致病性大腸桿菌現(xiàn)狀分析及檢測技術(shù)研究進展

衛(wèi)昱君王紫婷徐瑗聰，2許文濤，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100083）

致病性大腸桿菌現(xiàn)狀分析及檢測技術(shù)研究進展

衛(wèi)昱君1王紫婷1徐瑗聰1，2許文濤1，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100083）

致病性大腸桿菌是一類常見的致病菌，能夠通過多種感染渠道導致大腸桿菌感染疫情大規(guī)模爆發(fā)，其耐藥性的出現(xiàn)引起廣泛擔憂的同時，也促進了新型抑菌方式的研究。目前大腸桿菌風險毒力因子作為致病的直接因素，備受國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。大腸桿菌檢測技術(shù)也相應(yīng)獲得了較快的發(fā)展，相較傳統(tǒng)方法，新型的病原菌檢測技術(shù)能夠快速、特異、準確地檢測目標菌。結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀從大腸桿菌的污染情況、感染途徑及癥狀、耐藥性、風險毒力因子及檢測方法等方面綜述了大腸桿菌毒力評估及檢測技術(shù)研究進展。

致病性大腸桿菌；現(xiàn)狀分析；檢測技術(shù)

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱為大腸桿菌，為埃希氏菌屬的代表菌種。有鞭毛及動力，為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌為兼性厭氧菌，生長溫度范圍是8-46℃，最適生長溫度為37℃。其菌體抗原為“O”型抗原，鞭毛抗原為“H”型抗原，表面抗原為“K”型抗原，根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)的差異被分為180多種血清型別。致病性大腸桿菌是指能產(chǎn)生和攜帶腸毒素（LT、ST和SLT）、定居因子（CFA-Ⅰ和CFA-Ⅱ）、K抗原或類似物質(zhì)，以及帶有性菌毛、能分泌內(nèi)毒素的大腸桿菌。根據(jù)其不同的生物學特性可將致病性大腸桿菌分為6種類型［1］：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、 腸侵襲性大腸埃希桿菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. coli，EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）及彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）。

自1885年Esherich發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌以來，人們通常將其認作腸道菌群中的正常組成部分。直到1982年，Riley和Remis等［2］通過對當時美國密歇根州和俄勒岡州爆發(fā)的伴有腹瀉和腸出血的腸道疾病進行調(diào)查研究，首次發(fā)現(xiàn)這種不同尋常的腸道疾病是由腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染所引起的，人們才意識到大腸桿菌具有致病性。此后30多年，致病性大腸桿菌引發(fā)的食物中毒事件不勝枚數(shù)［3，4］，事件爆發(fā)后需要對污染的菌體進行分析鑒定，明確其致病機制、耐藥情況等，才能對診斷做出有效的判定。因此探究致病性大腸桿菌的污染情況，能夠更加明確其容易侵染的基質(zhì)，為食物中毒事件的分析提供參考；總結(jié)致病性大腸桿菌的感染機制及癥狀能夠協(xié)助對病發(fā)狀態(tài)做出更加準確的分析；分析耐藥性、致病因子及現(xiàn)有檢測技術(shù)能夠進一步研究新型快檢技術(shù)以及核酸診斷藥物等，對治療具有重要意義?；诖?，本文結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀從污染情況、感染途徑及癥狀、耐藥性、風險毒力因子及檢測方法等方面綜述了致病性大腸桿菌的現(xiàn)狀分析及檢測技術(shù)研究進展。

1 污染情況及限量情況

1.1 生物體污染

大腸桿菌O157所引起的疾病屬于人畜共患病，其中動物為重要的傳染源，可于宰前感染［5］，較常見的有牛、雞、羊、狗、豬等，動物的糞便中也常常能夠分離出O157∶H7大腸桿菌。其中以牛的帶菌率最高，可高達16%。

大腸桿菌常寄生于家畜及其奶中，或是被家畜糞便污染了的水中，以及用被污染了的水灌溉的作物中。人們食用了這些被污染過的食品，就可能引發(fā)腹瀉等癥狀。世界范圍內(nèi)爆發(fā)的嚴重大腸桿菌感染事件中，幾乎都是由食物傳播引起的。屠宰與加工中的污染，肉類帶大腸桿菌，在加工烹調(diào)過程中加熱不徹底或生吃都會導致進食者感染［6］。

1.2 環(huán)境污染

大腸桿菌O157引起的環(huán)境污染主要在于土壤及水源。目前我國有關(guān)污水和禽畜糞便等隨意排放導致病原微生物污染環(huán)境的報道屢見不鮮［7］。腸道致病性微生物也是土壤中最為常見的病原菌，主要是通過糞肥的施用進入土壤，Gagliardi等［8］通過研究發(fā)現(xiàn)土壤中的大腸桿菌O157∶H7還具有向地表和地下遷移的特性。

在我國，類似的污染也不時被報道。周淑玉等［9］報道稱，用污水灌溉的土壤中糞大腸桿菌的檢出率高達93.9%。朱奇等［10］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，使用被大腸桿菌及腸道致病菌污染的水源水灌溉導致2000年聊城上市蔬菜中，高達47%都受到不同程度的污染。由此可見，土壤與水源都是大腸桿菌污染傳播的重要媒介。葉小梅等［11］對江蘇省10家畜禽養(yǎng)殖場的排放物及周邊水、土樣進行了分析，并以糞大腸菌群和沙門菌為指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10家養(yǎng)殖場中有9家廢物排放不合格，其中糞大腸菌群全部嚴重超標，施于土壤的糞肥中糞大腸菌群數(shù)在105/g以上，此外，從中分離出的大腸桿菌能夠表現(xiàn)出多重耐藥性。

大腸桿菌極易通過土壤作物進入人類食物鏈，引發(fā)大規(guī)模的傳染，因此保護灌溉水源及使用經(jīng)過無害化處理的糞肥也是生態(tài)環(huán)境保護的重要工作。

1.3 國內(nèi)外對于大腸桿菌的限量情況

針對致病菌的限量，不同的國家和地區(qū)有著相似標準，但食品微生物限量指示菌在不同的食品中標準限量值的差異很大［5］。歐盟對市場銷售的27類食品進行了微生物限量規(guī)定。以總菌落數(shù)、大腸埃希氏菌、腸桿菌科指示菌限量，對水果、蔬菜及其制品、乳與乳制品、肉及肉制品，以及水產(chǎn)品、蛋制品的加工進行了規(guī)范。歐盟對大腸埃希氏菌的限量采用三級采樣手段，在市場銷售的產(chǎn)品中僅限定了水產(chǎn)品，限量為n=1，c=0，m=230 MPN/100 g；在生產(chǎn)加工中限定的種類較多，規(guī)定在加工過程中果蔬制品及乳制品的限量為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g；生產(chǎn)過程結(jié)束時加工生鮮肉的限量為n=5，c=2，m=50 MPN/g，M=500 MPN/g；乳制品的限量為n=5，c=2，m=10 MPN/g，M=100 MPN/g；水產(chǎn)品限量為n=5，c=2，m=1 MPN/g，M=10 MPN/g。澳大利亞、新西蘭微生物通用標準中，共26類食品涉及到微生物限量，其中14類食品具有指示菌限量，其中對大腸埃希氏菌做出限量的食品共有9種，在這9種食品中，礦泉水、瓶裝水、定型包裝的冰及豆腐中均不得檢出大腸埃希氏菌。此外，干酪中要求n=5，c=1，m=10 MPN/g，M=100 MPN/g，未經(jīng)巴氏消毒牛乳中要求n=5，c=1，m=3 MPN/g，M=9 MPN/g，肉粉中要求n=5，c=1，m=3.6 MPN/g，M=9.2 MPN/g，雙貝殼類軟體動物要求n=5，c=1，m=2.3 MPN/g，M=7 MPN/g。加拿大主要對果蔬、乳制品、即食食品中菌落總數(shù)、大腸菌群作出限量以進行規(guī)范，22種具有指示菌限量的食品中，有15種對大腸桿菌做出限量。其中巴氏消毒奶制備的奶酪限定標準為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M= 2 000 MPN/g，非巴氏消毒奶制備的奶酪限定標準為n=5，c=2，m=500 MPN/g，M=2 000 MPN/g，嬰兒配方食品的限定標準為n=5，c=1，m＜1.8 MPN/g，M=10 MPN/g，面制品及焙烤食品的限定標準為n=5，c=2，m＜1.8 MPN/g，M=1 000 MPN/g，經(jīng)熱處理的發(fā)酵香腸的限定標準為n=5，c=1，m=10 MPN/g，M= 1 000 MPN/g，生的發(fā)酵香腸的限定標準為n=5，c=1，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g，即食類香腸、豆制品、調(diào)味品以及鮮果蔬等的限定標準為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g。

