李 菲， 王 忠， 卞文印， 黃寶菊

(安發(fā)(福建)生物科技有限公司， 福建 寧德 352100)

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添加蠶蛹粉對蛹蟲草生長及子實體有效成分的影響

李 菲， 王 忠， 卞文印， 黃寶菊

(安發(fā)(福建)生物科技有限公司， 福建 寧德 352100)

在大米培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉，分析添加蠶蛹粉對蛹蟲草菌絲體生長狀況，子實體生長情況以及子實體有效成分蟲草素、蟲草多糖含量的影響。試驗結(jié)果表明：蠶蛹粉添加量為6 g時，子實體生長狀態(tài)最佳，畸形率最低、出草率最高、平均高度最高，干品產(chǎn)量最高，達到(5.36±0.087) g·瓶-1；在蠶蛹粉量為8 g時，蟲草素與總蟲草素的含量最高，分別達到(7.39±0.095) mg·g-1和(34.06±0.164) mg·瓶-1；在蠶蛹粉量為6 g時，蟲草多糖及總蟲草多糖的含量最高，分別達到(23.26±0.086) mg·g-1和(124.67±0.089) mg·瓶-1。試驗結(jié)果為蛹蟲草產(chǎn)業(yè)化栽培及深層開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

蛹蟲草; 蠶蛹粉; 菌絲體; 子實體; 蟲草素; 蟲草多糖

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬蟲夏草，屬于真菌門、子囊菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬。經(jīng)研究表明，蛹蟲草含有豐富的生物活性成分，蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等。蟲草素是一種核苷類抗生素，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善新陳代謝、清除自由基等多種藥理作用，具有中醫(yī)醫(yī)理中冬蟲夏草一樣的陰陽同補和雙向調(diào)節(jié)人體平衡的功能。蟲草多糖具有抗癌活性，能對腫瘤起抑制作用，亦可增強機體對各種病菌、病毒、真菌及寄生蟲的抵抗力(張平等，2003)。目前冬蟲夏草資源逐漸枯竭，蛹蟲草由于其有效成分與冬蟲夏草相似、甚至高于野生冬蟲夏草的特性，已漸漸成為冬蟲夏草替代品(高懷安等，1987)。近年來，蛹蟲草栽培已進入規(guī)?；a(chǎn)，但仍舊面臨著菌種退化、產(chǎn)量下降、質(zhì)量下降等各種問題。目前關(guān)于培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉的研究主要集中在對子實體產(chǎn)量及個別活性成分方面的影響，而蛹粉代料培養(yǎng)(申鴻等，2012)更是成本太高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。本試驗系統(tǒng)研究添加不同量蠶蛹粉對蛹蟲草整個生長過程及子實體主要活性成分的影響，得出高產(chǎn)高質(zhì)條件下的最適蠶蛹粉添加量，為高產(chǎn)高質(zhì)量蛹蟲草栽培及蛹蟲草深層開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料及試劑 蛹蟲草菌母種，由安發(fā)(福建)生物科技有限公司研發(fā)中心實驗室提供。

葡萄糖、蔗糖購自廣東光華化學廠有限公司；瓊脂、硫酸鎂、維生素B1、蛋白胨、磷酸二氫鉀購自天津市福晨化學試劑廠；蠶蛹粉購自西安漁人樂制餌廠；蟲草素、甘露醇標樣購自大連美侖生物科技有限公司；甲醇(色譜純)、四氫呋喃(色譜純)購自武漢思儀科技有限公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚(分析純)購自天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司。

1.1.2 主要儀器 450 mL的栽培瓶；250 mL的三角瓶；試管；JA1003N電子天平；SW-CJ-1A超凈工作臺；LDZX-50FB高壓滅菌鍋；SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱；BSD-YX2200搖床；接種槍；TES1330A照度計；MS6508數(shù)顯溫濕度計；Waters高效液相色譜儀；Waters2487紫外檢測器；Part No.wato45905C18(4.6 mm×150 mm)色譜柱；漢邦C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；0.5 μm水相微孔濾膜；恒溫水浴鍋；722分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 用于菌種分離培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，MgSO40.5 g,KH2PO41.0 g,VB10.1 g，pH自然值。

