納米二氧化硅對(duì)人張氏肝細(xì)胞毒性作用研究

鐘建斌，馬 影，聶 聰，張 丹，馬建秀

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730030）

納米二氧化硅對(duì)人張氏肝細(xì)胞毒性作用研究

鐘建斌，馬 影，聶 聰，張 丹，馬建秀＊

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730030）

目的：以納米二氧化硅（SiO2）為研究對(duì)象，探討其對(duì)人張氏肝細(xì)胞（Chang liver cells）的毒性作用.方法：透射電子顯微鏡觀察納米SiO2粒徑、形態(tài)及分散性.體外培養(yǎng)人張氏肝細(xì)胞，將細(xì)胞分為對(duì)照組及納米SiO2暴露組.納米SiO2暴露濃度分別為12.5、25、50、100、200（mg·L－1），作用外周全血細(xì)胞和張氏肝細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)；四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞生存率；DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)；TRITC-Phalloidin染色觀察細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu).結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，納米SiO2引起人張氏肝細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；細(xì)胞胞體產(chǎn)生皺縮、變圓，細(xì)胞核固縮并出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)破壞.結(jié)論：納米SiO2作用于人張氏肝細(xì)胞會(huì)抑制細(xì)胞增殖，造成細(xì)胞形態(tài)改變，并呈現(xiàn)劑量依賴性.

納米二氧化硅；人張氏肝細(xì)胞；細(xì)胞骨架；細(xì)胞毒性

0 前言

近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料在涂料、催化劑、食品添加劑、藥物載體、醫(yī)學(xué)成像等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［1，2］.納米二氧化硅（silica nanoparticle）作為納米材料的重要一員，其在生產(chǎn)生活的應(yīng)用中不可避免地向周圍環(huán)境排放［3］.納米SiO2具有空氣動(dòng)力學(xué)直徑小，較微米級(jí)顆粒具有更高的表面活性，生物相容性和載體量等特性［4］，故納米SiO2更易通過(guò)呼吸、消化、皮膚等粘膜途徑進(jìn)入機(jī)體，經(jīng)過(guò)胞吞、內(nèi)化等各類轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入潛在的致敏靶點(diǎn)，對(duì)機(jī)體造成毒性反應(yīng)［5－7］.研究表明，納米SiO2會(huì)造成巨噬細(xì)胞（RAW264.7）生長(zhǎng)抑制、形態(tài)異常、超微結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞膜損傷［8］.另有研究發(fā)現(xiàn)，納米顆粒會(huì)明顯抑制卵巢細(xì)胞（CHO-K1），并造成胞體皺縮、變圓，細(xì)胞骨架微絲破壞等毒性反應(yīng)［9］.肝臟作為人體最重要的解毒器官，其在納米顆粒進(jìn)入人體過(guò)程中發(fā)揮了重要的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)作用.但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)納米SiO2造成人正常肝臟細(xì)胞毒性的研究較少，本研究選擇人張氏肝細(xì)胞（Chang liver cells）為研究對(duì)象，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察納米SiO2對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞核變化和細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的影響，旨在從細(xì)胞水平研究不同濃度納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞的毒性作用和可能的作用機(jī)制，為探討納米SiO2濃度效應(yīng)及生物毒性提供安全指導(dǎo).

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人張氏肝細(xì)胞由西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室提供.

納米SiO2（10nm）購(gòu)自中國(guó)基材科技有限公司；6孔板購(gòu)自美國(guó)Costar公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DAPI染液購(gòu)自美國(guó)Molecular probes公司；TRITC-Phalloidin羅丹明標(biāo)記鬼比環(huán)肽購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；其他本實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純.酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo產(chǎn)品，IX51熒光顯微鏡為日本O-lympus公司產(chǎn)品.