在我國于2010年新發(fā)布的15項乳制品產(chǎn)品標準中，針對11種產(chǎn)品規(guī)定了大腸菌群限量標準，分別是巴氏殺菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、煉乳、乳粉、稀奶油/奶油/無水奶油、干酪、再制干酪、嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品以及嬰幼兒谷類輔助食品。在《GB29921-2013 食品安全國家標準食品中致病菌限量》中，要求牛肉制品和生食果蔬制品中不得檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，其他無說明。香港只是在即食食品中規(guī)定了菌落總數(shù)、大腸埃希氏菌的限量，要求大腸埃希氏菌的檢出量為20-100 CFU/g，方可認定為滿意級別。

2 大腸桿菌感染機制途徑與癥狀

2.1 感染途徑

根據(jù)眾多致病性大腸桿菌引發(fā)的食物中毒事件的分析可知，大腸桿菌的感染途徑有3種方式：食物傳播、水傳播、親密接觸傳播，其中食物傳播為最主要的感染途徑。在過去的40年內(nèi)，較為嚴重的大腸桿菌爆發(fā)事件均是通過食物傳播引起的，例如美國爆發(fā)的O157食物中毒基本都與漢堡包肉餡有關(guān)，1996年日本爆發(fā)的疫情與進食牛肉、牛肝有關(guān)。另外，牛奶及其制品、生蔬菜、飲料等也常作為傳播介質(zhì)，這些都是通過食品進行傳播的。通過水進行傳播主要是由糞便污染導致的。此外，通過親密接觸感染者，并可產(chǎn)生二代污染，二代病人出現(xiàn)的癥狀通常較輕，出血性腸炎的發(fā)病率很低。

2.2 感染機制與癥狀

腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是一類能侵染小腸上皮細胞的病原菌，能夠在細胞上定植和增殖，并產(chǎn)生腸毒素。腸毒素是由質(zhì)?；蛉旧w編碼的，具有熱敏感或熱不穩(wěn)定的特點［12］。腸道感染患者常伴有輕微或嚴重腹瀉，這類病原菌的感染對腸道的營養(yǎng)吸收、兒童的生長發(fā)育甚至于全球的死亡率都有著深遠的影響［13］。臨床上ETEC感染的癥狀通常為急性水樣腹瀉，有從溫和到嚴重多種程度。感染者也曾出現(xiàn)頭痛、發(fā)燒、惡心、嘔吐等癥狀。

腸侵襲性大腸桿菌（enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）是一類具有強致病毒力的病原菌，能夠感染較大兒童及成年人。常見的臨床癥狀主要是水樣腹瀉，少數(shù)人出現(xiàn)痢疾癥狀，通常是以食物或水源為媒介進行感染的，也可經(jīng)過親密接觸傳播產(chǎn)生散發(fā)病例［14］。

腸致病性大腸桿菌（enteropathic Escherichia coli，EPEC）是在小腸上段寄居繁殖的一類病原微生物，EPEC在1945年就被認定為致瀉大腸桿菌，主要引起嬰幼兒急性腹瀉或慢性腹瀉以及成人散發(fā)腹瀉。

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是一類毒力強、致病性高的病原菌，腸出血性大腸桿菌感染是一種人畜共患病，傳染源通常是帶菌者、感染病人及畜禽。其中牛的帶菌率最高，因此，牛肉、奶制品等動物來源食品通常是主要的污染源。畜禽的糞便同樣會對環(huán)境中的土壤和水源產(chǎn)生污染使其污染范圍更加廣泛。其主要臨床癥狀為右下腹劇烈疼痛、腹瀉、便血，并伴有低熱或不發(fā)熱，病程7-10 d，少數(shù)病人特別是幼兒及老人可并發(fā)溶血尿毒綜合征，病情較為嚴重［15］。

腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）是Nataro等于1987年首次從智利腹瀉兒童的糞便中分離出的一種大腸桿菌，其特點是在組織培養(yǎng)過程中能以特有的“聚集樣”或“磚堆樣”的方式黏附于組織培養(yǎng)的上皮細胞株HEp-2，后被命名為腸聚集性大腸桿菌（EAEC或EAggEC）。其在侵染時不侵入腸上皮細胞，不產(chǎn)生LT、ST或是VT毒素，臨床表現(xiàn)為急性、持續(xù)性腹瀉和腹瀉，含粘液的水樣分泌性腹瀉是其典型表現(xiàn)，部分病人伴有發(fā)熱、嘔吐、腹痛，1/3病人有便血癥狀［16］。

彌散黏附性大腸桿菌（dispersion adhesion Escherichia coli，DAEC）的感染病例較為少見，該菌曾引起墨西哥兒童腹瀉從而被分離發(fā)現(xiàn)。

2.3 防范措施

針對致病性大腸桿菌的污染情況以及感染途徑，國家應(yīng)加強對其監(jiān)測力度，掌握大腸桿菌的分布特征及疾病流行趨勢并建立早期預(yù)警機制，一旦發(fā)生疫情立即進行診斷并及時預(yù)警，而后進行嚴密監(jiān)測，及時防控，防止病情蔓延。中央還應(yīng)對地方進行統(tǒng)一應(yīng)急管理，疫情發(fā)生后及時向民眾通報實施狀況。有關(guān)部門還需加強對食品和水源的管理，并確保禽畜養(yǎng)殖場對污染物進行處理后排放。

個人也應(yīng)加強衛(wèi)生習慣以避免感染病原菌，應(yīng)保持雙手清潔，飲用煮沸的自來水，避免進食未經(jīng)徹底殺菌的帶菌率高的食物。體質(zhì)較弱者及外出旅游者應(yīng)補食乳酸菌，以細菌間的拮抗作用防止大腸桿菌的侵染。

3 大腸桿菌耐藥性的相關(guān)研究

3.1 耐藥性與菌株血清型

近年來的研究表明，血清型大腸桿菌已產(chǎn)生較高的耐藥性，且相對于其他血清型，O141含有更多的獨立因子。此外近些年研究結(jié)果表明O6、O8、 O18三種血清型的菌株普遍對氨芐西林產(chǎn)生較高抗性［17］，抗生素的濫用是細菌產(chǎn)生耐藥性主要原因。