用于培養(yǎng)菌絲體的液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g,MgSO4 1.0 g,KH2PO42.0 g, VB10.1 g，pH自然值，分裝至三角瓶。

用于栽培的培養(yǎng)基：以不添加蠶蛹粉的培養(yǎng)基作為對照(CK)，分別添加蠶蛹粉2、4、6、8、10、12 g，依次為試驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。每瓶大米30 g，營養(yǎng)液42 mL(營養(yǎng)液配方：蔗糖20 g，蛋白胨5 g,MgSO41.0 g,KH2PO42.0 g,VB10.1 g,水1 000 mL,pH自然值)。

1.2.2 菌種活化 將蛹蟲草母種進行分離接種至斜面試管，放置于生化培養(yǎng)箱中18 ℃下培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第4 d開始每天進行10 h光照培養(yǎng)，7 d左右獲得生產(chǎn)菌種。

1.2.3 液體菌種制備 在超凈工作臺下，將試管菌切成小碎塊，接種至液體培養(yǎng)基中，溫度20 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，后置于搖床內(nèi)120 r·min-1下進行振蕩培養(yǎng)6 d左右，獲得液體接種菌。

1.2.4 接種 超凈工作臺無菌環(huán)境下，將液體菌種稀釋5倍，每瓶大米培養(yǎng)基接種5 mL的液體菌種。

1.2.5 后期管理 將接過菌種的培養(yǎng)瓶放置培養(yǎng)室內(nèi)，溫度18 ℃，相對濕度50%-60%條件下進行黑暗培養(yǎng)10 d左右，至菌絲吃透培養(yǎng)基并覆蓋了整個培養(yǎng)基；發(fā)菌完成后開始進行弱光照培養(yǎng)，光照度200-400 lx，光照時長10 h·d-1，溫度20 ℃，相對濕度70%-80%條件下培養(yǎng)6 d左右，至培養(yǎng)基完全轉(zhuǎn)為橙色；轉(zhuǎn)色后即可進行溫差處理，刺激原基分化，溫差控制在5-8 ℃，其他條件維持不變，培養(yǎng)5 d左右，至有較多小刺尖狀突起形成；原基分化后開始進行恒溫培養(yǎng)，溫度22 ℃，相對濕度80%-90%，光照700-1 000 lx，光照時長12 h·d-1條件下培養(yǎng)35 d左右,采收60 ℃烘干。

1.2.6 有效成分含量測定 將子實體干品磨成粉末，過100目篩，每個試驗組取適量用于有效成分的含量測定。

蟲草素測定方法參照《中國藥典》，采用HPLC法測定蟲草素含量(顧振宇等，2007)。

蟲草多糖：提取蟲草多糖，取每組樣品粉末，以無水乙醇提取10 h除去脂溶性成分，自然風干，取脫脂后的殘渣，用水浴70 ℃恒溫提取2次，過濾，取濾液減壓濃縮，濃縮液以Savag法除去蛋白質(zhì)，最后移入100 mL的容量瓶中，冷卻定容備用。葡萄糖標準曲線繪制，精確稱取葡萄糖200 mg，置于100 mL容量瓶中，定容搖勻，取1 mL溶液溶于50 mL容量瓶中定容搖勻，備用。分別吸取標準溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,用蒸餾水補充至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1 mL，靜止10 min,搖勻，靜置20 min，于490 nm處測定吸光值，以2.0 mL蒸餾水作為空白，得到回歸方程：A=0.0089C+0.0117，r=0.995。其中，A為吸光值，C為葡萄糖濃度。含量測定，精密吸取樣品處理液1.0 mL，置于10 mL比色管中，加水補足至2.0 mL，樣品管和空白管中加入苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，于490 nm處，以空白校正零點，用1.0 mL比色皿測吸光度(盧曉巖，2002；王蕾等，2003)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件處理后，使用SPSS 22.0軟件獲得平均值及標準誤差。對不同處理間的差異進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蠶蛹粉添加量對菌絲生長的影響

由表1可知，添加蠶蛹粉，菌絲生長狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，生長速度明顯提高。與其他組相比，當添加蠶蛹粉量為6 g和8 g時，菌絲生長狀態(tài)、菌絲生長速度均相差不大，且明顯優(yōu)于其他組；當添加量繼續(xù)增多時，菌絲生長狀態(tài)、生長速度均有下降。試驗結(jié)果表明，添加蠶蛹粉量在6-8 g時，更有利于菌絲生長。

