低.因此，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對多環(huán)芳烴降解的最佳鹽度分別為80 mmol／L和40mmol／L，且枯草芽孢桿菌對同種多環(huán)芳烴的降解效果優(yōu)于蘇云金芽孢桿菌.

圖4 不同pH條件下枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘脫氫酶活性的影響

3.2 不同培養(yǎng)條件下菌株對萘、菲、芘的脫氫酶活性

圖4（a－b）為萘、菲、芘在不同pH值條件下脫氫酶活性的變化.結合圖1（a－b）可以看出，脫氫酶活性與降解率變化趨勢基本相同，脫氫酶活性與降解率之間可能存在一定相關性.脫氫酶活性的提高表明微生物生物活動頻繁，有利于多環(huán)芳烴的生物降解.在pH為5.0～7.0時，脫氫酶活性的升高趨勢較為明顯，同時降解率的增加也有明顯變化.當pH值為7.0時，二者的脫氫酶活性均達到最高值，此時兩株芽孢桿菌對三種不同的多環(huán)芳烴降解效果最好.枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性分別為：35.4（ug·mL－1）·h、32.1（ug·mL－1）·h、29.3（ug·mL－1）·h，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性分別為：28.1（ug·mL－1）·h、22.1（ug·mL－1）·h、18.1（ug·mL－1）·h.當pH＞7.0時，隨著pH的升高，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性也隨之降低.因此，選擇最佳pH值為7.0為宜.

圖5 不同溫度條件下枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘脫氫酶活性的影響

圖5為萘、菲、芘在不同溫度條件下脫氫酶活性的變化.由圖5（a－b）可知，溫度對枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌降解多環(huán)芳烴具有較大的影響.隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株對萘、菲、芘的脫氫酶活性均上升.當溫度為35℃時，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性分別為：33.3（ug·mL－1）·h、38.3（ug·mL－1）·h、31.5（ug·mL－1）·h.在溫度為30℃時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性分別為：29.1（ug·mL－1）·h、25.0（ug.mL－1）·h、22.2（ug·mL－1）·h.當培養(yǎng)溫度在繼續(xù)升高時，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性也隨之降低.因此，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的最佳溫度分別為35℃和30℃為宜.

圖6 不同鹽度條件下枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘脫氫酶活性的影響

圖6（a－b）為萘、菲、芘在不同鹽度條件下脫氫酶活性的變化.結合圖3（a－b）可以看出，脫氫酶活性與降解率變化趨勢基本相同，脫氫酶活性與降解率之間可能存在一定相關性.由圖6（a－b）可知，鹽度對枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌降解多環(huán)芳烴具有較大的影響，且兩種菌株對萘、菲、芘的最適降解鹽度有所不同.隨著鹽度的升高，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性均上升，當鹽度為80mmol／L時對多環(huán)芳烴的脫氫酶活性達到最大，對萘、菲、芘的脫氫酶活性分別為：32.3（ug·mL－1）·h、34.1（ug·mL－1）·h、28.2（ug·mL－1）·h.當鹽度繼續(xù)升高時，枯草芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性將隨之降低.鹽度為40mmol／L～80mmo／L時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性比較穩(wěn)定.當鹽度為40mmol／L時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性分別為：28.6（ug·mL－1）·h、26.5（ug·mL－1）·h、24.2（ug·mL－1）·h.當鹽度在繼續(xù)升高時，蘇云金芽孢桿菌對萘、菲、芘的脫氫酶活性將隨之降低.因此，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的最佳鹽度分別為80mmol／L和40mmol／L為宜.

4 結論

1）本實驗以多環(huán)芳烴中萘、菲、芘為惟一碳源，在同一培養(yǎng)條件下脫氫酶活性曲線圖與降解率曲線圖的變化趨勢基本相同.

2）在不同pH、溫度、鹽度條件下，菌株對同一底物的降解效果不同，且枯草芽孢桿菌對同種多環(huán)芳烴的降解效果優(yōu)于蘇云金芽孢桿菌.

3）兩種菌株對萘、菲的降解能力和脫氫酶活性均大于對芘的降解能力和脫氫酶活性.

4）枯草芽孢桿菌降解多環(huán)芳烴萘、菲、芘的最適降解溫度為35℃，最適降解pH為7.0，最適降解鹽度為80mmol／L；蘇云金芽孢桿菌降解多環(huán)芳烴萘、菲、芘的最適降解溫度為30℃，最適降解pH為7.0，最適降解鹽度為40mmol／L.

5）由圖1～6可知，pH、溫度、鹽度都會影響芽孢桿菌對多環(huán)芳烴萘、菲、芘的降解.其中，酸度對枯草芽孢桿菌的降解效果最大，溫度對蘇云金芽孢桿菌的降解效果最大.因此，選擇最適的降解條件，可為萘、菲、芘等多環(huán)芳烴的降解研究提供理論依據(jù)，從而實現(xiàn)對多環(huán)芳烴的最大程度的降解.

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Study on Degradation Characteristics of Naphthalene，Phenanthrene and Pyrene by two Strains of Bacillus

LUO Xiao-fang1，WEN Wen-jing2，TAN Li-chan2，WANG Chan2，ZHANG Wei2，XIONG Mei2，LONG Zi-yang2
（1.Center of Experiment，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China；2.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China）

Objective The present study aimed to investigate the degradation properties of polycyclic aromatic hydrocarbon naphthalene，phenanthrene and pyrene by Bacillus subtilis and Bacillus thuring－iensis under the different pH，temperature and salinity conditions.Methods Taking naphthalene，phenanthrene and pyrene as the unique source of carbon，and selected the ctivated carbon as adsorbent，the degradation ability and dehydrogenase activity of naphthalene，phenanthrene and pyrene were determined in this experiment.Results Both Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis strains were cultured under different temperature，acidity and salinity at 48h.Optimal degradation condition for each single factor was obtained.At a temperature of 35℃（pH＝7.0，salinity 80mmol／L），the degradation rate of naphthalene，phenanthrene and pyrene by Bacillus subtilis was the highest.the degradation rate of naphthalene，phenanthrene and pyrene by Bacillus thuringiensis was the largest at 30℃（pH＝7.0，salinity 40mmol／L）.Conclusion Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis had different degradation efficacy for naphthalene，phenanthrene and pyrene under the different conditions of temperature，acidity and salinity，additionally to dehydrogenase activity.Acidity and temperature had maximum effects on Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis，respectively.Howvere，Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis indued a higher degradation ability and dehydrogenase activity of naphthalene and phenanthrene than that of pyrene.It is showed that degradation effect of naphthalene and phenanthrene was better than that of pyrene.

Bacillus subtilis；Bacillus thuringiensis；Degradation rate；Dehydrogenase activity

X131.3

A

1009-2102（2016）03-0046-05

2016-08-20

2016年開放項目（SYSKF－2016228）.

雒曉芳（1980—），女，寧夏涇源人，碩士，副教授，主要從事環(huán)境微生物研究.