3.2 耐藥性與毒力基因

相較于國內(nèi)，國外對于毒力基因與耐藥性有更多研究。Ojo等［18］針對O157、O26、O91、O103、O111、O128、O145這7種產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌（shiga toxin Escherichia coli，STEC）進行了一系列研究，結(jié)果表明STEC菌株攜帶的主要毒力基因為Stx1、Stx2、EaeA及HlyA。STEC菌株對氨芐西林、四環(huán)素、鏈霉素及氯霉素等耐藥率超過40%。Soufi等［19］以從突尼斯家禽肉中分離出來的166株大腸桿菌為研究對象，對其抗藥性表現(xiàn)和基因型及其耐磺胺基因的側(cè)翼區(qū)及整合子進行了研究分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對氨芐青霉素、鏈霉素、萘啶酸、磺胺類及四環(huán)素都具有較高抗性，而對慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸及頭孢西丁的抗性則不夠顯著，分析可知大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要為Bla（TEM）、Tet（A）/Tet（B）、Aph（3’）-Ia，Aac（6’）-Ib-cr、Aac（3）-II及CmlA。因此，大腸桿菌針對氨芐西林、四環(huán)素及鏈霉素表現(xiàn)出明顯的耐藥性。

3.3 耐藥性與動物來源

根據(jù)近年來報道，禽畜肉及奶制品成為主要污染源。Ewers等［20］對禽致病性大腸桿菌進行研究發(fā)現(xiàn)，從已爆發(fā)疾病的病雞體內(nèi)分離出的121株菌株、從健康雞糞便中分離出的211株以及從它們所生存的環(huán)境中分離的35株菌株中，有高達79.2%-89.3%的菌株存在耐藥性。de Jong和Bywater等［21］研究了從雞、豬、牛中分離的大腸桿菌對幾種新型抗生素（頭孢吡肟、頭孢噻肟和環(huán)丙沙星）的耐藥力，根據(jù)研究資料顯示，雖然大腸桿菌對這些新型抗生素表現(xiàn)出了較低的抗性，但從雞體內(nèi)分離出的大腸桿菌對這些新型抗生素已經(jīng)出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象。研究進一步表明，除歐洲國家外，相較于從牛源分離出的大腸桿菌，豬源、雞源分離出的通常具有更高的耐藥性及毒力基因。以上研究均說明不同動物來源的大腸桿菌有著不同的耐藥性。

4 風險毒力因子的研究

致病性大腸桿菌具有多種毒力因子，主要分為黏附素和毒素兩種類別。

4.1 黏附素和定植因子

黏附素是存在于細菌表面的某種特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或糖脂成分，存在于細菌的細胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等結(jié)構(gòu)中，能夠使細菌黏附到宿主靶細胞上，對細菌的定植起著重要的作用。黏附素又分為菌毛和非菌毛黏附物質(zhì)［22］。大腸桿菌的17種黏附素主要存在于腸致病性大腸桿菌、產(chǎn)Vero毒素大腸桿菌（verocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC）中，少數(shù)存在于腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）中，主要的寄主是人、牛、豬、兔等（表1）。對黏附素的研究在大腸桿菌的致病機制及診斷疫苗研制等方面具有重要意義。

表1 大腸桿菌的黏附素及寄主

4.1.1 菌毛黏附素 首次在豬和牛中分離出來的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了菌毛和菌毛黏附素，后來又在人源大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)［23］。最典型的是由腸致病性大腸桿菌（EPEC）產(chǎn)生的F4菌毛［26］。Devriendt等［27］通過研究發(fā)現(xiàn)F4菌毛是影響細菌黏附腸上皮細胞及影響腸上皮細胞分泌細胞因子（cytokine）的主要因素。已有研究表明腸上皮細胞通過分泌一些細胞因子調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，F(xiàn)4菌毛通過抑制IL-6和IL-8這兩種細胞因子的分泌使感染了產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的仔豬產(chǎn)生嚴重的腹瀉現(xiàn)象。

4.1.2 非菌毛黏附素 Duguid等于1995年發(fā)現(xiàn)無菌毛的大腸桿菌也能造成紅細胞的聚集，非菌毛黏附素（Afa）家族由這些導致紅細胞凝集的血凝素組成，編碼基因位于質(zhì)?；蛉旧w上［25］。Afa家族中的大腸桿菌可在Hep-2細胞、HeLa細胞或MDCK細胞周圍表現(xiàn)擴散粘連，這類大腸桿菌成為彌散黏附性大腸桿菌（DAEC），在這個家族中，還有一類大腸桿菌雖然不表現(xiàn)擴散粘連，但也可以聚集黏附到Hep-2細胞、HeLa細胞上，具有這些特點的大腸桿菌都叫做腸黏附性大腸桿菌（EAEC）［28，29］。

4.1.3 外膜蛋白 外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）是一種非常重要的蛋白質(zhì)，廣泛存在原核生物的細胞外膜和真核生物的細胞器外膜中。大腸桿菌的黏附素也能存在于外膜蛋白中，這種外膜蛋白能夠引發(fā)細菌與真核細胞之間的黏附。EPEC和VTEC兩種病原菌的質(zhì)粒能夠編碼不同特異性的外膜蛋白從而使人和豬受到彌散黏附感染［26］。

4.1.4 定植因子 定植因子（colonization factors，CFs）是一類異質(zhì)性蛋白質(zhì)樣的表面結(jié)構(gòu)，目前已發(fā)現(xiàn)至少25種定植因子，多數(shù)由質(zhì)粒編碼。最常見的定植因子是CFA/A，包括其在內(nèi)的已鑒別的定植因子中大多數(shù)被認為是糖蛋白偶聯(lián)物，除此之外仍有部分定植因子還未被鑒別［30］。

4.2 LEE毒力島及其主要編碼的致病基因

毒力島（pathogenicity islands）是編碼毒素、黏附素等一些毒力因子的毒力基因位于病原菌染色體上的特定區(qū)域［31］。EPEC的腸細胞脫落位點（LEE）毒力島包含了與黏附和脫落損傷（AE損傷）及一些其他毒力因子相關(guān)的所有編碼基因，主要編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)（ESC或SEP）、分泌型蛋白質(zhì)（ESP）及其分子伴侶、外膜蛋白緊密素（EAE）和緊密素易位受體（TIR）等［32］。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)是病菌分泌毒力蛋白或向宿主細胞注入毒力蛋白的通道，由多組分蛋白復合體形成，其一系列基因位于LEE的左側(cè)。位于LEE右側(cè)的Esps則編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)所要分泌的蛋白質(zhì)。外膜蛋白緊密素（EAE）所有能引起AE損傷的病原菌都可檢測到的基因，或可檢測到其同源序列，是引起AE損傷的主要基因。Tir基因位于Eae基因前方，編碼一種成為宿主與致病菌結(jié)合橋梁的蛋白，是重要的體內(nèi)致病因子。

4.3 毒素

病原微生物產(chǎn)生的毒素具有多種類型。有些病原菌可以產(chǎn)生寡肽毒素，寡肽素可黏附于胞質(zhì)膜受體上并激活胞內(nèi)聯(lián)級反應(yīng)，從而干擾真核細胞新陳代謝，大腸桿菌可產(chǎn)生的寡肽毒素主要是耐熱腸毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素。有些病原菌產(chǎn)生AB毒素，這種毒素以A亞基為毒力中心，B亞基則使該毒素與細胞膜上受體結(jié)合，兩個亞基共同組成AB毒素的編碼區(qū)域。有的產(chǎn)生一種細胞溶解素-RTX毒素，這種毒素可以使細胞質(zhì)膜產(chǎn)生縫隙，從而使得細胞溶解、死亡［33］。