1.2 透射電子顯微鏡觀察納米SiO2的粒徑及分布情況

將納米SiO2溶液用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液配制，終濃度為50mg·L－1，使用超聲振蕩器超聲10min，將其滴到銅網(wǎng)中，在室溫下風(fēng)干.使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察粒子直徑、分布情況以及形態(tài)，并用Image-Pro plus軟件隨機(jī)測(cè)定300個(gè)粒子并計(jì)算得到顆粒平均粒徑.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人張氏肝細(xì)胞株使用含10%FBS的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞接種于6孔板24h后用于實(shí)驗(yàn).加入10nm SiO2懸液，調(diào)整終濃度為12.5、25、50、100、200（mg·L－1），正常對(duì)照組加入相同體積的1640培養(yǎng)基.將培養(yǎng)板置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到目標(biāo)時(shí)間.

1.4 人張氏肝細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況.

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

取對(duì)倍生長(zhǎng)期的人張氏肝細(xì)胞，用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108·L－1種植于96孔板，每孔100μL.培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)基并添加納米SiO2懸液，按實(shí)驗(yàn)方法1.3的要求設(shè)定正常對(duì)照組及5個(gè)納米SiO2暴露組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)24h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT（終濃度為0.5mg／mL），再培養(yǎng)4h，移去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，置搖床避光搖動(dòng)10min.待結(jié)晶完全溶解，490nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞抑制率.

細(xì)胞抑制率＝（1－各組OD值÷對(duì)照組OD值）×100%

1.6 DAPI染色觀察細(xì)胞核結(jié)構(gòu)

調(diào)整PBMC濃度1×109·L－1后接種于6孔板中，每孔1mL.按實(shí)驗(yàn)方法1.3的要求設(shè)定正常對(duì)照組及5個(gè)納米SiO2暴露組，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h.按試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)人張氏肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核染色，染色結(jié)束后置于Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察，與正常對(duì)照組進(jìn)行比較.

1.7 TRITC-Phalloidin染色觀察PBMC微絲

調(diào)整PBMC濃度1×109·L－1后接種于6孔板中，每孔1mL.按實(shí)驗(yàn)方法1.3的要求設(shè)定正常對(duì)照組及5個(gè)納米SiO2暴露組，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h.按試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)人張氏肝細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞微絲染色，染色結(jié)束后置于Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察，與正常對(duì)照組進(jìn)行比較.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 納米SiO2的形貌及分散性

圖1結(jié)果顯示，納米SiO2分布存在輕度聚集，大小較均勻，顆粒形態(tài)呈球形，分散性較好，使用Image–Pro plus軟件分析得到顆粒粒徑為（10.42±1.65）nm.

圖1 透射電子顯微鏡觀察納米SiO2的粒徑及分布情況

2.2 納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比（圖2A），當(dāng)納米SiO2暴露濃度為12.5mg·L－1和25mg·L－1時(shí)對(duì)人張氏肝細(xì)胞形態(tài)并不產(chǎn)生明顯影響（圖2B、圖2C）.而當(dāng)暴露濃度增加至50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體皺縮、變圓，并產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞碎片，細(xì)胞密度明顯降低并脫落（圖2D、圖2E、圖2F）.

圖2 倒置顯微鏡下觀察納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞增殖抑制率的影響

表1 MTT法檢測(cè)納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n＝6）

表1 MTT法檢測(cè)納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n＝6）

注：與正常對(duì)照組比較，?P＜0.05,??P＜0.01.

Group Dose(mg·L-1) Inhibitionrates(24h)（%） Inhibitionrates(48h)（%）Control 0 0 0 12.5 39.9±4.1** 43.2±1.8** 25 55.8±4.4** 64.7±1.3** 50 64.6±2.7** 79.2±1.4** 100 68.3±2.1** 81.7±1.6** 200 71.1±0.7** 82.6±1.1** Silica nanoparticle

表1和圖3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，各濃度的納米SiO2暴露組均可對(duì)人張氏肝細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯的抑制現(xiàn)象.尤其暴露濃度為200mg·L－1，作用細(xì)胞24h和48h后，其對(duì)細(xì)胞的抑制率可分別達(dá)到（71.1±0.7）%和（82.6±1.1）%，與正常對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）.

圖3 MTT法檢測(cè)納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，n＝6）

2.4 納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞核的影響

圖4結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比（圖4A），當(dāng)納米SiO2暴露濃度為12.5mg·L－1和25mg·L－1時(shí)對(duì)人張氏肝細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響（圖4B、圖4C）.而當(dāng)暴露濃度增加至50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時(shí)，人張氏肝細(xì)胞細(xì)胞核明顯發(fā)生固縮，并出現(xiàn)空泡化，呈現(xiàn)明顯凋亡核現(xiàn)象（圖4D、圖4E、圖4F）.