表1 添加不同量蠶蛹粉對菌絲生長的影響1)

Table 1 Effect of different amount of silkworm pupa powder on growth of mycelium

處理菌絲形態(tài)菌絲色澤菌絲密度生長速度/(mm·d-1)CK瘦弱淺白稀疏1.24±0.012cⅠ較健壯白較稀疏2.41±0.035bⅡ較健壯白較稀疏2.68±0.041bⅢ健壯潔白濃密3.72±0.032aⅣ健壯潔白濃密3.86±0.065aⅤ較健壯白較稀疏2.71±0.087bⅥ瘦弱淺白稀疏2.52±0.029b

1)同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。

2.2 不同蠶蛹粉添加量對子實體生長的影響

由表2可知，隨著蠶蛹粉添加量的增多，子實體生長狀態(tài)呈先好轉(zhuǎn)后下降的趨勢，在添加量為6 g時，子實體生長狀態(tài)最佳，畸形率最低、出草率最高、平均高度最高，干品產(chǎn)量最高，達到(5.36±0.087) mg·瓶-1。在添加量達到10 g以上時，出草率明顯降低，且低于CK，分析其原因可能是由于蠶蛹粉量過多，培養(yǎng)基黏性太大，從而能影響子座抽生。

表2 添加不同量蠶蛹粉對子實體生長的影響1)

Table 2 Effect of different amount of silkworm pupa powder on growth of sporocarp

處理畸形率/%出草率/%平均高度/cm干品產(chǎn)量/(g·瓶-1)CK39.84±0.066a48.94±0.073bc4.63±0.061c1.87±0.053cⅠ30.13±0.085b70.24±0.093b6.15±0.073b3.27±0.084bⅡ29.86±0.056b71.08±0.053b6.21±0.068b3.40±0.072bⅢ18.25±0.093c98.53±0.071a9.46±0.069a5.36±0.087aⅣ24.17±0.067bc90.16±0.058a9.05±0.082a4.61±0.061abⅤ30.46±0.062b43.87±0.065c7.38±0.063ab3.01±0.073bⅥ30.24±0.074b40.42±0.064c7.17±0.092ab2.96±0.078b

1)同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。

2.3 不同蠶蛹粉添加量對子實體有效成分含量的影響

由表3可知，試驗組蟲草素、蟲草多糖含量均高于CK。隨著蠶蛹粉量的增加，蟲草素呈先增加后降低的趨勢，蟲草多糖的含量呈現(xiàn)先增多后減少再增多的趨勢。在蠶蛹粉量為8 g時，蟲草素與總蟲草素的含量最高，分別達到(7.39±0.095) mg·g-1和(34.06±0.164) mg·瓶-1；在蠶蛹粉含量為6 g時，蟲草多糖及總蟲草多糖的含量最高，分別達到(23.26±0.086) mg·g-1和(124.67±0.089) mg·瓶-1。試驗結(jié)果表明，添加蠶蛹粉有利于子實體中主要有效成份蟲草素及蟲草多糖含量的形成積累。

表3 添加不同量蠶蛹粉對子實體有效成分含量的影響1)

Table 3 Effect of different amount of silkworm pupa powder on active principle content of sporocarp

處理蟲草素含量/(mg·g-1)總蟲草素含量/(mg·瓶-1)蟲草多糖含量/(mg·g-1)總蟲草多糖含量(mg·瓶-1)CK2.48±0.062d4.64±0.162d11.51±0.064d21.52±0.187dⅠ3.35±0.087cd10.95±0.136c16.49±0.076c53.92±0.173cⅡ4.43±0.075c15.06±0.192bc19.72±0.063b67.05±0.202bcⅢ5.32±0.068b28.51±0.146b23.26±0.086a124.67±0.089aⅣ7.39±0.095a34.06±0.164a17.43±0.073c80.35±0.194bⅤ4.36±0.083c13.12±0.157bc20.64±0.083b62.13±0.132bcⅥ4.07±0.072c12.05±0.203bc20.35±0.092b60.23±0.17bc