5 國內(nèi)外大腸桿菌檢測方法的研究進展

5.1 大腸桿菌傳統(tǒng)檢測方法

根據(jù)食品安全國家標準（GB 4789.3-2010）規(guī)定，現(xiàn)行的大腸桿檢測方法主要有兩種，大腸菌群MPN計數(shù)法和大腸菌群平板計數(shù)法，也是最為傳統(tǒng)的檢測方法。在MPN檢測法中，首先根據(jù)待檢菌在LST肉湯管中是否產(chǎn)氣來進行初步判斷，不產(chǎn)氣則判斷為大腸桿菌陰性，產(chǎn)氣的進行BGLB肉湯培養(yǎng)，若在BGLB肉湯中培養(yǎng)仍產(chǎn)氣則報告為大腸桿菌陽性，否則報告為大腸桿菌陰性，最后通過查MPN表計數(shù)。平板計數(shù)法是將10倍系列稀釋的菌液接種VRBA平板，計數(shù)典型可疑菌落，并接種可疑菌落于BGLB肉湯中，報告實驗結(jié)果。具體實驗材料及步驟可參見《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》。

5.2 傳統(tǒng)檢測方法的劣勢及發(fā)展趨勢

傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測方法耗時較長且操作復雜，不適合進行食品檢疫等大批量樣品的檢測。醫(yī)療中，如果檢測時間過長也可能會導致診治的延遲。因此，多年來相關(guān)研究人員一直致力于研究快速、靈敏、特異的大腸桿菌檢測方法。

5.3 新型檢測方法

5.3.1 免疫學檢測技術(shù) 主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫層析技術(shù)、量子點熒光探針技術(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）是指利用抗原抗體能夠特異結(jié)合的特性，使之產(chǎn)生顏色反應(yīng)從而定性定量的進行分析。Ge等［34］建立了一種高靈敏度、高特異性的PCR-ELISA技術(shù)用于檢測大腸埃希氏菌O157∶H7以及其他產(chǎn)志賀毒素的食源性大腸桿菌。Galikowska等［35］利用噬菌體代替抗體，進行ELISA實驗用來檢測大腸桿菌O157∶H7，這種方法具有簡單、快速、經(jīng)濟等特點。

免疫層析技術(shù)是通過毛細管作用使抗原或抗體與已知抗原抗體的微孔濾膜載體相連接，通過標記物進行定性檢測，具有快速，適用范圍廣、穩(wěn)定易判斷等優(yōu)點，但靈敏度稍顯遜色。Park等［36］應(yīng)用免疫層析技術(shù)對大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌進行了檢測，其中大腸桿菌O157∶H7的檢測范圍是9.2×103-9.2×105CFU/mL。Yonekita等［37］開發(fā)了一款免疫層析試紙從115種肉制品中成功檢測出5株E.coli O26菌株，檢測范圍是2.2×103到1.0×105CFU/mL。Cui等［38］應(yīng)用膠體金免疫層析法結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)對大腸桿菌O157∶H7進行了快速檢測，該方法特異性強、靈敏度低，檢測限達10 CFU/g。

量子點熒光探針技術(shù)通過激發(fā)使量子點使其具有熒光特性，后與相關(guān)抗體結(jié)合形成熒光免疫復合物，從而通過復合物的熒光強度測定目標菌濃度。這種方法的優(yōu)勢在于效率高、穩(wěn)定性好且具有較高的靈敏度。Mitchell等［39］在免疫磁珠和DNA上修飾量子點，形成免疫磁珠-DNA-量子點復合物，對大腸桿菌O157∶H7的EaeA基因進行了特異性檢測，通過熒光檢測系統(tǒng)檢測反應(yīng)后體系的熒光強度的大小來判定樣品中含大腸桿菌量的多少，該方法最低檢測限為49×10-15mol/L。Sanvicens等［40］建立了一種量子點熒光抗體陣列檢測大腸桿菌O157∶H7，最低檢測限為10 CFU/mL，相較于傳統(tǒng)的ELISA方法，這種方法將檢測限提高了3個數(shù)量級。

5.3.2 分子生物學檢測技術(shù) 分子生物學檢測技術(shù)主要是建立在PCR基礎(chǔ)上衍生出來的檢測方法。包括常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、基因芯片及新型核酸擴增技術(shù)等。

5.3.2.1 PCR 常規(guī)PCR技術(shù)是在短時間內(nèi)對特定DNA序列進行大量體外擴增，后通過電泳技術(shù)完成特定序列的檢測。優(yōu)點是能夠快速進行微量的檢測，且具有較高的靈敏度，但是容易產(chǎn)生假陽性。Sangdee等［41］針對腸桿菌基因重復序列（ERIC）設(shè)計引物用于大腸桿菌的檢測。該方法具有良好的特異性，檢測限100 CFU/ mL。

5.3.2.2 定量PCR 實時熒光定量PCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種定量方法，通過在反應(yīng)體系中加入特定熒光物質(zhì)（熒光探針或核酸染料），對擴增產(chǎn)物進行跟蹤標記，也可進行實時監(jiān)控，最后根據(jù)標準曲線進行監(jiān)測分析。該方法優(yōu)勢在于靈敏度較高，操作簡單，實現(xiàn)靶物質(zhì)的定量分析。Wang等［42］針對大腸桿菌和志賀氏菌的Tuf基因設(shè)計特異性引物和探針實現(xiàn)了定量檢測，該方法操作簡便，短時間內(nèi)能從生牛奶中同時檢測出兩種目標致病菌，其中大腸桿菌在102CFU/mL-106CFU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。Kim等［43］針對大腸桿菌O157∶H7的EaeA基因設(shè)計了新引物和探針，實現(xiàn)了對鮮切卷心菜中的大腸桿菌O157∶H7的定量PCR檢測，檢測靈敏度提高兩個數(shù)量級至1.53 CFU/mL。Khatami等［44］開發(fā)了一種基于熒光PCR的特異性雜交方法（FLASH-PCR）檢測大腸桿菌O157∶H7中由STX編碼的Stx-1基因，實驗結(jié)果表明該方法與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果相符，與后者相比檢測過程更為快速、靈敏、簡單。

5.3.2.3 高通量PCR 高通量檢測技術(shù)是近幾年基于PCR技術(shù)發(fā)展起來的新技術(shù)，相比傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法，該方法解決了每次只能檢測一種或一類樣品的局限性，其具有反應(yīng)體系簡單、自動化操作程度較高、快速省時、無污染及診斷結(jié)果精確等特點。目前用于病原微生物鑒定的高通量檢測技術(shù)主要有：多重PCR技術(shù)、焦磷酸測序技術(shù)、二代測序、變性高效液相色譜分析技術(shù)和芯片技術(shù)等。

多重PCR是一種可以同時進行多個目標菌或基因檢測的技術(shù)，在反應(yīng)體系中同時加入多種特異性引物即可擴增出多種DNA片段。這種方法的優(yōu)點在于檢測速度快、特異性高及簡便高效。缺點在于反應(yīng)體系中各種引物容易相互干擾，產(chǎn)生競爭性抑制。Son等［45］針對產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的Stx1、Stx2、Eae、EhxA及UidA五種毒力基因建立了多重PCR檢測方法，該方法有效提高了檢測的準確性，對其毒力基因的分析更加便捷，同時設(shè)計探針實現(xiàn)定量檢測。Gordillo等［46］針對大腸桿菌O157∶H7的FliCh7和 RfbE基因構(gòu)建了引物和探針，建立了雙重定量PCR技術(shù)用于肉制品的檢測，檢測結(jié)果顯示本方法的準確度要優(yōu)于傳統(tǒng)方法，兩個基因的結(jié)果均具有良好的線性關(guān)系。