圖4 DAPI染色觀察納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞核形態(tài)的影響

2.5 納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的影響

圖5結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比（圖5A），當(dāng)納米SiO2暴露濃度為12.5mg·L－1和25mg·L－1時(shí)對(duì)人張氏肝細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響（圖5B、圖5C）.而當(dāng)暴露濃度增加至50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時(shí)，人張氏肝細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)被明顯破壞（圖5D、圖5E、圖5F）.

3 討論

肝臟是納米SiO2的主要靶器官，當(dāng)納米SiO2進(jìn)入機(jī)體后可通過(guò)血液循環(huán)或淋巴液循環(huán)到達(dá)肝臟系統(tǒng)，進(jìn)而造成肝細(xì)胞的毒性損傷［10］.納米SiO2的生物學(xué)效應(yīng)與其粒徑和暴露濃度密切相關(guān)，粒徑越小，顆粒表面能和比表面積則越大，從而使納米SiO2具有很高的反應(yīng)活性［11，12］.投射電子顯微鏡結(jié)果顯示，本次研究納米SiO2在細(xì)胞培養(yǎng)基中存在輕微的團(tuán)聚現(xiàn)象.這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與納米SiO2存在極高的表面能以及培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)或培養(yǎng)基中存在的其他成分有關(guān)，但相關(guān)研究表明納米SiO2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之后，團(tuán)聚現(xiàn)象即會(huì)消失［13］.研究表明，納米SiO2會(huì)導(dǎo)致RAW264.7巨噬細(xì)胞貼壁數(shù)量減少，細(xì)胞周圍有納米粒子黏附，并造成細(xì)胞崩解現(xiàn)象［8］.本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，不同濃度的納米SiO2作用于人張氏肝細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞胞體皺縮變圓，細(xì)胞密度明顯降低、脫落，并產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞碎片.提示納米SiO2作用于人張氏肝細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞會(huì)造成嚴(yán)重的損傷.本研究運(yùn)用MTT法測(cè)定納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞增殖抑制率時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，納米SiO2作用于人張氏肝細(xì)胞后會(huì)明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囮P(guān)系.相類似的研究也同樣表明，納米SiO2作用于人肺腺癌A549細(xì)胞后會(huì)明顯導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降，同時(shí)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性［14］.細(xì)胞凋亡在組織形態(tài)學(xué)上會(huì)表現(xiàn)為形成球形或卵球形細(xì)胞質(zhì)并出現(xiàn)胞漿碎片細(xì)胞核固縮和空泡化［15］.在本次研究中我們觀察到，當(dāng)納米SiO2暴露濃度為50mg·L－1、100mg·L－1和200mg·L－1時(shí)作用于人張氏肝細(xì)胞24h后，其細(xì)胞核發(fā)生了明顯的固縮和空泡化現(xiàn)象，提示納米SiO2可能誘導(dǎo)了人張氏肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生.在人張氏肝細(xì)胞骨架的微絲結(jié)構(gòu)研究中我們也同樣發(fā)現(xiàn)，在高濃度組處理后，人張氏肝細(xì)胞骨架微絲發(fā)生斷裂，骨架結(jié)構(gòu)被明顯破壞.相關(guān)研究也表明納米顆粒會(huì)造成細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的破壞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生毒性損傷［9］.

圖5 TRITC-Phalloidin染色觀察納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的影響

本研究主要針對(duì)納米SiO2對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，選擇體外細(xì)胞培養(yǎng)方法初步探討了納米SiO2對(duì)人張氏肝細(xì)胞的毒性損傷作用，但其作用的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清晰，需要進(jìn)一步深入研究.參考文獻(xiàn)：

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R114

A

1009-2102（2016）04-0071-06

2016-08-02

西北民族大學(xué)2016年本科生科研項(xiàng)目（URIP16318，UPIP16317）；西北民族大學(xué)2016年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610742002）.

＊

鐘建斌（1994—），男（畬族），浙江麗水人.