1)同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。

3 結(jié)論與討論

蛹蟲草栽培過程中充足的營養(yǎng)成份是高質(zhì)高產(chǎn)的關(guān)鍵性因素之一，而蠶蛹粉因其富含各種營養(yǎng)成份而成為蛹蟲草栽培過程中常用的添加物。研究結(jié)果表明，隨著蠶蛹粉添加量的增多，菌絲體生長狀態(tài)及生長速度、子實體生長狀態(tài)及產(chǎn)量均呈先提高后降低的趨勢，這可能是由于在蠶蛹粉含量越來越多時，培養(yǎng)基粘度增大，阻礙了其生長，這與葉晶晶等(2013)關(guān)于子實體產(chǎn)量研究的結(jié)果一致；在蠶蛹粉添加量達到10 g時，出草率甚至低于CK，說明過量的蠶蛹粉對出草的影響較大；添加蠶蛹粉能夠明顯提高子實體中有效成分的含量，且隨著添加量的增多，蟲草素含量呈現(xiàn)增加后降低的趨勢，蟲草多糖呈現(xiàn)先增多后減少又增多的現(xiàn)象，可能是由于蟲草素是蛹蟲草的一種次級代謝產(chǎn)物，而蟲草多糖作為蛹蟲草代謝過程中的初級產(chǎn)物是蟲草素形成的一種中間產(chǎn)物，具體影響機制還有待研究。

由試驗得知，每30 g大米培養(yǎng)中，添加蠶蛹粉6-8 g時，菌絲生長狀態(tài)最佳，生長速度最快，達到(3.72±0.032)-(3.86±0.065) mm·d-1；添加蠶蛹粉6 g時，子實體產(chǎn)量最高，達到(5.36±0.087) g·瓶-1，蟲草多糖含量也最高，達到(124.67±0.089) mg·瓶-1；當蠶蛹添加量為8 g時，子實體中蟲草素的含量達到最高值為(34.06±0.164) mg·瓶-1。為規(guī)模化生產(chǎn)蛹蟲草及其有效成分的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)支撐，本試驗所利用蠶蛹粉價格低廉、操作簡便，也符合蛹蟲草產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的趨勢。

盧曉巖,2002.硫酸苯酚法測定北冬蟲夏草多糖含量[J].食品工業(yè)科技,23(4):69-70.

高懷安,陳世中,王麗榮,等,1987.秦巴蛹蟲草與冬蟲夏草某些化學成分的對比研究[J].中藥通報,12(2):44-45.

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(責任編輯：陳曉雯)

Effect of adding silkworm pupa powder on growth ofCordycepsmilitarisand active principle of sporocarp

LI Fei, WANG Zhong, BIAN Wen-Yin, HUANG Bao-Ju

(Alpha(Fujian)Bio-technologyCo.Ltd.,Ningde,Fujian352100,China)

The effect of silkworm pupa powder (SPP) on growth ofCordycepsmilitarisand active principle (cordycepin and cordyceps polysaccharide) of sporocarp were anlyzed by adding SPP into the rice medium. The results showed that when the SPP amount was added by 6 g, the sporocarp grew best, with lowest deformity rate and highest average height, and the highest yield reached (5.36±0.087) g·bottle-1; while it was added by 8 g, the content of cordycepin and the total cordycepin is highest, reaching (7.39±0.095) mg·g-1and (34.06±0.164) mg·bottle-1respectively; while it was added by 6 g, the content of cordyceps polysaccharide and total cordyceps polysaccharide was highest, reaching (23.26±0.086) mg·g-1and (124.67±0.089) mg·bottle-1respectively. This results would provide a reference for industrialization cultivation and deep development ofC.militaris.

Cordycepsmilitaris; silkworm pupa powder; mycelium; sporocarp; cordycepin; cordyceps polysaccharide

2016-08-23; 發(fā)表日期： 2016-10-31

李菲(1991-)，女，本科。研究方向：蛹蟲草栽培。Email：lfco313030679@sina.com。

S567.3+5

A

1001-4276-(2016)01-0069-05

李菲,王忠,卞文印,等,2016.添加蠶蛹粉對蛹蟲草生長及子實體有效成分的影響[J].武夷科學，32：69-73.