隨著大規(guī)?；蚪M學的興起，二代測序技術(shù)（新一代測序技術(shù)）也隨之產(chǎn)生。二代測序技術(shù)大多采用大型矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)，使用引物和DNA聚合酶或連接酶擴展延伸核酸鏈。這種方法通過連續(xù)記錄光信號周期來獲取序列信息，可用于大規(guī)模的測序。市場上已有多種測序儀，如Illumina公司的Genome Analyzer及HiSeq 2000 系統(tǒng)，ABI公司的AB SoLid sequencer等。隨著2008年Helicos Biosciences公司的第一臺DNA分子測序儀的問世，基因組學迎來了新的發(fā)展時期，同時也為微生物檢測提供給了新的途徑。焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術(shù)是在20世紀90年代年發(fā)明的DNA序列分析技術(shù)，這種技術(shù)是由酶級聯(lián)化學發(fā)光反應(yīng)發(fā)展出的，該反應(yīng)由4種酶（DNA聚合酶、三磷酸腺硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）催化的同一反應(yīng)體系產(chǎn)生。該技術(shù)是在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，當加入的這種dNTP能夠與模板進行配對時，聚合酶就會使其連接到引物鏈上，形成磷酸二酯鍵并釋放出等量的焦磷酸基團（PPi），通過檢測轉(zhuǎn)化為可見光信號的PPi量來確定參與反應(yīng)中的核苷酸數(shù)目［47］。

雖然第二代測序技術(shù)在全球測序市場上占有絕對優(yōu)勢，但新一代的測序技術(shù)又快速發(fā)展起來。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比最大的特點就是單分子測序，并且在測序過程不需要PCR擴增。SMRT技術(shù)以SMRT芯片為測序載體邊合成邊測序，通過堿基配對發(fā)出光的波長與峰值來判斷插入的堿基類型。SMRT技術(shù)的測序速度達到每秒約10個dNTP，最大的劣勢就是測序錯誤率比較高。納米單分子測序技術(shù)基于電信號的測序技術(shù)，DNA穿過特殊的納米孔時，通過監(jiān)測電荷變化從而鑒定所通過的堿基。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點而開發(fā)的，它最大的特點是單分子測序，且能避免由于PCR擴增造成的錯誤，極大的提高了測序長度，為微生物的測序分析提供了新的解決方法［48］。

變性高效液相色譜分析技術(shù)（denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC）是利用離子配對逆相層析的原理來分析核酸的檢測方法，這種方法利用離子配對試劑TEAA（triethylammonium acetate）在核酸非變性條件下與DNA的磷酸基團離子配對，帶正電的TEAA會將帶負電的核酸包裹，并以其非極性的烷基端吸附在非極性的固定相上，DNA因此滯留于分離管柱中。DHPLC系統(tǒng)對DNA片段的分離是基于其長度，而非序列，DNA鏈越長，所帶磷酸基團就越多，與之結(jié)合的TAEE就越多，其在柱內(nèi)保留的時間也就相應(yīng)增長。William等［49］通過不同譜系39種細菌進行DHPLC檢測，成功地把DHPLC技術(shù)應(yīng)用于細菌菌種的鑒定。

基因芯片技術(shù)是指將與熒光標記探針結(jié)合后的樣品PCR擴增產(chǎn)物與芯片上的寡核苷酸進行雜交，通過熒光強度及分布進行分析鑒定。Suo等［50］對基因芯片進行了優(yōu)化用于檢測食源性致病菌，并對26種鮮肉樣品進行了檢測。Kim等［51］對基因芯片技術(shù)進行了改進，使得檢出假陰性概率幾乎為零。

5.3.2.4 等溫PCR 等溫擴增技術(shù)的出現(xiàn)不僅使得反應(yīng)時間大大縮短，同時也簡化了操作過程中所使用的儀器，大大滿足了快速簡便的要求。目前，多種基于PCR的等溫擴增技術(shù)逐漸發(fā)展起來，如核酸序列依賴的擴增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA），高溫解旋酶依賴性擴增（thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA），鏈置換擴增（strand-displacement amplification，SDA）， 環(huán) 介 導 等 溫 擴 增（loopmediated isothermal amplification，LAMP），滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA），重組聚合酶擴增（recombinase polymerase reaction，RPA）恒溫和嵌合引物引發(fā)的核酸擴增（chimeric primerinitiated amplification of nucleic acids，ICAN）以及切刻內(nèi)切酶信號放大反應(yīng)（nicking endonuclease signal amplification，NESA）。這些技術(shù)在反應(yīng)速度、反應(yīng)溫度、工藝簡化、對DNA或RNA的特異性、對酶的依賴、檢測范圍、引物設(shè)計及成本等方面都有著自身的優(yōu)缺點［52］。

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是一種發(fā)展最為成熟的等溫核酸擴增技術(shù)，其反應(yīng)溫度為60-65℃，是DNA雙鏈復性和延伸的中間溫度，DNA在此溫度中處于一種單雙鏈的動態(tài)平衡。依據(jù)6個區(qū)域設(shè)計4條引物，實現(xiàn)循環(huán)擴增，具有高效的特異性和靈敏度［53］。Wang等［54］利用這種技術(shù)對生乳中的大腸桿菌O157進行了檢測，同時結(jié)合核酸染料實現(xiàn)活細胞的檢測，檢測靈敏度是 PCR 方法的 1 000 倍。Wang等［55］分別針對產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的Stx1、Stx2和Eae基因設(shè)計引物，利用LAMP 技術(shù)對萵苣、菠菜樣品中的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌進行了檢測，該方法的準確性和靈敏度與定量PCR方法幾乎一致，其顯示了在食品中大腸桿菌現(xiàn)場快速檢測方面良好的應(yīng)用前景。

5.3.2.5 ERIC-PCR 腸桿菌屬間的共有重復序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）是Sharples等［56］于1990年在大腸桿菌發(fā)現(xiàn)的一組序列，它具有一段保守性很高的反向重復序列，序列長約44 bp。雖然功能尚未研究清楚，但了解到其在基因組的分配比較均勻，且存在的位置和拷貝隨物種的不同而有差異。Versalovic［57］根據(jù)這一核心序列設(shè)計了反向引物，用于擴增ERIC兩端之間的片段，建立了ERIC-PCR技術(shù)。由于在不同種屬或同種不同菌株之間的拷貝數(shù)和定位都不同，通常被用于細菌基因組圖譜的研究，用于細菌的分類與鑒定。在應(yīng)用該方法的過程中發(fā)現(xiàn)，ERIC結(jié)果的帶型和條帶的強弱易受PCR的反應(yīng)參數(shù)和電泳條件的影響，因此有人建議將所有的樣本在相對集中的時間用同一條件進行分析，以保證其結(jié)果的可比性［58］。

5.3.3 死活菌檢測技術(shù) 傳統(tǒng)的死活菌檢測技術(shù)是根據(jù)每個活菌可以在平板上長出一個菌落來進行活菌計數(shù)的，但該方法局限于檢測能形成菌落的細菌，并且需要將菌液濃度稀釋到一定程度，因此，于PCR的新型死活菌檢測技術(shù)應(yīng)運而生。目前發(fā)展出的主要有RT-PCR、EMA-PCR和PMA-PCR。

RT-PCR是以細菌中適當?shù)膍RNA作為靶基因，由于細菌死亡過后mRNA會快速降解，不會像DNA一樣降解緩慢，所以運用 RT-PCR 技術(shù)只能檢測到具有活性的細菌，從而避免了假陽性的出現(xiàn)［59］。EMA-PCR是根據(jù)疊氮溴乙錠（ethidiummonoazide bromide，EMA）能夠選擇性地進入死細胞的細胞膜內(nèi)并與DNA發(fā)生不可逆的共價結(jié)合從而抑制DNA的PCR擴增，因此只有活菌能夠進行PCR擴增［60］。Shi等［61］對EMA的反應(yīng)條件進行了優(yōu)化，包括體系的溫度、pH、滲透壓，并記錄了EMA-qPCR 的檢測結(jié)果。當EMA染料進入死菌并與之核酸結(jié)合時，擴增反應(yīng)會被抑制。研究還發(fā)現(xiàn)光的存在可以推動EMA與DNA的結(jié)合。優(yōu)化后EMA的使用濃度為10 μg/mL，光照時間為20 min，加熱可以使不同狀態(tài)的細胞都能夠與EMA充分結(jié)合，對細胞進行85℃滅活35 min后，EMA-qPCR 即無法檢出活菌，說明了這種檢測方式的有效性。高滲透壓（≥4%）會對EMA-qPCR產(chǎn)生抑制，且滲透壓越高，抑制效果越明顯。當滲透壓達到8%時，EMA-qPCR擴增出的菌數(shù)量急劇減少。將細胞在不同的pH溶液中處理后再用EMA處理發(fā)現(xiàn)，pH從1升高到5時，其Ct值顯著增加，pH大于5以后無明顯變化，試驗中還發(fā)現(xiàn)pH為3時，細胞數(shù)量已經(jīng)開始下降。用LB培養(yǎng)基對已經(jīng)損傷酸化了的細胞進行40 min孵育，損傷的細胞即可復原且EMA不能進入到其內(nèi)部。PMA-PCR是對于EMA-PCR的一種改進方法，由于疊氮溴化乙錠（EMA）具有細胞毒性，使得EMAPCR應(yīng)用受限，因此，選用PMA來代替EMA進行死活菌檢測可以有效擴大其應(yīng)用范圍，如臨床醫(yī)學、食品安全等領(lǐng)域［62］。

5.3.4 其他新型檢測技術(shù)

5.3.4.1 紅外光譜技術(shù) 紅外光譜技術(shù)主要用于測定微生物的傅里葉變換紅外光譜來獲得微生物及其生物大分子結(jié)構(gòu)的信息，由此鑒定微生物種類及狀態(tài)。慈云祥等［63］利用紅外光譜技術(shù)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及谷氨酸菌進行了研究，大腸桿菌的實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)時間不同、微生物含量不同對FTIR圖譜沒有明顯影響，并且測定出大腸桿菌的吸收帶波數(shù)為1 080和1 238 cm-1。Siripatrawan等［64］利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學統(tǒng)計學方法定性、定量地對大腸桿菌ATCC25922及大腸桿菌K12兩種菌株進行了分析檢測。

5.3.4.2 生物傳感器技術(shù) 傳感器分為3種類型：物理傳感器、化學傳感器及生物傳感器。目前用于微生物快速檢測的傳感器技術(shù)主要有電化學傳感器、光學傳感器等。電化學傳感器是微生物利用低電導率的大分子物質(zhì)進行代謝，使其分解物帶有一定電荷，因此電導率發(fā)生變化，將電信號放大后記錄其變化即可對微生物量進行分析。此方法具有快速廉價等優(yōu)點。光學傳感器是利用微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使預(yù)先加入的指示劑變色，由光學檢測器檢測其顏色變化，找到突變點時間從而確定微生物的數(shù)量。

在各種類型的傳感器中，生物傳感器是最具優(yōu)勢的一類，它具有敏感性、專一性，可以進行實時測定，且具有時效性。生物傳感器可與納米材料結(jié)合，用于測定核酸、酶、抗體、噬菌體甚至整個細胞。一種具有高特異性和敏感性的RNA生物傳感器被構(gòu)建用于檢測具有活性的大腸桿菌，用mRNA（ClpB）基因構(gòu)造的基于NASBA的生物傳感器可用于對活性大腸桿菌進行定性和定量［65］。Varshney等［66］構(gòu)建了一種電阻生物傳感器，用于鑒定具有活性的大腸桿菌O157∶H7，如果細菌生長，就會監(jiān)測到有電阻產(chǎn)生。Chang 等［67］利用EMA構(gòu)造了一種微流控平臺，用于檢測區(qū)分有無活性的大腸桿菌，采用納米金探針對活性細胞進行探測，并使得具有生物活性的細胞得以擴增，這是第一次在同一微流控平臺上對活性細菌進行這兩項連續(xù)的操作。

側(cè)向?qū)游鰴z測（lateral flow testsL，F(xiàn)T）及其試紙條已經(jīng)成為實驗室的診斷工具，是一種基于紙張的生物傳感器，這種技術(shù)具有簡單、準確、快速、廉價的優(yōu)點，不需要專業(yè)的技術(shù)或復雜的儀器。這種試紙條通常被膠體金、乳膠、碳、磷、單鏈核酸等標記，最常見的是膠體金粒子試紙條。目前，LFT被認為具有高效檢測細菌的巨大潛力，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等都可以用這種試紙條進行快速檢測。

除了傳統(tǒng)的生物傳感器，一些新型的傳感器也被構(gòu)建出來用于檢測一些特定的細菌。Li等［68］構(gòu)建出了一種用于檢測大腸桿菌O157∶H7 的新型傳感器，這種傳感器采用了一種由二茂鐵與抗菌肽相組成的薄膜，其上的馬加寧抗菌肽為生物識別元件。Chan等［69］基于免疫傳感器研究出一種用于檢測大腸桿菌O157∶H7的生物功能磁珠，可用于在納米多孔氧化鋁膜上進行細菌細胞濃度的測定，這種傳感器具有高度的敏感性。

5.3.4.3 適配體 適配體是通過指數(shù)富集配體進化技術(shù)從體外篩選得到的一類單鏈寡核苷酸，能夠特異性的與靶分子結(jié)合并具有較高的親和性，是由Ellington和 Tuerk于1990年首次提出的［70-72］。適配體與靶分子的特異性結(jié)合基于其單鏈結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的多樣性，高親和性基于核酸分子間的堿基互補配對、靜電作用、氫鍵以及其自身的適應(yīng)性折疊。人們利用基于細胞層面的SELEX技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種僅結(jié)合于E. coli O157∶H7血清型菌株細胞表面的一種RNA適配體，該適配體還具有核酸酶抗性，這種在適配體可用于大腸桿菌O157∶H7菌株的特異性鑒別?；撴溓蚓⊿treptococcus pyogenes）是一類曾引起過許多嚴重臨床疾病的致病菌，是A型鏈球菌（group A Streptococcus，GAS）的一種，目前發(fā)現(xiàn)一種能夠選擇性識別10種主要A型鏈球菌的DNA適配體序列，可用于A型鏈球菌的特異性檢測。

6 展望

目前，國內(nèi)外大腸桿菌的疫情爆發(fā)依然時有發(fā)生，究其根本主要還是通過食物傳播。因此，大腸桿菌在分析、診斷、治療等各個方面均有待進一步的研究。隨著外界環(huán)境的影響，可能會引發(fā)大腸桿菌基因的變化，如基因突變、單核苷酸的多態(tài)性等，因此在今后的研究中，需要將研究重點向基因組、尤其是毒力基因的分析方面進行拓展，為大腸桿菌的風險評估提供更加可靠的理論基礎(chǔ)。隨著生物技術(shù)的大力發(fā)展，對于大腸桿菌的新型檢測方法不斷被開發(fā)應(yīng)用，但快速、特異、靈敏、高通量仍然是新型檢測方法開發(fā)需要繼續(xù)改進方向，迎合企業(yè)及政府等現(xiàn)場篩查檢測的需求。目前研究重點均是圍繞檢測技術(shù)展開，因此在今后的研究中，需要將重點向?qū)ふ倚碌囊志椒ㄟM行拓展，保證大腸桿菌的有效治療。

目前大量抗生素的使用使病原菌變得更加耐藥，為了防止動物感染病原菌，飼料中添加的大量抗生素最終使食用這些動物的人類產(chǎn)生耐藥性，針對此應(yīng)加強對病原菌的監(jiān)控以及抗生素類用藥的管理。此外，對于大腸桿菌新毒力因子的挖掘以及風險評估研究也應(yīng)繼續(xù)拓寬、深入，掌握致病機理能夠方便人們針對不同的致病原因?qū)で蟾佑行е委煼桨浮?/p>

［1］Rodríguez-Angeles G. Principal characteristics and diagnosis of the pathogenic groups of Escherichia coli［J］. Salud Publica de Mexico, 2001, 44（5）：464-475.

［2］Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype［J］. New England Journal of Medicine, 1983, 308（12）：681-685.

［3］王燕, 謝貴林, 杜琳. 大腸桿菌O157∶H7感染流行概況［J］.微生物學免疫學進展, 2008, 1：51-58.

［4］汪華, 景懷琦, 李紅衛(wèi), 等. 江蘇省淮北地區(qū)腸出血性大腸埃希菌O157：H7感染性腹瀉并發(fā)急性腎衰的研究［J］. 中華流行病學雜志, 2004, 11：24-26.

［5］徐進, 龐璐. 食品安全微生物學指示菌國內(nèi)外標準應(yīng)用的比較分析［J］. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2011, 5：472-477.

［6］黃介枚. 國外大腸桿菌O157感染的爆發(fā)流行近況與防治策略［J］. 廣東衛(wèi)生防疫, 1997, 1：89-92.

［7］張?zhí)蚁? 中國東部地帶性土壤中大腸桿菌O157：H7存活和吸附機制的研究［D］. 杭州：浙江大學, 2014.

［8］Gagliardi JV, Karns JS. Leaching of Escherichia coli O157：H7 in diverse soils under various agricultural management practices［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66（3）：877-883.

［9］周淑玉, 王俊起, 王京京. 北京污灌區(qū)土壤的細菌污染及其存活時間的實驗研究［J］. 衛(wèi)生研究, 1987, 2：17-20.

［10］朱奇, 陳彥, 許偉. 聊城市春季蔬菓生物污染的初步調(diào)查［J］.山東師大學報：自然科學版, 2000, 15（2）：186-189.

［11］葉小梅, 常志州, 陳欣, 等. 畜禽養(yǎng)殖場排放物病原微生物危險性調(diào)查［J］. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報, 2007, 2：66-70.

［12］蔣磊, 周明旭, 夏芃芃, 等. 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的分子致病機制［J］. 中國獸醫(yī)學報, 2014, 9：1551-1560.

［13］Petri WA, Miller M, Binder HJ, et al. Enteric infections, diarrhea, and their impact on function and development［J］. The Journal of Clinical Investigation, 2008, 118（4）：1277-1290.

［14］Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL, et al. Pathogenic Escherichia coli［J］. Nature Reviews Microbiology, 2004, 22：123-140.

［15］朱蓓. 腸出血性大腸桿菌感染的流行病學及臨床醫(yī)學資料概述［J］. 解放軍預(yù)防醫(yī)學雜志, 2011, 4：309-311.

［16］李惠民, 駱金芝. 腸聚集性大腸桿菌腹瀉的研究進展［J］. 國外醫(yī)學（兒科學分冊）, 2000, 4：207-209.

［17］安微, 張秀英, 李蕊, 等. 致病性大腸桿菌毒力因子和耐藥性研究進展［J］. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 8：106-110.

［18］Ojo OE, Ajuwape ATP, Otesile EB, et al. Potentially zoonotic shiga toxin-producing Escherichia coli serogroups in the faeces and meat of food-producing animals in Ibadan, Nigeria［J］. International Journal of Food Microbiology, 2010, 142（1）：214-221.

［19］Soufi L, Sáenz Y, Vinué L, et al. Escherichia coli of poultry food origin as reservoir of sulphonamide resistance genes and integrons［J］. International Journal of Food Microbiology, 2010, 144（3）：497-502.

［20］Ewers C, Ant?o EM, Diehl I, et al. Intestine and environment of the chicken as reservoirs for extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains with zoonotic potential［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75（1）：184-192.

［21］de Jong A, Bywater R, Butty P, et al. A pan-European survey of antimicrobial susceptibility towards human-use antimicrobial drugs among zoonotic and commensal enteric bacteria isolated from healthy food-producing animals［J］. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2009, 63（4）：733-744.

［22］嚴亞賢, 華修國. 大腸桿菌O157和其它產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的毒力因子-黏附素［J］. 中國預(yù)防獸醫(yī)學報, 2002, 6：81-84.

［23］Gyles CL, Fairbrother JM. Pathogenesis of bacterial infections in animals［M］. USA：Wiley-Blackwell, 2010.

［24］Bianchi ATJ, Scholten JW, Van ZAM, et al. Parenteral vaccination of mice and piglets with F4+ Escherichia coli suppresses the enteric anti-F4 response upon oral infection［J］. Vaccine, 1996, 14（3）：199-206.

［25］ Harrington SM, Dudley EG, Nataro JP. Pathogenesis of enteroaggregative Escherichia coli infection［J］. FEMS Microbiology Letters, 2006, 254（1）：12-18.

［26］Bardiau M, Szalo M, Mainil JG. Initial adherence of EPEC, EHEC and VTEC to host cells［J］. Veterinary Research, 2010, 41（5）：57.

［27］Devriendt B, Stuyven E, Verdonck F, et al. Enterotoxigenic Escherichia coli（K88）induce prionflammatory responses in porcine intestinal epithelial cells［J］. Developmental and Comparative Immunology, 2010, 34（11）：1175-1182.

［28］Piérard D, De GH, Haesebrouck F, et al. O157：H7 and O104： H4 Vero/Shiga toxin-producing Escherichia coli outbreaks：respective role of cattle and humans［J］. Veterinary Research, 2012, 43（1）：1.

［29］Scheutz F, Nielsen EM, Frimodt MJ, et al. Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104：H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011［J］. Euro Surveill, 2011, 16（24）：19889.

［30］Jansson L, Tobias J, Lebens M, et al. The major subunit, CfaB, of colonization factor antigen i from enterotoxigenic Escherichia coli is a glycosphingolipid binding protein［J］. Infection and Immunity, 2006, 74（6）：3488-3497.

［31］Hacker J, Blum-Oehler G, Mühldorfer I, et al. Pathogenicity islands of virulent bacteria：structure, function and impact on microbial evolution［J］. Molecular Microbiology, 1997, 23（6）：1089-1097.

［32］McDaniel TK, Jarvis KG, Donnenberg MS, et al. A genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92（5）：1664-1668.

［33］Marchès O, Nougayrède JP, Boullier S, et al. Role of tir and intimin in the virulence of rabbit enteropathogenic Escherichia coli serotype O103：H2［J］. Infection and Immunity, 2000, 68（4）：2171-2182.

［34］Ge B, Zhao S, Hall R, et al. A PCR-ELISA for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli［J］. Microbes and Infection, 2002, 4（3）：285-290.

［35］Galikowska E, Kunikowska D, Tokarska-Pietrzak E, et al. Specific detection of Salmonella enterica and Escherichia coli strains by using ELISA with bacteriophages as recognition agents［J］. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 2011, 30（9）：1067-1073.

［36］Park J, Park S, Kim YK. Multiplex detection of pathogens using an immunochromatographic assay strip［J］. BioChip Journal, 2010, 4（4）：305-312.

［37］ Yonekita T, Fujimura T, Morishita N, et al. Simple, rapid, and reliable detection of Escherichia coli O26 using immunochromatography［J］. Journal of Food Protection, 2013, 76（5）：748-754.

［38］Xi C, Xiong QR, Xiong YH, et al. Establishing of a method combined immunomagnetic separation with colloidal gold lateralflow assay and its application in rapid detection of Escherichia coli O157：H7［J］. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41（12）：1812-1816.

［39］Mitchell KA, Chua B, Son A. Development of first generation insitu pathogen detection system（Gen1-IPDS）based on NanoGene assay for near real time E. coli O157∶H7 detection［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 54：229-236.

［40］Sanvicens N, Pascual N, Fernández-Argüelles MT, et al. Quantum dot-based array for sensitive detection of Escherichia coli［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2011, 399（8）：2755-2762.

［41］Sangdee A, Natphosuk S, Srisathan A, et al. Development of SCAR primers based on a repetitive DNA fingerprint for Escherichia coli detection［J］. Journal of Microbiology, 2013, 51（1）：31-35.

［42］Wang Y, Zhao P, Zhang H, et al. A simple and rapid real-time PCR assay for the detection of Shigella and Escherichia coli species in raw milk［J］. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 2013, 8（4）：313-319.

［43］Kim YJ, Kim JG, Oh SW. Rapid detection of Escherichia coli O157∶H7 in fresh-cut cabbage by real-time polymerase chain reaction［J］. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2011, 54（2）：264-268.

［44］Khatami F, Heidari M, Khatami M. Rapid Detection of Escherichia coli O157∶H7 by Fluorescent Amplification-Based Specific Hybridization（FLASH）PCR［J］. Iranian Red Crescent Medical Journal, 2012, 14（9）：594.

［45］Son I, Binet R, Maounounen LA, et al. Detection of five Shiga toxinproducing Escherichia coli genes with multiplex PCR［J］. Food Microbiology, 2014, 40：31-40.

［46］Gordillo R, Rodríguez A, Werning ML, et al. Quantification of viable Escherichia coli O157∶H7 in meat products by duplex realtime PCR assays［J］. Meat Science, 2014, 96（2）：964-970.

［47］Ronaghi M, Uhlen M, Nyren P. A sequencing method based on realtimepyrophosphate［J］. Science, 1998, 281（5375）：363-365.

［48］張得芳, 馬秋月, 尹佟明, 等. 第三代測序技術(shù)及其應(yīng)用［J］.中國生物工程雜志, 2013, 33（5）：125-131.

［49］William H, Dadid S, Eerik H, et al. Denaturing HPLC for identifyingbacteria［J］. Bio Techniques, 2002, 33（8）：386-391.

［50］Suo B, He Y, Irwin P, et al. Optimization and application of a custom microarray for the detection and genotyping of E. coli O157：H7 in fresh meat samples［J］. Food Analytical Methods, 2013, 6（5）：1477-1484.

［51］Kim H, Kane MD, Kim S, et al. A molecular beacon DNA microarray system for rapid detection of E. coli O157∶H7 that eliminates the risk of a false negative signal［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 22（6）：1041-1047.

［52］Huang S, Xu Y, Yan X, et al. Development and application of a quantitative loop-mediated isothermal amplification method for detecting genetically modified maize MON863［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2015, 95（2）：253-259.

［53］馮瑜菲. 豬水腫病大腸桿菌毒力因子雞卵黃抗體制備及 Stx2基因 LAMP方法建立［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學, 2011.

［54］Wang DG, Huo GC. Rapid detection viable Escherichia Coli O157 in raw milk using Loop-Mediated Isothermal Amplification with aid of ethidiu monoazide［J］. Advanced Materials Research， 2012, 343：1217-1221.

［55］Wang F, Yang Q, Qu Y, et al. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification suite for the rapid, reliable, and robust detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli in produce［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80（8）：2516-2525.

［56］Sharples G J, Lloyd RG. A novel repeated sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes［J］. Nucleic Acids Reserch, 1990, 18（22）：6503-6508.

［57］Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes［J］. Nucleic Acids Reserch, 1991, 19（24）：6823-6831.

［58］陳玉婷, 程楠, 許文濤. 食源性致病微生物的檢測新技術(shù)［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報, 2015, 9：3405-3413.

［59］Takayama K, Kjelleberg SA. The role of RNA stability during bacterial stress responses and starvation［J］. Environ Microbiol, 2000, 2（4）：355-365

［60］Nogva HK, Dr?mtorp SM, Nissen H, et al. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5-nuclease PCR［J］. Biotechniques, 2003, 34（4）：804-808.

［61］Shi H, Xu W, Luo Y, et al. The effect of various environmental factors on the ethidium monazite and quantitative PCR method to detect viable bacteria［J］. Journal of Applied Microbiology,2011, 111（5）：1194-1204.

［62］于小龍, 徐進, 張昊, 等. PMA-PCR方法快速檢測VBNC狀態(tài)青枯菌［J］. 植物保護, 2016, 1：144-149.

［63］慈云祥, 臧凱賽, 高體玉. 幾種微生物的紅外光譜研究［J］.高等學?；瘜W學報, 2002, 23（6）：1047-1049.

［64］Siripatrawan U, Makino Y, Kawagoe Y, et al. Near infrared spectroscopy integrated with chemometrics for rapid detection of E. coli ATCC 25922 and E. coli K12［J］. Sensors and Actuators B：Chemical, 2010, 148（2）：366-370.

［65］Baeumner AJ, Cohen RN, Miksic V, et al. RNA biosensor for the rapid detection of viable Escherichia coli in drinking water［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18（4）：405-413.

［66］Varshney M, Li Y. Double interdigitated array microelectrodebased impedance biosensor for detection of viable Escherichia coli O157：H7 in growth medium［J］. Talanta, 2008, 74（4）：518-525.

［67］Chang WH, Wang CH, Lin CL, et al. Rapid detection and typing of live bacteria from human joint fluid samples by utilizing an integrated microfluidic system［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 66：148-154.

［68］Li Y, Afrasiabi R, Fathi F, et al. Impedance based detection of pathogenic E. coli O157∶H7 using a ferrocene-antimicrobial peptide modified biosensor［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 58：193-199.

［69］Chan KY, Ye WW, Zhang Y, et al. Ultrasensitive detection of E. coli O157∶H7 with biofunctional magnetic bead concentration via nanoporous membrane based electrochemical immunosensor［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 41：532-537.

［70］Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands［J］. Nature, 1990, 346（6287）：818-822.

［71］ Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase［J］. Science, 1990, 249（4968）：505-510.

［72］Jayasena SD. Aptamers：an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics［J］. Clinical Chemistry, 1999, 45（9）：1628-1650.

（責任編輯 狄艷紅）

Current Situation Analysis and Detection Techniques of Pathogenic Escherichia coli

WEI Yu-jun1WANG Zi-ting1XU Yuan-cong1，2XU Wen-tao1，2
（1.College of Food Science & Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. The Supervision，Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms，Ministry of Agriculture of P. R. China，Beijing 100083）

Pathogenic Escherichia coli is one of the most common pathogenic microorganisms. This kind of pathogen spreads through a variety of ways and its infection has caused many food safety accidents in the world. Though the emergence of its antibacterial resistance has raised concern，it also facilitates institutions and researchers to design new bacteriostatic methods. As direct pathogenic factor，E. coli risk virulence factor has drawn much attention by researchers. Also the technology of detecting E. coli developed rapidly too. Compared to traditional methods，advanced detection techniques for pathogens are fast，specific and accurate in determination of the pathogen. Based on the research status in domestic and abroad，this article introduces the research progress on assessments of E. coli virulence and techniques of detecting E. coli from several aspects such as the situation of E. coli’s contamination，infection route，symptoms，antibacterial resistance and its risk virulence factors，as well as detection techniques.

pathogenic E.coli；current situation analysis；detection techniques

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.011

2016-08-25

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）（2012AA101606），北京市科技新星計劃（XX2014B069）

衛(wèi)昱君，女，本科；E-mail：weiyj95@foxmail.com

許文濤，男，副教授，博士生導師，研究方向：食品病原微生物的檢測技術(shù)和致毒機制、轉(zhuǎn)基因生物檢測和食用安全性評價等；E-mail：xuwentaoboy@sina.com